إعداد Lysate مجمع صفائح الدم البشرية (pHPL) باعتبارها الملحق لمصل فعال خالية من الإنسان الحيوان الثقافات الخلايا الجذعية

يوضح هذا البروتوكول عملية تحضير تجمع كبير من محلول تحلل الصفائح الدموية البشرية، بدءاً من البلازما الغنية بالصفائح الدموية. ومن خلال إجراء دورة واحدة من التجميد والإذابة، يتم تحلل الصفائح الدموية. بعد ذلك، يتم تجميع ما لا يقل عن 10 وحدات من محلول تحلل الصفائح الدموية البشرية في دفعة واحدة من محلول تحلل الصفائح الدموية البشرية المجمع أو PHPL.

يتم تقسيم هذا الحجم البالغ حوالي ثلاثة لترات إلى حصص صغيرة ويُجمد مرة أخرى لاستنفاد شظايا الصفائح الدموية. تُذاب هذه الحصص وتُنقل إلى قنينات ثم تُفصل بجهاز الطرد المركزي. ويمثل الطافي مادة PHPL المستنفدة من شظايا الصفائح الدموية، والتي تحتوي على عوامل نمو مشتقة من الصفائح الدموية تُستخدم لتدعيم المزارع الخلوية.

يتم التخلص من الراسب المتبقي من شظايا الصفائح الدموية. مرحباً، أنا كادينا شارمو من مختبر الدكتور TRO في وحدة أبحاث الخلايا الجذعية بجامعة جرادز الطبية. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحضير تجمع من عزلات الصفائح الدموية البشرية.

سنبدأ باستخدام بلازما غنية بالصفائح الدموية، حيث سنقوم بإجراء عدة دورات من التجميد والإذابة، ثم نستنزف شظايا الصفائح الدموية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للحصول على مكمل كافٍ للمزارع الخلوية كبديل لمصل العجل الجنيني. لذا، فلنبدأ.

يبدأ هذا البروتوكول باستخدام البلازما الغنية بالصفائح الدموية، والتي تُعرف اختصاراً بـ PRP. قد يتم تحضير هذه البلازما عن طريق فصادة الخلايا (Cy Apheresis) أو استخلاصها من طبقة الخلايا البيضاء (Buffy coats). ويجب على الأشخاص من خارج مجال طب نقل الدم شراء PRP من بنك دم محلي أو أي مزود معتمد آخر.

تحقق من عقم وحدة PRP عن طريق نقل 20 milliliters من كل وحدة إلى كيس صغير متصل، ثم فصل الكيس باستخدام آلة اللحام. يمكن إرسال هذه العينة إلى مختبر الميكروبيولوجيا لإجراء اختبار العقم فور التحضير. ومن المهم تجميد وحدات PRP عند درجة حرارة لا تقل عن -20 °C في كيس التخزين الأصلي.

بمجرد ظهور نتائج سلبية في الاختبارات البكتيرية، يمكن تنفيذ الخطوة التالية. مع الحرص على عدم ارتفاع درجة حرارة محلول تحلل الصفائح الدموية البشرية، والذي يُشار إليه الآن باسم HPL بشكل مفرط، توضع وحدات HPL في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C حتى تختفي التكتلات الجليدية. يجب تحلل الصفائح الدموية بعد خطوة التجميد والإذابة هذه لإعداد منتج معياري لكل مجمع من محلول تحلل الصفائح الدموية.

اجمع من 10 إلى 15 وحدة من PRP المذابة. قم بتوصيل كل كيس HPL متتالٍ بكيس التجميع المزدوج، ثم انقل HPL إلى هذين الكيسين. افصل أكياس HPL الفارغة باستخدام جهاز اللحام.

امزج محتويات الكيسين للحصول على حجم نهائي يتراوح بين ثلاثة إلى أربعة لترات من ناتج تحلل الصفائح الدموية البشرية المجمعة، والذي سيُشار إليه الآن باسم PHPL. قم بتوصيل كيس صغير واستخلص عينة بحجم 20 milliliter من PHPL للتحقق من عقامة المنتج المجمع.

قم بتقسيم عينات من PHPL لمزيد من المعالجة عن طريق توصيل أكياس صغيرة بكيس التجميع المزدوج. انقل أحجاماً تبلغ حوالي 250 milliliters إلى أكياس التخزين الصغيرة، ثم افصل الأكياس المملوءة باستخدام جهاز اللحام. قم الآن بإجراء دورة تجميد وإذابة إضافية لزيادة معدل تفتت الصفائح الدموية وكمية عوامل النمو المتحررة.

قم بذلك عن طريق تجميد الأكياس الصغيرة من PHBL المقسمة عند درجة حرارة -20 °C. ثم قم بإذابة الأكياس في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C، وذلك داخل غطاء التدفق الصفائحي.

استخدم مقصاً معقماً لقص وفتح أنبوب كل كيس، ثم صب PHPL في قوارير سعة 50 milliliter. غالباً ما تميل شظايا الصفائح الدموية إلى تجميع الصفائح وقد تؤدي أيضاً إلى تحريض الاستمناع الخيفي. ولتجنب هذه الحالات، قم بإزالة الشظايا من PHPL عن طريق الطرد المركزي عند 4, 000 GS لمدة 15 minutes في جهاز طرد مركزي مبرد.

بعد ذلك، انقل الجزء العلوي من البلازما باستخدام الماصة إلى ملفات التخزين النهائية وتخلص من رواسب الصفائح الدموية لتجنب وجود شظايا في مستنبتات الخلايا. قم بتقسيم PHPL إلى حصص حجم كل منها 50 milliliter وجمدها مرة أخرى عند درجة حرارة minus 20 degrees حتى وقت الاستخدام. والآن، بعد تحضير PHPL المستنفد من شظايا الصفائح الدموية، يمكن تحليل خصائص المستخلص.

يتم اختبار وظيفة وجودة ليزات الصفائح الدموية المجمعة في المزارع الخلوية، وقد ثبت ذلك من خلال التحفيز الفعال لتكاثر الخلايا، وإكثار الخلايا الجذعية الميزنشيمية أو MSCs والخلايا المكونة للمستعمرات البطانية E CFCs بنجاح باستخدام PHPL الخالي من شظايا الصفائح الدموية. يرجى الاطلاع على البروتوكول المكتوب الخاص بنا لمعرفة وصفات الأوساط هنا. تطبيقان لليزات الصفائح الدموية البشرية المجمعة.

يظهر في استنبات الخلايا السدوية الميزنشيمية خلايا MSCs من المتبرع الأول تم استنباتها إما باستخدام PHPL أو PHPL منقّى من شظايا الصفائحات. وكما هو موضح، يظهر هنا تلوث أكبر بالشظايا عند مقارنتها بـ PHPL المنقّى من الشظايا وحده. ولا تدعم شظايا الصفائحات نمو خلايا MSCs بشكل كافٍ.

تم التقاط الصور الثلاث بعد 13 يوماً من الزراعة. وقد تمت زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) من المتبرع الثاني لمدة تسعة أيام في PHPL منزوع الشظايا الصفيحية بدلاً من البلازما الغنية بالصفيحات. لاحظ أن البلازما الغنية بالصفيحات (PRP) بدون تحلل الصفيحات لا تدعم نمو الخلايا الجذعية الوسيطة بشكل كافٍ.

يرجى أيضاً الاطلاع على بروتوكول JoVE الذي أعده Andreas Reish، والذي يصف استخدام PHPL منزوع الشظايا لعزل واستزراع الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) المشتقة من دم الحبل السري البشري. لقد شرحنا لكم للتو كيفية تحضير PHPL لاستبدال المصل الحيواني بالكامل في مزارع الخلايا الجذعية الخاصة بكم. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إزالة شظايا الصفائح الدموية قبل إضافة الهيبارين وPHPL إلى وسط الاستزراع.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.