نوفمبر 5, 2009
نابذة فائقة السرعة وتحليلية (AUC) خلية العينة يحمل عينة والعازلة المرجعية وخلال التجارب ، ويتعرضون للفراغ وسرعات عالية تصل إلى الدوار 60000 دورة في الدقيقة. وهذا الفيديو يظهر انتباه دقيق إلى التفاصيل اللازمة لتحميل والتجمع ومواءمة هذا العنصر مهم جدا من تجربة الجامعة الأمريكية بالقاهرة.
مرحبا ، أنا أندريا بالبو. أعمل في مجموعة بيتر شوكس في المعاهد الوطنية للصحة. في هذا الفيديو، سنوضح لك إجراءاتنا الخاصة بالتجميع والتحميل ومحاذاة الدوار لخلية عينة تحليلية من أجهزة الطرد المركزي الفائقة.
هيا بنا نبدأ. جمع. فيما يلي مكونات خلية عينة الطرد المركزي التحليلية المكدسة داخل مبيت الخلية عبارة عن حقل فحم مزدوج القطاع مقاس 12 ملم ، وهو قطعة مركزية من epon سيتم وضعها بين مجموعتين من النافذة. تتكون كل مجموعة نافذة من حشية نافذة وبطانة نافذة ونافذة مثبتة داخل حامل النافذة.
سيتم بعد ذلك تحريك هذه القطع داخل مبيت الخلية عن طريق محاذاة مفاتيحها مع المفتاح الموجود داخل برميل السكن ، وحشية الإسكان ، ثم أغلقت الحلقة اللولبية خلية العينة بضغط عزم دوران يتراوح بين 120 و 140 بوصة رطلا. بعد تحميل عينتك في المرجع ، تقوم حشيتا سدادة الإسكان وقابس السكن بإغلاق فتحات تحميل الخلية لتجنب مسح القطع الأثرية والتسريبات والكسر أثناء التجارب ، من الضروري أن تكون جميع المكونات نظيفة وجافة وخالية من الغبار وفي أفضل حالة ممكنة ، فحصها كثيرا ، واستبدالها عند الضرورة. ستحتاج أيضا إلى ما يلي، جهاز طرد مركزي تحليلي فائق، دوار من التيتانيوم رباعي الفتحات، ميزان مختبر، مفتاح عزم دوران مع قرص قابل للقراءة وحامل عزم الدوران، أوزان موازنة وموازنة وموازنة وموازنة مفك براغي مسطح الرأس وزوج من الملقط وجهاز ماصة سعة 200 ميكرولتر مزود بطرف ماصة مدبب طويل، أدوات محاذاة وزيوت تشحيم بطبقة الدوران.
نبدأ بناء عينة من الخلايا عن طريق تجميع مجموعتين من النافذة. ضع أولا حشية النافذة في الجزء السفلي من حامل النافذة. بعد ذلك ، ضع بطانة النافذة ، أو في بعض الأحيان تسمى وسادة النافذة داخل حامل النافذة بحيث تكون فتحة البطانة مقابل مجرى مفتاح الحامل بزاوية طفيفة.
ثم ضع النافذة في الحامل ، وقم بمحاذاة علامة الكاتب على النافذة مع مفتاح حامل النافذة. اضغط برفق على الحواف على جانبي النافذة. لضمان الختم المناسب والتدوير الدقيق لخلية العينة ، نقوم بتغطية حشية السكن برفق في الحلقة اللولبية.
باستخدام زيوت التشحيم ذات المعطف الدوار ، وزعي كمية صغيرة جدا من طبقة الدوران بين الإبهام والسبابة. قم بتغطية خيوط الحلقة اللولبية بفيلم رفيع وغير مرئي من معطف الدوران. وبالمثل ، قم بتغطية حشية الإسكان.
امسح أي مواد تشحيم مرئية. لبدء تجميع خلية العينة. حرك مجموعة نافذة واحدة بحيث تكون النافذة متجهة نحوك لأعلى في مبيت الخلية عن طريق محاذاة مجرى المفتاح مع مفتاح الإسكان.
قم بمحاذاة مجرى المفتاح المركزي مع مفتاح السكن واتركه يسقط برفق فوق مجموعة النافذة داخل السكن. لا تستخدم أبدا أي نوع من الأدوات لدفع القطعة المركزية إلى مبيت الخلية. قد يتسبب ذلك في تلف دائم للقطعة المركزية مما يؤدي إلى تجارب تخزين التسرب.
أدر مجموعة النافذة الثانية بحيث تكون النافذة متجهة نحو القطعة المركزية وبعيدا عنك. قم بمحاذاة مجرى المفتاح مع مفتاح السكن وحركه لأسفل أعلى القطعة المركزية. ضع حشية السكن في الأعلى.
ثم حلقة لولبية بحيث تكون الكلمة مرئية. باستخدام أصابعك. ثم أداة المحاذاة ، تشديد الحلقة اللولبية يدويا.
في بعض الأحيان لا تنزلق القطعة المركزية بسهولة في برميل السكن. يمكنك أولا محاذاته ، ثم وضع مجموعة النافذة الثانية فوقه. عن طريق تطبيق ضغط هبوطي لطيف على مجموعة النافذة.
يمكنك تحريك كلاهما في مبيت الخلية في نفس الوقت. بهذه الطريقة ، نتجنب الضغط مباشرة على القطعة المركزية. الآن هو الوقت المناسب للبحث في الخلية عن الغبار والوبر وبصمات الأصابع.
ستلاحظ أيضا حلقات نيوتن التي تشير إلى أنه لا يزال هناك هواء بين القطعة المركزية والنوافذ. ستختفي هذه بعد عزم الدوران مع حلقة المسمار لأعلى والكلمة مرئية. ضع خلية العينة بالكامل داخل الخلية.
كوليت عزم الدوران لحامل عزم الدوران. أمسك الخلية في مكانها عن طريق الضغط المستمر على مقبض حامل عزم الدوران. في حركة واحدة مستمرة ، قم بتدوير الحلقة اللولبية إلى ما بين 120 و 140 بوصة رطلا.
حرر مقبض حامل عزم الدوران وقم بإزالة خلية العينة بعناية. نقوم بشكل روتيني بتحميل حجم 400 ميكرولتر في كل قطاع من القطعة المركزية 12 ملم. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، ضع خلية العينة مع فتحات التحميل في الأعلى والكلمة على الحلقة اللولبية مرئية.
حرك طرف الماصة حتى المنتصف لأسفل إلى قطاع القطعة المركزية الأيسر من خلال فتحات التحميل وقم بتوزيع 200 ميكرولتر من المحلول المرجعي ببطء. كرر مرة واحدة ليصبح إجمالي 400 ميكرولتر باستخدام نفس طرف الماصة ونفس التقنية بعناية وببطء. املأ قطاع القطعة المركزية الصحيح ب 400 ميكرولتر من محلول العينة.
من الضروري مطابقة أحجام الحلول المرجعية وعينات الحلول بأكبر قدر ممكن. تركيب طرف الماصة بإحكام على الماصة، وتحميل المحاليل وتوزيعها ببطء، وتجنب تحميل الفقاعات، واستخدام نفس طرف الماصة لكلا المحلولين. كل المساعدة في الحفاظ على الأحجام مساوية لإغلاق الخلية.
ضع حشيتين حمراء لقابس الإسكان بإحكام في كل فتحة تحميل ، وتأكد من وضعها بعناية بين القطعة المركزية ومبيت الألومنيوم. قم بتغطية كل فتحة تحميل بقابس مبيت وشدها يدويا بمفك براغي صغير مسطح الرأس. قبل تحميل الدوار ، تأكد من أن وزن الموازن والخلية التي ستكون مقابل الموازن في حدود 0.5 جرام من بعضهما البعض.
ابدأ برصيد عند الصفر. أولا ، قم بوزن خلية عينة ستكون في موضعها مقابل الموازنة. قم بتمزيق الميزان لطرح وزن خلية العينة.
ثم قم بوزن الموازن. هنا نجد أن الموازنة أخف بمقدار 4.193 جرام من خلية العينة. حدد وزنا موازنا يبلغ وزنه أربعة جرامات وقم بلفه في فتحة التثبيت الخاصة بالميزان ، وتأكد من عدم إبرازه من الأعلى.
قم بتغيير الموازنة للتأكد من أن الوزن النهائي في حدود 0.5 جرام. باستخدام دوار رباعي الفتحات ، ضع الموازن في الموضع الرابع بحيث يكون السهم الأبيض مرئيا ويشير في اتجاه قوة الطرد المركزي. باستخدام أداة المحاذاة ، تأكد من أنها على طول الطريق داخل الدوار.
ضع خلية عينة الميزان مع سدادات الإسكان التي تواجه مركز الدوار والكلمة على الحلقة اللولبية مرئية. مرة أخرى ، باستخدام أداة المحاذاة ، تأكد من أنها على طول الطريق داخل الدوار. النظر من تحت الدوار.
محاذاة الداخل. كاتب ، ضع علامة على العلامة الأقرب إلى مركز الدوار بعلامة الكاتب على الموازن باستخدام أداة المحاذاة. بنفس الطريقة ، قم بمحاذاة خلية العينة في الموضع الثاني.
بعد محاذاة جميع الخلايا ، يكون الدوار جاهزا لوضعه في غرفة الطرد المركزي.
يوضح هذا الفيديو عملية تجميع وتحميل ومحاذاة خلية عينة جهاز الطرد المركزي التحليلي (AUC)، والتي تعتبر حاسمة لتجارب الطرد المركزي التحليلي. تم التركيز على المناولة الصحيحة وتحضير مكونات خلية العينة لضمان نتائج دقيقة.
Proper assembly and alignment of analytical ultracentrifuge sample cells are critical for generating reliable biophysical data on protein size, shape, purity, and oligomerization states. Meticulous sample cell preparation minimizes experimental artifacts, ensuring data integrity for target validation and mechanistic studies in early drug discovery. This procedural rigor supports predictive confidence in downstream screening and lead optimization workflows.
The analytical ultracentrifuge sample cell workflow integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform go/no-go decisions based on target behavior and stability.