العزلة والحيوان التوسع الحرة المصل الحبل السري الإنسان المستمدة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCS) وغشائي خلايا مستعمرة السلف التشكيل (ECFCs)

هذا البروتوكول وصف العزلة والتوسع اللاحق في خلايا انسجة وخلايا اللحمة المتوسطة مستعمرة البطانية التي تشكل من دون استخدام الحيوان مصل لتوليد أزواج ذاتي لأغراض زراعة تجريبية.

الحبل السري البشري هو مصدر يسهل الوصول إليه للخلايا السلفية. في هذه المقالة ، نصف بروتوكولا للعزل والتوسع اللاحق للأسلاف البطانية e مركبات الكربون الكلورية فلورية ، وهي مجموعة سكانية فرعية من الخلايا داخل جدار الوعاء الدموي والخلايا السلفية الوسيطة. الخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من حبل سري بشري واحد.

أولا باستخدام المقص طوليا ، قم بقطع الوريد السري البشري وكشط الخلايا من سطح الوعاء الداخلي. انقل الخلايا من الكاشطة إلى قارورة وانتظر نمو المستعمرة. ستظهر بعض الخلايا المكشطة نمطا ظاهريا للسلف وسوف تتكاثر بكثافة لتشكيل مستعمرات كبيرة.

بمجرد تكاثر هذه الخلايا ، يمكن توسيع مركبات الكربون الكلورية فلورية الإلكترونية في قوارير جديدة. لمزيد من التحليل ، يمكن أيضا عزل مجموعة الخلايا الوسيطة من الحبل السري البشري. قطع أجزاء من الحبل إلى قطع صغيرة ونقلها إلى لوحة ثقافة معقمة.

بعد بضعة أيام ، سيكون نمو الخلايا اللحمية مرئيا حول قطع أنسجة الحبل السري بين الأوعية الدموية. انقل هذه الخلايا إلى قوارير جديدة وقم بتوسيعها لمزيد من التحليل. يسمح لك هذا البروتوكول بالحصول على نوعين من سلالات الخلايا السلفية من سلك مادة أولية واحد في غضون ثلاثة إلى أربعة أسابيع.

مرحبا ، أنا أندرياس دانيش من مختبر الدكتور تي سترونج في وحدة أبحاث الخلايا الجذعية في جامعة الدراسات العليا الطبية في النمسا. سنعرض لك اليوم إجراء لعزل وتوسيع وتحليل خلايا القناة الوسيطة والبطانية البشرية من شفرة سرية واحدة. ملاحظة واحدة فقط حول المصطلحات.

تسمى خلايانا الخلايا اللحمية متعددة القدرات ، أو الخلايا اللحمية الوسيطة ، أو MSEs والقولون البطاني الذي يشكل الخلايا الاحترافية أو الخلايا الجذعية الدماغية الإلكترونية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة وظيفة الخلية السلفية غير الدموية والبيولوجيا. لذلك دعونا نبدأ.

قبل خطوات عزل الخلايا ، امسح غطاء مزرعة الأنسجة ذات التدفق الصفحي باستخدام الأنادين واجمع ألواح زراعة الخلايا المعقمة. قوارير زراعة الخلايا ، والأدوات الجراحية المعقمة PBS ، وكاشطات الخلايا ، وحامل أنبوب ، أليفة شريطية سعة 25 مليلتر ، وحقنة سعة خمسة مليلتر مزودة بإبرة نهاية حادة. تذكر أن تدفئ وسط زراعة خليتين alpha MEM و EGM في حمام مائي بزاوية 37 درجة.

الآن انقل الحبل السري إلى التدفق الرقائقي واغسله مرتين في PBS. لإزالة الدم الملوث ، استخدم حقنة معقمة سعة خمسة ملليلتر لقنية وريد الحبل السري على جانب واحد. الآن شطف الوريد السري مع PBS حتى يتدفق السائل.

يصبح الطرف الآخر من الحبل شفافا تماما بدون صبغة حمراء. ابدأ في عزل الخلايا السلفية لتشكيل مستعمرة بطانية عن طريق ملء قارورة مساحتها 75 سم مربع ب 15 إلى 20 مل من EGM الدافئة اثنين من المتوسطين. ضع الحبل في صفيحة جديدة مملوءة ب PBS المعقم واستخدم مقصا جراحيا لتقطيع الحبل إلى قطعتين يبلغ طول كل منهما حوالي خمسة سنتيمترات.

الآن أدخل شفرة واحدة من المقص الجراحي واقطع الوريد طوليا. في هذه المرحلة ، يمكن للمساعد استخدام الملقط لتثبيت الوريد أثناء إجراء المزيد من التخفيضات. ضع الحبل مع الوريد المفتوح في طبق جديد.

بدون PBS ، استخدم مكشطة الخلية لفرك السطح الداخلي للوريد على مساحة لا تقل عن سنتيمتر واحد. اغسل الكاشطة في EGM اثنين من الوسطين لتحرير خلايا الأوعية الدموية المفروكة في القارورة. يجب تكرار هذا الإجراء حتى 10 مرات.

أغلق القارورة وضعها في حاضنة على 37 درجة ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، و 95٪ رطوبة. الآن بعد أن تم عزل مركبات الكربون الكلورية فلورية الإلكترونية ، دعنا ننتقل إلى MSCs. الآن بعد أن تم كشط الطبقة البطانية ، استخدم مشرطا معقما لتقطيع الحبل إلى قطع صغيرة جدا.

من ملليمتر إلى ملليمترين. أقصى استخدام ملقط معقم لنقل هذه القطع إلى لوحة ثقافة مسبقة العلامة. اترك الطبق مفتوحا لمدة خمس دقائق على الأقل قبل ملئه بوسط للسماح للقطع بالالتصاق بالسطح البلاستيكي.

باستخدام أقل سرعة ممكنة ، أضف برفق 30 إلى 35 مل من MEM المعدلة ألفا قبل التدفئة. أغلق الطبق وضعه في حاضنة على درجة حرارة 37 درجة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. سيستغرق نمو الخلايا اللحمية الوسيطة من قطع الحبل السري من ثلاثة إلى سبعة أيام وبعد ذلك يمكن توسيع الخلايا.

وفي الوقت نفسه ، يمكن توسيع ECFC ، والتي ستظهر لك في الخطوة التالية. في اليوم التالي ، استخدم مجهرا مقلوبا لفحص الخلايا. إذا تم إجراء الكشط بشكل صحيح ، فستكون مجموعات الخلايا المتكاثرة الأولى مرئية تماما.

استبدل وسيطين E GM لإزالة جميع الخلايا والجسيمات غير المرفقة. استمر في توسيع الخلايا وتبادل ثلث الوسيط مرتين في الأسبوع. بعد 10 إلى 12 يوما ، ستلاحظ بانتظام مستعمرات بطانية كبيرة جدا.

الآن ، قم بإزالة الوسيط واغسله باستخدام PBS للتخلص من استخدام البروتين المتبقي. 0.05٪ تريبسين 0.7 مللي مولار EDTA لفصل الخلايا. عند نقل الخلايا إلى أوعية استزراع جديدة ، تأكد من اختيار قوارير ذات حجم مناسب لتحقيق كثافة بذر منخفضة.

سيساعد هذا في مزيد من التوسع. عادة ما ينحسر مختبرنا ذرية من أكثر من 20 مستعمرة كبيرة إلى أربع قوارير مساحتها مائتان وخمسة وعشرون سنتيمترا مربعا. لا تنس استبدال ثلث الوسيط مرتين في الأسبوع.

يتم إستخدام بروتوكول مماثل لتوسيع MSC في القسم التالي. بمجرد مرور ثلاثة إلى سبعة أيام ، استخدم مجهرا مقلوبا للتحقق من ظهور خلايا على شكل مغزل بالقرب من الأنسجة المرفقة. عندما يكون هناك نمو كاف للخلايا ، تميل القطع إلى الالتصاق لأنها تفقد الاتصال بالبلاستيك.

بعد 10 إلى 12 يوما ، قم بإزالة قطع المناديل. افصل الخلايا الجذعية الجذعية عن البلاستيك باستخدام محلول التربسين EDTA ونقل الخلايا إلى قوارير ثقافة متوسطة جديدة مملوءة مسبقا بالحجم والعدد المناسبين لضمان انخفاض كثافة البذر أثناء تمدد الخلية. سيكون من الضروري استبدال ثلث الوسط مرتين في الأسبوع بمجرد توسيع كلا النوعين من الخلايا.

يمكن إجراء التلوين متبوعا بقياس التدفق الخلوي للكشف عن تعبير علامة سطح الخلية الذي يدل على الأنماط الظاهرية للسلف وتحديد عدم وجود تلوث بالخلايا المكونة للدم. قم بزرع مركبات الكربون الكلورية فلورية النقية المحصودة بكثافة طلاء منخفضة جدا تبلغ ثلاث أو 10 خلايا لكل سنتيمتر مربع في ألواح زراعة الخلايا لضمان نمو مستعمرة واحدة تبادل ثلث الوسط مرتين في الأسبوع بعد 14 يوما. نهاية الثقافة.

إزالة الوسط. اغسل مرتين باستخدام PBS وقم بإصلاح المستعمرات بمحلول تثبيت مثلج لمدة 15 دقيقة في الثلاجة ، تخلص من محلول التثبيت واترك الأطباق مفتوحة لتجف لمدة 10 دقائق. أعد ترطيب الخلايا بالماء المقطر لمدة 10 دقائق.

أضف محلول Harris Hematin وصمة عار المستعمرات الثابتة لمدة 12 دقيقة. قم بإزالة محلول الهيماتين وشطف الأطباق بماء الصنبور. للتخلص من محلول التلوين المتبقي.

التقط صورا لكل مستعمرة باستخدام مجهر استريو وقم باستيراد ملفات بتنسيق jpeg أو TIFF إلى جهاز الكمبيوتر الخاص بك. افتح الصور باستخدام برنامج الصورة J وحلل رقم الخلية الدقيق لكل مستعمرة كما هو موضح في الرسوم المتحركة التالية. افتح برنامج الصورة J واستورد صورة مستعمرة باستخدام وظيفة فتح الملف في القائمة المنسدلة.

تابع باستخدام العملية. طرح وظيفة الخلفية. استخدم وظيفة تحديد الفرشاة أو الإهليلجية في قائمة الصورة J لتمييز هامش المستعمرة.

امسح الصورة المحيطة باستخدام وظيفة تحرير Clear external واقتصاص الصورة عن طريق تحديد اقتصاص الصورة. اضبط العتبة يدويا باستخدام وظيفة عتبة ضبط الصورة بحيث يتم تلوين جميع الخلايا بالكامل. أحمر. احسب رقم خلية المستعمرة عن طريق التحديد.

تحليل وتحليل الجسيمات. اختر الإعدادات المناسبة المحسنة لكل نوع خلية وحدد موافق إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. يسمح هذا البروتوكول بعزل مجموعة نقية تقريبا من الخلايا التي تشترك في خصائص الخلايا السلفية البطانية والوسيطة البشرية ، والتي تكون ذاتية التكوين لبعضها البعض لأنها مشتقة من نفس الحبل.

ابتداء من اليوم الخامس ، ستظهر خلايا اللحمة المتوسطة على شكل مغزل من أسفل قطعة الحبل المتصلة بلوحة الثقافة. بعد يوم إلى يومين ، ستصبح المجموعات الأولى من المستعمرة البطانية التي تشكل خلايا سلفية أو مركبات الكربون الكلورية فلورية الإلكترونية مرئية تحت المجهر المقلوب. تشكلت هذه المستعمرة الضخمة سريعة النمو من مركبات الكربون الكلورية فلورية الإلكترونية بعد 11 يوما.

ويمكن تمرير كل من الخلايا الجذعية الجذعية ومركبات الكربون الكلورية فلورية E وتوسيع نطاقها. نوصي بإجراء تحليل لاحق لجميع منتجات الاستزراع باستخدام قياس التدفق الخلوي لتأكيد النمط الظاهري المناسب. يرجى تذكر أن كلا من السلالات البطانية واللحمة المتوسطة تتفاعل مع الأجسام المضادة الخاصة ب CD 73 و CD 1 46 و CD 29 و CD 1 0 5.

لاحظ أن الخلايا الجذعية الجذعية عبرت عن الفخذ الأول ، والذي تم اكتشافه باستخدام جسم مضاد مضاد ل CD 90. تعتبر مركبات الكربون الكلورية فلورية E إيجابية ل CD 31 ، والذي يسمى أيضا جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية أو PCAM. من الثابت أن تعبير التفاعل المناعي CD 34 في الحبل بواسطة مركبات الكربون الكلورية فلورية E يمكن تقليله من خلال الزراعة المتكررة.

ظلت علامات خلايا الدم مثل CD 45 و H-L-A-D-R و CD 14 سلبية لكلا النوعين من الخلايا. يمكن تقييم التسلسل الهرمي للخلايا السلفية بين مركبات الكربون الكلورية فلورية E باستخدام برنامج Image J عن طريق حساب أرقام الخلايا الدقيقة لكل مستعمرة على حدة. لقد أوضحنا لك للتو كيفية عزل وتوسيع وتحليل الصولجانات و ECEs من شفرة سرية بشرية عند القيام بهذا الإجراء.

من المهم العمل في ظروف معقمة والتحقق من النمط الظاهري والنقاء قبل استخدام الخلايا في الدراسات اللاحقة. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.