تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

في هذه التقنية ، يتم تشغيل زلات الغطاء الزجاجي بمزيج من جزيئات ربط البيوتين الخاملة والبيوتين. يتم إنشاء خلية تدفق مع هذا السطح الوظيفي وتوضع على مجهر العشب. يتم إرفاق قوالب دوائر الدرفلة الحيوية بالسطح باستخدام الستربتافيدين متعدد التكافؤ.

عندما يتم تكرار الركائز عن طريق إضافة بروتينات منطقة repli والنيوكليوتيدات ، يتم تمديد الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل الناتج بتدفق رقائقي ويتم تصويره في الوقت الفعلي باستخدام صبغة متداخلة. مرحبا ، أنا ناثان تانر من مختبر أنطوان فان إيان في قسم الكيمياء البيولوجية وعلم الأدوية الجزيئية في كلية الطب بجامعة هارفارد. أنا جو لارو أيضا من مختبر فان نويان.

سنعرض لك اليوم إجراء للتصوير الفلوري لتكرار الحمض النووي في الوقت الفعلي على مستوى الجزيء الفردي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة أنشطة تخليق الحمض النووي المنسقة لمجمعات النسخ المتماثل الفردية. لذلك دعونا نبدأ.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإزالة الذيل الحيوي إلى الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل M 13 عن طريق إضافة عشرة أضعاف زائدة من oligo في تسخين TBS العازلة إلى 65 درجة مئوية ، ثم إيقاف تشغيل الكتلة الحرارية للسماح بالتبريد البطيء بتنظيف البرايمر بشكل صحيح. الآن بعد أن أصبح العدد الأول M 13 جاهزا ، أضفه إلى خليط من 64 نانومولار T سبعة بوليميراز DNA و T سبعة مخزن مؤقت للنسخ المتماثل يحتوي على D NDPs وكلوريد المغنيسيوم واحتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بإخمادها باستخدام 100 مللي مولار EDTA.

بعد ذلك ، قم بتنقية الحمض النووي المملوء للمنتج باستخدام الفينول ، والكحول ، والكلوروفورم ، والاستخراج وغسيل الكلى في المخزن المؤقت TE أو أي مخزن مؤقت مناسب آخر ، واستخرج كل مرحلة عضوية لاستعادة أي بقايا معبأة. M 13 بعد غسيل الكلى يحدد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن أن يؤدي تكرار واحد لإعداد القالب إلى تركيز نانو مولار كاف للقالب لمئات إلى آلاف تجارب الجزيء الفردي.

الآن بعد أن أصبح الحمض النووي جاهزا ، انتقل إلى إعداد زلات الغطاء الوظيفية. يتم إرفاق الحمض النووي المراد تكراره بزلات الغطاء الزجاجي التي تعمل مع Amil Lane ، وترتبط مجموعة Oxy من Amil بالزجاج تاركة أمينا متاحا لربط جزيئات الربط الحيوية. يساعد هذا الطلاء على تقليل الارتباط غير المحدد بالسطح.

لتنظيف زلات الغطاء الزجاجي تماما ، ضعها في برطمانات تلطيخ واملأ البرطمانات بسونيكات الإيثانول. لمدة 30 دقيقة ، اشطف البرطمانات واملأها بهيدروكسيد البوتاسيوم المولي Sonicate لمدة 30 دقيقة وكرر كلا الغسيلتين. بالنسبة لتفاعل الوظيفية الأول ، يجب إزالة جميع آثار الماء.

املأ برطمانات التلوين بالأسيتون والسونيكات لمدة 10 دقائق. أفرغي البرطمانات واملأها مرة أخرى بالأسيتون. استمر في إضافة الكاشف الجيبي إلى البرطمانات وحركها لمدة دقيقتين.

ثم قم بإخمادها بكمية كبيرة من الماء. ثم جفف زلات الغطاء عن طريق خبزها على حرارة 110 درجة مئوية في الفرن لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط PEG بحوالي 0.2٪ من الوزن لكل حجم عند الوتد المدخل ، بما في ذلك فاصل انزلاق الغطاء الزجاجي سيسمح بفصل زلات الغطاء ، وماصة 100 ميكرولتر على زلة غطاء منعزلة جافة.

ضع زلة غطاء ثانية في الأعلى. احتضان زلات الغطاء في محلول PEG لمدة ثلاث ساعات. ثم افصل كل زوج من زلات الغطاء واغسلها على نطاق واسع بالماء.

احرص على إبقاء زلات الغطاء تعمل لأعلى حيث سيتم طلاء جانب واحد فقط بالوتد. أخيرا ، جفف زلات الغطاء بالهواء المضغوط وقم بتخزينها تحت الفراغ في مجفف ، وتظل الأسطح مستقرة لمدة شهر على الأقل. لذلك يمكن عمل العشرات من قسائم الغطاء دفعة واحدة واستخدامها حسب الحاجة.

الآن بعد أن أصبحت زلات الغطاء جاهزة ، يمكن للمرء تجميع غرفة التدفق لتجربة الجزيء الفردي. ابدأ بوضع 20 إلى 25 مل من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على BSA في مجفف لإزالة أي فقاعات هواء للخطوات اللاحقة. بعد ذلك ، قم بتخفيف 25 ميكرولترا من الستربتافيدين في 100 ميكرولتر من PBS وانشر المحلول على سطح الوتد الوظيفي احتضان زلة الغطاء لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للستربتافيدين بالارتباط بالبيوتين السطحي أثناء تحضير أجزاء أخرى من الغرفة.

أثناء احتضان زلة الغطاء ، قم بقص قطعة من الشريط على الوجهين مع دعم على كلا الجانبين بحيث تتناسب مع حجم شريحة الكوارتز المستخدمة لتجميع غرفة التدفق. ضع علامة على موضع فتحات الأنابيب على الشريط بقلم رصاص بحيث يمكن رسم مخطط لغرفة التدفق على الشريط. بعد وضع علامة على الثقوب ، قم بعمل مستطيل بعرض ملليمترين حول العلامات.

سيكون هذا المستطيل بمثابة قناة التدفق ، لذا تأكد من عمل جوانب مستقيمة وترك مساحة حول مدخل ومخرج الأنبوب. الآن قم بقص الشريط المحدد على طول المخطط المرسوم ، وقم بعمل قطع نظيفة مستقيمة للتأكد من عدم بروز أي مادة لاصقة في القناة. قم بتنظيف شريحة الكوارتز جيدا باستخدام الأسيتون لإزالة المادة اللاصقة من بنية خلايا التدفق المستخدمة في التجارب السابقة.

ابحث عن أفضل محاذاة لمخطط القناة. قم بإزالة جانب واحد من الدعامة اللاصقة وضع الشريط بعناية على شريحة الملعب. احرص على محاذاة الشريط بشكل صحيح حيث يجب أن تظل فتحات المدخل والمخرج غير مسدودة.

بعد ذلك ، قم بإعداد أطوال قطع الأنبوب بطول 0.76 ملم لمدخل ومخرج خلية التدفق. يساعد على قطع نهاية الأنبوب بزاوية 30 درجة تقريبا حتى لا يضغط الأنبوب بشكل مسطح على قاع الغرفة. قم بتعليق الأنبوب على رفوف أنبوب الاختبار لسهولة التثبيت بخلية التدفق في الخطوات التالية.

الآن تم الانتهاء من حضانة زلة الغطاء. اشطف الغطاء المطلي ب ENC العقدي ، وانزلق جيدا بالماء وجففه باستخدام الهواء المضغوط. احرص على عدم قلب زلة الغطاء حيث يعمل جانب واحد فقط.

أخيرا ، أكمل تجميع غرفة التدفق عن طريق إزالة الجانب الآخر من دعامة الشريط ووضع شريحة الكوارتز على زلة الغطاء. اضغط برفق على زلة الغطاء لدفع أي هواء محاصر في المادة اللاصقة. سيساعد ذلك في منع دخول أي فقاعات هواء إلى قناة التدفق.

ختم جوانب الغرفة بالإيبوكسي. أدخل الأنبوب المقطوع في فتحات الكوارتز وأغلقه في مكانه بالإيبوكسي واتركه يجف لبضع دقائق. عندما يجف ختم الايبوكسي ، ابدأ في سد السطح.

باستخدام إبرة قياس 21. اسحب بعضا من المخزن المؤقت الذي يحجب Degas من خلال أحد الأنابيب. اشطفها عدة مرات لإزالة فقاعات الهواء والسماح للغرفة بالتحضين لمدة نصف ساعة على الأقل قبل الانتقال إلى تكرار الجزيء الفردي. التجربه.

الآن بعد أن تم حظر خلية التدفق ، ضعها على مرحلة المجهر. أمسك الغرفة في مكانها باستخدام مشابك المسرح وتأكد من محاذاة قناة التدفق على طول المحور y. قم بتوصيل أنبوب مخرج خلية التدفق بمضخة الحقنة باستخدام أنبوب موصل بقطر أكبر.

ضع المدخل في المخزن المؤقت المانع واسحب المحقنة للخلف لإزالة أي هواء في الأنبوب. سيساعد النقر اللطيف لأنبوب المخرج على إزالة أي فقاعات هواء محاصرة في خلية التدفق. أضف الآن الحمض النووي ، وقم بتخفيف قالب الحمض النووي للمخزون إلى 25 بيكومولار في مليلتر واحد من منع التدفق العازل إلى الغرفة بمعدل تدفق معتدل مثل 0.025 مل في الدقيقة لمدة 30 دقيقة للسماح بتغطية سطح جيدة للحمض النووي.

بمجرد دخول الحمض النووي إلى الغرفة ، اغسل الحمض النووي الزائد باستخدام الغسيل العازل لمنع 200 حجم خلية تدفق على الأقل. للتخلص من كل الحمض النووي المجاني ، قم بتشغيل الليزر والكاميرا. يحتاج CCD المبرد إلى الوصول إلى درجة الحرارة قبل استخدامه.

بعد غسل الحمض النووي الزائد وتفريغ المخزن المؤقت للنسخ المتماثل ، قم بإعداد مزيج تفاعل النسخ المتماثل النيوكليوتيدات DTT والسيتوكسين في المخزن المؤقت للنسخ المتماثل. ثم أضيفي البروتينات واخلطيها برفق. ثم قم بتدفق خليط التفاعل إلى خلية التدفق.

يجب أن تكون سرعة التدفق هنا كافية لتمديد الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بعرض ملليمترين. قناة تدفق بطول 100 ميكرومتر 0.04 ملليلتر في الدقيقة تعمل بشكل جيد. اترك وقتا لدخول الخليط إلى الغرفة حوالي 10 دقائق.

انقل مجال الرؤية إلى جانب القناة وركز على المادة اللاصقة للتأكد من أن المرء قريب من السطح للتركيز وبدء التصوير. ضبط تركيز مجهر طاقة الليزر وزاوية العشب. حافظ على الطاقة منخفضة لتجنب أي انقسام ضوئي للحمض النووي الملطخ.

احصل على إطار واحد إلى خمسة إطارات في الثانية لعدة دقائق اعتمادا على معدل تكرار الحمض النووي. كرر ذلك للحصول على مسارات أطول للنسخ المتماثل أو الانتقال إلى حقل جديد لرؤية المزيد من الجزيئات عندما يتم ضخ كل خليط التفاعل تقريبا في تدفق الخلية في مزيد من المخزن المؤقت مع cyt لرؤية مجالات الرؤية الأخرى. يوفر التقاط صور متعددة لجزيئات مختلفة مكررة إحصائيات لتحديد الإنتاجية.

في الدائرة المتداولة. يمتد تخليق القوة الرائدة في اختبار النسخ المتماثل الذيل الذي يربط الدائرة والسطح ، ويتم تحويل الذيل إلى حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل بواسطة البوليميراز الخيط المتأخر ويمتد بواسطة التدفق الصفحي الموضح. فيما يلي مثال على مجال الرؤية مع cyt orange عند إثارة 532 نانومتر.

البقع الفلورية الصغيرة عبارة عن ركائز مربوطة غير مكررة. لاحظ الطول الأقصى للمنتجات والعدد الكبير من المنتجات لكل حقل. سيظهر مجال الرؤية النموذجي العديد من الجزيئات المتماثلة المرئية كخطوط ساطعة متزايدة من تجارب الحمض النووي القولوني الملطخة عند 37 درجة مئوية تعطي خمسة إلى 50 جزيئا لكل حقل اعتمادا على كثافة السطح.

منطقة T السبعة repla بشكل أكثر كفاءة وستكرر أكثر من 50٪ من الجزيئات في الحقل. مع هذه الكثافة العالية ، من الصعب حل الجزيئات الفردية كما هو موضح هنا. لذا قم بإجراء تجربة T سبعة بتركيزات أقل من البروتين أو كثافة السطح ، والرسوم البيانية للرنين لجزيئات التكرار النموذجية من e coli و T سبع تجارب تتضمن مسارات نقطة النهاية للجزيئات من e coli و T سبعة مرسومة مقابل الوقت الذي تم فيه تجهيز المسارات بانحدار خطي للحصول على معدلات النسخ المتماثل ، والتي في هذا المثال هي 467.1 زوجا أساسيا في الثانية للإشريكية القولونية و 99.4 زوجا أساسيا في الثانية.

بالنسبة إلى T سبعة ، فإن توزيعات معدل مسارات الجزيء الفردي تتناسب مع الغوسيين الفرديين تعطي متوسطا 535.5 زائد أو ناقص 39 زوجا أساسيا في الثانية للإشريكية القولونية و 75.9 زائد أو ناقص 4.8 زوجا أساسيا في الثانية. بالنسبة إلى T سبعة ، تتناسب توزيعات الطول لمنتجات النسخ المتماثل مع الاضمحلال الأسي الفردي للحصول على الإنتاجية ، وهو 85.3 زائد أو ناقص 6.1 أزواج كيلو قاعدة للإشريكية القولونية و 25.3 زائد أو ناقص 1.7 كيلو أزواج قاعدة ل G سبعة. ثم أوضحنا لك للتو كيفية قياس تكرار الحمض النووي المنسق باستخدام جزيئات مفردة.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تشغيل زلات الغطاء بشكل صحيح وإنشاء قنوات تدفق مستقيمة نظيفة. تأكد من الحفاظ على حمل طاقة الليزر وتقليل الانقسام الضوئي للحمض النووي الطويل. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.