إعداد Lysate مجمع صفائح الدم البشرية (pHPL) باعتبارها الملحق لمصل فعال خالية من الإنسان الحيوان الثقافات الخلايا الجذعية

يقدم هذا البروتوكول عملية تحضير مجمع كبير من تحلل صفائح الدم البشرية، بدءاً من البلازما الغنية بالصفائح الدموية. يتم تحلل الصفائح الدموية عن طريق إجراء دورة واحدة من التجميد والإذابة. بعد ذلك، يتم تجميع ما لا يقل عن 10 وحدات من تحلل صفائح الدم البشرية في دفعة واحدة من تحلل صفائح الدم البشرية المجمعة أو PHPL.

يتم تقسيم هذا الحجم، البالغ حوالي ثلاثة لترات، إلى حصص صغيرة وتجميدها مرة أخرى لاستنزاف شظايا الصفائح الدموية. ثم تُذاب هذه الحصص وتُنقل إلى قوارير وتُفصل باستخدام جهاز الطرد المركزي. ويكون السائل الطافي هو PHPL المستنزف من شظايا الصفائح الدموية، والذي يحتوي على عوامل نمو مشتقة من الصفائح الدموية تُستخدم لتدعيم المزارع الخلوية.

يتم التخلص من الراسب المتبقي من شظايا الصفائح الدموية. مرحباً، أنا كادينا شارمو من مختبر الدكتور TRO في وحدة أبحاث الخلايا الجذعية في الجامعة الطبية في Grads. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحضير مجموعة من عزلات الصفائح الدموية البشرية.

سنبدأ باستخدام بلازما غنية بالصفائح الدموية، حيث يتم إجراء عدة دورات من التجميد والإذابة، ثم يتم استنزاف شظايا الصفائح الدموية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للحصول على مكمل كافٍ للمزارع الخلوية كبديل لمصل الجنين البقري. لذا، فلنبدأ.

يبدأ هذا البروتوكول باستخدام البلازما الغنية بالصفائح الدموية، والتي يُرمز لها بـ PRP. قد تكون هذه البلازما قد تم تحضيرها عن طريق فصادة الخلايا (Cy Apheresis) أو استُخلصت من الطبقات البيضاء (Buffy coats). ويجب على الأشخاص من خارج مجال طب نقل الدم شراء PRP من بنك دم محلي أو أي مزود معتمد آخر.

تحقق من عقامة وحدة PRP عن طريق نقل 20 milliliters من كل وحدة إلى كيس صغير متصل، ثم افصل الكيس باستخدام آلة اللحام. يمكن إرسال هذه العينة إلى مختبر الأحياء الدقيقة لاختبار العقامة فور التحضير. ومن المهم تجميد وحدات PRP عند درجة حرارة لا تقل عن minus 20 degrees في كيس التخزين الأصلي.

بمجرد ظهور نتائج سلبية للاختبارات البكتيرية، يمكن تنفيذ الخطوة التالية. مع الحرص على عدم ارتفاع درجة حرارة محلول تحلل الصفائح الدموية البشرية، والذي يُشار إليه الآن باسم HPL، بشكل مفرط، يتم وضع وحدات HPL في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تختفي التكتلات الجليدية. يجب تحلل الصفائح الدموية بعد خطوة التجميد والإذابة هذه لتحضير منتج معياري لكل تجمع من محلولات تحلل الصفائح الدموية.

اجمع من 10 إلى 15 وحدة من PRP المذابة. قم بتوصيل كل كيس HPL متتالٍ بكيس التجميع المزدوج، ثم انقل HPL إلى هذين الكيسين. افصل أكياس HPL الفارغة باستخدام آلة لحام الأكياس.

امزج محتويات الكيسين للحصول على حجم نهائي يتراوح من 3 إلى 4 لترات من ناتِج تحلل الصفائح الدموية البشرية المجمعة. ويُشار إليه الآن باسم PHPL. قم بتوصيل كيس صغير واسحب عينة بحجم 20 milliliter من PHPL للتحقق من عقامة المنتج المجمع.

قم بتقسيم عينات PHPL إلى أجزاء للمعالجة اللاحقة عن طريق توصيل أكياس صغيرة بكيس التجميع المزدوج. انقل أحجاماً تبلغ حوالي 250 milliliters إلى أكياس التخزين الصغيرة، ثم افصل الأكياس المملوءة باستخدام جهاز اللحام. قم الآن بإجراء دورة تجميد وإذابة إضافية لزيادة معدل تفتت الصفائح الدموية وكمية عوامل النمو المتحررة.

يتم القيام بذلك عن طريق تجميد الأكياس الصغيرة من PHBL المجزأة عند -20 °C. ثم إذابة الأكياس في حمام مائي عند 37 °C، وذلك داخل خزانة التدفق الصفائحي.

استخدم مقصاً معقماً لقص وفتح أنبوب كل كيس، ثم صب PHPL في قوارير سعة 50 milliliter. غالباً ما تميل شظايا الصفائح الدموية إلى تجميع الصفائح وقد تؤدي أيضاً إلى إثارة الاستمناع الخيفيّ. ولتجنب هذه الحالات، قم بإزالة الشظايا من PHPL عن طريق الطرد المركزي بسرعة 4,000 GS لمدة 15 minutes في جهاز طرد مركزي مبرد.

بعد ذلك، انقل المادة الطافية من البلازما باستخدام الماصة إلى ملفات التخزين النهائية، وتخلص من رواسب الصفائح الدموية لتجنب وجود شظايا في مزارع الخلايا. قم بتجميد حصص سعة 50 milliliter من PHPL مرة أخرى عند درجة حرارة minus 20 degrees حتى وقت الاستخدام. والآن بعد تحضير PHPL المنقاة من شظايا الصفائح الدموية، يمكن تحليل خصائص المستخلص.

يتم اختبار وظيفة وجودة نضحي الصفائح الدموية المجمع في المزارع الخلوية، وقد ثبت ذلك من خلال التحفيز الفعال لتكاثر الخلايا، وانتشار الخلايا الجذعية الميزنكيمية أو MSCs والخلايا المكونة للمستعمرات البطانية، E CFCs بنجاح باستخدام PHPL المنقّى من شظايا الصفائح الدموية. يرجى الاطلاع على البروتوكول المكتوب الخاص بنا لمعرفة وصفات الأوساط هنا. تطبيقان لنضحي الصفائح الدموية البشرية المجمع.

في زراعة الخلايا السدوية الميزنشيمية، تظهر الخلايا السدوية الميزنشيمية من المتبرع الأول والتي تمت زراعتها إما باستخدام PHPL أو PHPL منزوع شظايا الصفائح الدموية. وكما هو موضح، يظهر هنا تلوث أكبر بالشظايا عند المقارنة مع PHPL المنزوع الشظايا وحده. ولا تدعم شظايا الصفائح الدموية نمو الخلايا السدوية الميزنشيمية بشكل كافٍ.

تم التقاط الصور الثلاث جميعها بعد 13 يوماً من الزرع. وقد تم زرع الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) من المتبرع الثاني لمدة تسعة أيام في سائل PHPL المستنفد من شظايا الصفائح الدموية بدلاً من البلازما الغنية بالصفائح الدموية. يُلاحظ أن البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) بدون تحلل الصفائح لا تدعم نمو الخلايا الجذعية الميزنكيمية بشكل كافٍ.

يرجى أيضاً الاطلاع على بروتوكول JoVE الذي أعده Andreas Reish، والذي يصف استخدام PHPL المنقّى من الشظايا لعزل واستزراع الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) المشتقة من دم الحبل السري البشري. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير PHPL لاستبدال المصل الحيواني بالكامل في مستنبتات الخلايا الجذعية الخاصة بكم. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إزالة شظايا الصفائح الدموية قبل إضافة الهيبارين وPHPL إلى وسط الاستزراع.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.