Name: النظام الآلي للقياسات واحدة الإسفار جزيء من الجزيئات الحيوية سطح يجمد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: تعلم تقنية FRET لجزيئات الحمض النووي الفردية باستخدام مجهر متحد البؤر مؤتمت. تتيح هذه الطريقة دراسة ديناميكيات الجزيئات الحيوية وتفاعلاتها مع الإنزيمات في الوقت الفعلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر تشاندران Sabanayagam لمساعدته في تطوير النظام ، جوشوا إيديل للحصول على المشورة بشأن تصميم الجهاز ميكروفلويديك والموظفين في معهد رولاند في جامعة هارفارد لقطع الآلات من الإعداد. نعترف مناقشات مفيدة مع أعضاء مجموعة ميلر في معهد رولاند وفي جامعة بوسطن ، وأعضاء فريق T. ها &#39;s في UIUC للحصول على معلومات مفيدة. أخيرا ، ونحن نقدر الدعم المالي من مؤسسة العلوم الوطنية (PHY - 0701207) والمعهد الوطني للصحة (GM075893).

1 -- تركيب الخلية ميكروفلويديك يرصد الخلية ميكروفلويديك بواسطة التفجير a منقوشة ، 2 مم ، polydimethylsiloxane (PDMS) القرص لزلة تغطية الكوارتز تنظيفها حديثا. PDMS القرص يحتوي على أربع غرف مستطيلة 30 ميكرولتر التي يتم الوصول إليها من خلال مدخل ومخرج الشعيرات الدموية مرنة متصلة العازلة خزان ومضخة الحقن ، على التوالي ، لتدفق تسيطر عليها العازلة. ويدعم خلية تدفق على الجانب الخلفي من خلال نافذة زجاجية وضعت على حامل الخلية مخصصة الصنع تحتوي على عنصر المياه المبردة الحرارية لتنظيم درجة الحرارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل PDMS منقوشة القرص ، مزيج 10 الاستومر سيليكون أجزاء القاعدة مع 1 جزء عامل علاج ، تخلط جيدا وتترك لمدة 1 ساعة التفريغ في فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب المزيج بلطف على الاستومر القالب الخلية ميكروفلويديك. في حالتنا ، فإن هذا هو 1 رقاقة السيليكون &quot;مع أربعة شرائط (1x10 1x10 4 × 3 × 300 ميكرون) مصنوعة من مقاومة للضوء سلبية. اترك هذا لعلاج على طبق ساخن في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعناية القرص PDMS شفي من العفن باستخدام شفرة حلاقة. فتيل القرص على زجاج نافذة 1 &#39;&#39;(التي تحتوي على 8 × 2 ملم القطر قبل حفر ثقوب في كلا طرفي القنوات) بواسطة البلازما المؤكسدة كلا السطوح لمدة 30 ثانية. صهر زجاج النوافذ على الجانب المسطح من القرص PDMS (الجانب لا يحتوي على قنوات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج 2 بوصة طويلة أنابيب مرنة السيليكا تنصهر الشعرية من خلال ثقب في كل نافذة من الزجاج حتى يصل إلى القناة. قد ادخال ابرة أولا ثم التالية مع الشعرية تسهيل هذه العملية. اغلاق النافذة الزجاجية الثقوب باستخدام علاج سريع الصب السيليكون مركب مثل كويك الصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف القنوات مع الايثانول والمياه ، والبلازما تنشيط الخلايا جنبا إلى جنب مع تنظيفها حديثا ، 1 بوصة دائرية زلة تغطية الكوارتز لمدة 30 ثانية. نقترح التنظيف باستخدام هذه زلة تغطية البيرانا *. فتيل زلة تغطية إلى جانب الخلية التي تحتوي على القنوات ، وختم الغرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلية تجميعها لعلاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> * سمكة البيرانا هو حل من H 2 O 2 و H 2 SO 4 في 1:2.5 النسب. زلات لتنظيف الغطاء ، تزج بهم في هجوم اسماك الضاري في 90 دقيقة لمدة 20 درجة مئوية. 2 -- تفعيل السطح لاستيقاف جزيء لدراسات الحمض النووي ، وتجميد سطح أبسط نظام يتكون من طلاء الزجاج لأول مرة أو زلة تغطية الكوارتز مع ألبومين المصل البقري biotinylated (BSA) ، ثم مع streptavidin. هذا يسمح يجمد العينة biotinylated مع خصوصية عالية لعدة أيام في درجة حرارة الغرفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب مرنة إلى الشعيرات الدموية للحقن العازلة من السهل استخدام المحاقن والإبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول 0.1 ملغ / مل من جيش صرب البوسنة في biotinylated العازلة A (10 ملي TRIS ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم وتصفيتها باستخدام مرشحات 0.02 ميكرون) في القناة واحتضان ما لا يقل عن 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق ميكرولتر من 300-500 ألف العازلة لإزالة أي BSA مجانا biotinylated من القناة ، والحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء داخل الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول 0.1 ملغ / مل من streptavidin العازلة في ألف واحتضان لمدة 15 دقيقة. ثم كرر الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التدفق من خلال حل 3-5 مساء من العينة biotinylated. إجراء فحص سطحي للتأكد من التغطية من الجزيئات الفلورسنت. إذا لزم الأمر ، وزيادة تركيز العينة للحصول على تغطية أفضل. احتضان لمدة 10 دقيقة ثم كرر الخطوة 3. </li></ol> هي التي شنت على الخلية ميكروفلويديك مرحلة XY بمحركات السماح الخشنة (تصل إلى 25 ملم) الحركة باستخدام ترميز بصريا العاصمة المحركات ، وغرامة (1 نانومتر) الحركة باستخدام اثنين من حلقة مغلقة المحركات بيزو (Physik الرفيعة Instrumente طراز M - 014 أو ما شابه ذلك). ويمكن القيام بذلك إما قبل أو بعد تفعيل السطح لتجميد العينة. 3 -- اعداد الاحتياطي التصوير (IB) وباء يتكون من نظام الأكسجين الأنزيمية نظافتها وفاكهه تقضي الثلاثي ، مثل Trolox. منذ يتم مسح IB بين عشية وضحاها من خلال باستمرار ، ينبغي إعداد ما لا يقل عن 10 مل مقدما. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 10 مل من 0.8 ٪ ث / ت مد الجلوكوز ، على الأقل 35 مم TRIS - 8.0 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات. ارتفاع تركيز العازلة مهم لسببين : Trolox حل سوف يحمض الحل ، وردود الفعل الأنزيمية وأيضا انخفاض الرقم الهيدروجيني من الحل مع مرور الوقت. ويمكن هذا الحل منذ مدة صلاحية طويلة يمكن تخزينها كحل الأسهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 ملغ من حل Trolox في المنطقة العازلة على استعداد في الخطوة 1 من vortexing لبضع دقائق ثم 10 دقيقة ليهز&gt;. Trolox غير قابلة للذوبان في الماء جدا عند pH&gt; 7 ، لذلك لا تتعجل هذه الخطوة. مرشح الحل باستخدام ميكرومتر 0.2 التصفية وترك فراغ في التفريغ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد &quot;gloxy&quot; حل عن طريق خلط الأنزيمية 60 ميكرولتر wateص ، 20 ميكرولتر من العازلة 5X A ، 20 ميكرولتر من الكاتلاز ، 1 أوكسيديز الجلوكوز ملغ و 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل جيش صرب البوسنة. تصفية الحل باستخدام جهاز للطرد المركزي 0.22 ميكرون التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج برفق العازلة من الخطوة 2 مع الحل &quot;gloxy&quot; من الخطوة 3 تجنب تشكيل فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق IB عبر القناة بمعدل ثابت من 5 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة الحقن الميكانيكية للسيطرة على معدل التدفق. فقاعة غاز الأرجون في المكمن IB لمنع الأكسجين في الغلاف الجوي من إعادة حل في المنطقة العازلة. </li></ol> يتم التحكم في مسح السطح ، وتوطين جزيء واقتناء واحدة يتتبع كثافة الجزيء بواسطة برنامج LABVIEW التي تسمح الآلي جمع البيانات 1. البرنامج بمسح 20x20 2 ميكرومتر في المناطق القرار ميكرومتر 0.2 ، وذلك بنسبة 0.1 ميكرون / مللي. تتم معالجة البيانات على الفور إلى العائد كثافة المرجحة لجميع المواقع بكسل فوق التهم الخلفية. حالما يتم العثور على جزيئات يجمد ، فهي انتقلت تسجل واحدا تلو الآخر في حجم وكثافة مبائر من الجهات المانحة وfluorophore متقبل بوصفها وظيفة من الوقت حتى كلا photobleach fluorophores. مبرمجة ثم مرحلة للانتقال إلى أصل 100 ميكرون الجديدة بعيدا ، ويتم تكرار عملية المسح. 4 -- نتائج الممثل وفيما يلي بعض الصور التي تبين الخلية ميكروفلويديك تجميعها قبل التنشيط السطحية وبعد أن شنت على استعداد لتجميد المجهر الجزيء. إذا تم تنشيط قناة بنجاح ، يجب أن تفحص السطح تكون مشابهة لتفحص يصور أدناه تبين انبعاث الصبغة المانحة (الخضراء) ومتقبل (الأحمر) بعد الإثارة مباشرة من الجهات المانحة. يتم نقل هذه الجزيئات واحدا تلو الآخر في حجم التحقيق وسجلت مضان بمرور الوقت حتى كلا photobleach الأصباغ ، كما هو موضح في آثار جزيء واحد. ويمكن من آثار مثل هذه واحدة الحصول على الكفاءة التي يبلغ الحنق على الفصل المانحين متقبل لحظية ، والذي بدوره يستخدم لاستكشاف هيكل وديناميكية الجزيئات البيولوجية ذات الاهتمام. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /> الشكل 1 : الخلية ميكروفلويديك مع أربع قنوات ، ولكل منها مدخل / مخرج الشعيرات الدموية. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="الشكل 2" border="0" /> الشكل 2 : الخلية التي شنت على استعداد لإجراء قياسات المجهر. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="الشكل 3" border="0" /> الشكل 3 : الإعداد لSM - الحنق القياسات. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="الشكل 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="الشكل 5" border="0" /> أرقام 4 و 5 : قناة الأحمر والأخضر لمسح سطح جزيئات يجمد الحنق متحمس مع ليزر خضراء. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">الرقم 4</a> ، أو <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">الشكل 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="الشكل 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="الشكل 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="الشكل 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="الشكل 9" border="0" /> ارقام 6 و 7 و 8 و 9 : مسارات كثافة المانحة (الخضراء) ومتقبل (الحمراء) fluorophores المسمى لجزيء DNA 8 و 10 و 16 و 18 basepairs إربا. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">الرقم 6</a> ، <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">7 الشكل</a> ، <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">الرقم 8</a> ، أو <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">الشكل 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

على الرغم من أنه تم تحسين البروتوكول أعلاه لنظامنا معينة ومحددة لاختيار من الأصباغ (TMR وATTO647N) ، فإنه ليست بأي حال ثبت الأسلوب فقط. في الآونة الأخيرة ، وظهر نظام بديل الأكسجين الكسح التي تتكون من حمض protocatechuic (PCA) / ​​protocatechuate 3 ،4 - دي أكسيجيناز (PCD) لزيادة صمود للضوء من الأصباغ معينة 4. وبالمثل ، يمكن استخدام الثلاثي دولة أخرى مثل quenchers المركابتويثانول - β (BME) بدلا من Trolox ، رغم أن هذه قد لا تدوم طويلا قمع وامض بعض الأصباغ ، في 5 Cy5 معينة. على الرغم من الشلل عبر ألبومين البيوتين streptavidin - biotinylated المصل البقري (BSA) هو الخيار المفضل للدراسات الأحماض النووية ، هي مناسبة أفضل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) المغلفة السطحية للدراسات من البروتينات لأنها غير محددة يمنع التصاق 1. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفرعي حيود محدودة الحجم إلى الحويصلات تغليف جزيء حيوي من الاهتمام في الحالات التي يمكن أن تتأثر بها التفاعلات السطحية 6. في هذه المقالة قد اعتدنا على إعداد مبائر مجهزة photodiodes الانهيار السيليكون للحصول على آثار كثافة مضان. هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع توتال الداخلية المجاهر الإسفار التأمل (TIRF) مجهزة بكاميرات CCD. بغض النظر عن استخدام المجهر ، SM - الحنق يمكن الابلاغ عن القرارات المكانية يقترب من انجستروم عندما يتم تصحيحها بشكل صحيح إشارة المانحة ومتقبل 7.

<table><tbody><tr><td>أنابيب شعرية من السيليكا المنصهرة</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>غطاء شرائح من السيليكا المنصهرة</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA مبيوتني</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>ستريبت أفيدين</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>طقم بوليمر Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>طقم بوليمر السيليكون</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>كاتالاز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>جلوكوز أكسيداز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>مانع التسرب Kwik-Cast</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>مركب صب السيليكون</td></tr></tbody></table>

النظام الآلي للقياسات واحدة الإسفار جزيء من الجزيئات الحيوية سطح يجمد

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) تم المجهري تستخدم على نطاق واسع لدراسة بنية وديناميكية الجزيئات البيولوجية ذات الاهتمام ، مثل الأحماض النووية والبروتينات. جزيء واحد الحنق (SM - الحنق) القياسات على جزيئات يجمد تصريح طويلة من الملاحظات من قبل النظام على نحو فعال على حد سواء حتى photobleach الأصباغ ، مما يؤدي إلى آثار في الوقت الذي يقدم تقريرا عن الديناميات الجزيئية البيولوجية مع طائفة واسعة من الجداول الزمنية من الألف إلى دقائق. لتسهيل اقتناء عدد كبير من التحليلات الإحصائية للآثار ، لا بد من آلية عملية وينبغي أن تكون البيئة عينة رقابة مشددة على مدار الزمن القياس بأكمله (~ 12 ساعة). ويتم إنجاز هذا باستخدام مجهر المسح الآلي مبائر التي تسمح للاستجواب الآلاف من الجزيئات واحدة بين عشية وضحاها ، وخلية ميكروفلويديك الذي يسمح للسيطرة على تبادل العازلة ، مع تقييد محتوى الاكسجين ويحافظ على درجة حرارة ثابتة طوال فترة القياس بأكملها. هنا نبين كيفية تجميع الجهاز ميكروفلويديك وكيفية تفعيل سطحه لتجميد الحمض النووي. ثم كيف لنا أن نفسر لإعداد عازلة لتحقيق أقصى قدر من صمود للضوء وعمرها fluorophores. أخيرا ، وتبين لنا الخطوات المتبعة في إعداد برنامج الإعداد لاقتناء الآلي من الوقت حل جزيء واحد من آثار الحنق جزيئات الحمض النووي.

نحن في هذه المقالة تصف كيف يمكننا الحصول على الحنق من آثار جزيئات الحمض النووي الفردية ثبتوا على السطح باستخدام المجهر الآلي مبائر المسح.

لقد استُخدم مجهر نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) على نطاق واسع لدراسة بنية وديناميكيات الجزيئات ذات الأهمية البيولوجية، ...

لدراسة ديناميكيات الجزيئات الفردية على مدى فترة زمنية ممتدة، يجب أولاً تحديد مواقع الجزيئات في الفراغ. ونحقق ذلك عن طريق تثبيتها على سطح خلية مائعية دقيقة. تبدأ العملية بتجميع الخلية، التي تحتوي على أربع غرف حيث سيتم تثبيت الجزيئات الحيوية.ترتبط الحجرات بالخارج عبر شعيرات دقيقة للدخول والخروج. وتُصنع الخلية عن طريق دمج قرص PDMS منقوش بغطاء من الكوارتز. بعد ذلك، يتم تركيب الخلية المجمعة على مجهر الفلورسنت وتوصيل أنابيب مرنة بالشعيرات الدقيقة للسماح بالتبديل السهل للمحاليل عبر الحجرات؛ ولتنشيط السطح لتثبيت الجزيئات، يتم أولاً تدفق محلول من biotinylated BSA عبر إحدى القنوات.سيمتص الـ BSA في الغرفة. ثم يتم تمرير محلول من الستريبتاديفين على الأسطح، والذي سيرتبط بدوره بالبيوتين. وأخيراً، يتم تمرير الأوليغونوكليوتيد المبيوتني، الذي سيرتبط بالستريبتاديفين، مما يؤدي إلى تثبيت الجزيء المستهدف على سطح شريحة الغطاء الكوارتزية.يتم تدفق محلول منظم للتصوير مصمم لزيادة استقرار وعمر وكثافة الفلوروفورات عبر الغرفة بمعدل ثابت طوال فترة الحصول على البيانات. يقوم الإعداد الآلي بمسح أقسام مختلفة من السطح بحثاً عن الجزيئات التي تحتوي على كل من الفلوروفور المانح والمتقبل، ثم ينقلها واحداً تلو الآخر إلى حجم السبر للحصول على تتبع زمني لكثافة الفلورة لكل منها حتى يحدث التبييض الضوئي لكلا الفلوروفورين. مرحباً، أنا Nicholas Dfi من مختبر البروفيسور Miller في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة Boston University.سنعرض لكم اليوم إجراءً للحصول على آثار F لجزيئات مفردة من الأحماض النووية المثبتة باستخدام إعداد مجهري بؤري (confocal). نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة ديناميكيات الأحماض النووية والتفاعلات بين الأحماض النووية والإنزيمات. لذا، لنبدأ الآن.يتم تصنيع خلية Microfluid Excel عن طريق دمج قرص من بولي ثنائي ميثيل السيلوكسان (PDMS) بسمك مليمترين ومزخرف بنقوش مع شريحة غطاء من الكوارتز نظيفة حديثاً. ولصنع قرص PDMS المزخرف، اخلط 10 أجزاء من قاعدة المطاط السيليكوني مع جزء واحد من عامل المعالجة جيداً، ثم قم بإزالة الغازات لمدة ساعة واحدة في جهاز تفريغ. وبعد إزالة الغازات من قاعدة المطاط، صبها برفق في قالب الخلية الموائعية الدقيقة.اترك خليط الإلاستومر ليتصلب على لوح تسخين عند 70 °C لمدة ساعتين. بعد التصلب، قم بإزالة قرص PDMS بعناية من القالب باستخدام شفرة حلاقة. يحتوي قرص PDMS على أربع غرف مستطيلة سعة كل منها 30 µL.قم بدمج الجانب المسطح من قرص PDMS، وهو الجانب الذي لا يحتوي على القنوات، فوق نافذة زجاجية بمقاس بوصة واحدة عن طريق أكسدة السطحين بالبلازما لمدة 30 ثانية. تحتوي النافذة الزجاجية على ثماني فتحات بقطر 2 mm عند كلا طرفي القنوات، والتي تم ثقبها مسبقاً. بعد ذلك، يتم إدخال أنبوب شعري مرن من السيليكا المنصهرة بطول 2 بوصة عبر كل فتحة في النافذة الزجاجية.للقيام بذلك، قم أولاً بإدخال إبرة ثم أدخل الأنبوب الشعري حتى يصل إلى القناة. قم بسد فتحات النافذة الزجاجية باستخدام مركب صب سيليكون سريع التصلب مثل quick cast. اشطف القنوات بالإيثانول والماء بعد تنشيط الخلية وشريحة غطاء كوارتز دائرية بقطر بوصة واحدة تم تنظيفها حديثاً بمحلول piranha لمدة 30 ثانية.قم بصهر غطاء الشريحة على جانب الخلية التي تحتوي على القنوات. وبهذا تكون الحجرات قد أُغلقت بإحكام. اترك الخلية المجمعة لتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.بعد معالجة خلية Microfluid Excel المجمعة طوال الليل، يتم وضعها في حامل مصنع خصيصاً وتثبيتها على منصة المجهر البؤري (confocal microscope) لبدء تنشيط سطح الخلية. ولتثبيت الجزيئات، قم بتوصيل أنابيب مرنة بالشعيرات الخاصة بالخلية لتسهيل حقن المحلول المنظم باستخدام حقنة وإبرة. الآن، احقن محلولاً من 0.1 mg/mL من BSA المبيوتني (biotinylated BSA) في المحلول المنظم A داخل القناة واتركه في الحاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل.بعد فترة الحضانة التي استمرت 30 دقيقة، يتم تمرير من 300 إلى 500 µL من buffer A لإزالة أي BSA مرتبط بالبيوتين غير ممتص من القناة، مع الحرص على عدم حبس أي فقاعات هواء داخل الغرفة. بعد ذلك، يتم حقن محلول بتركيز 0.1 mg/mL من STR din في buffer A والحضانة لمدة 15 دقيقة.بعد تدفق فترة الحضانة لمدة 15 دقيقة، أضف من 300 إلى 500 µL من buffer A لإزالة أي strep din غير ممتص من القناة. وكما سبق، تجنب احتجاز أي فقاعات هواء في الغرفة. وأخيرًا، قم بتدفق محلول بتركيز يتراوح من ثلاثة إلى خمسة pM من العينة المبيوتنة (biotinylated sample).للتحقق من تغطية الجزيئات الفلورية، يتم إجراء مسح سطحي. يتم تحضين العينة المبيوتنة لمدة 10 دقائق وتكرار تدفق المحلول المنظم. وكما تم توضيحه سابقاً، يتكون محلول التصوير المنظم أو IB من نظام إنزيمي لإزالة الأكسجين ومخمد ثلاثي مثل trol locks لجعل الـ IB يذوب أولاً.يُذاب 5 mg من trol في 10 mL من منظم الجلوكوز (glucose buffer) عن طريق الرج بمجهاز الـ vortex لمدة دقيقتين والرج لمدة 10 دقائق على الأقل. يُرشح المحلول ويُترك للتخلص من الغازات في جهاز تفريغ هوائي لمدة 10 دقائق. يُمزج محلول TRO lock بلطف مع المحلول الإنزيمي Glocky مع تجنب تكوين فقاعات هوائية.املأ الخزان بمحلول IB. بعد ذلك، وباستخدام مضخة حقن ميكانيكية للتحكم في معدل التدفق، قم بتدفق محلول IB عبر القناة بمعدل ثابت قدره 5 µL/min، مع ضخ غاز الأرجون في خزان IB لمنع ذوبان أكسجين الغلاف الجوي في المحلول المنظم. يتم التحكم في مسح السطح، وتحديد موقع الجزيئات، والحصول على آثار شدة الجزيء الواحد بواسطة برنامج LabVIEW، والذي يقوم بمسح مناطق بمساحة 20 × 20 µm² بدقة 0.2 µm وبمعدل 0.1 µm/ms.تتم معالجة البيانات الناتجة عن المسح السطحي فوراً لاستخراج المواقع المرجحة بالكثافة لجميع البكسلات التي تتجاوز قيم العد الخلفية. وبمجرد تحديد مواقع الجزيئات المثبتة، يتم نقلها واحداً تلو الآخر إلى الحجم البؤري (confocal volume)، وتُسجل كثافات الفلوروفور المانح والمستقبل كدالة في الزمن حتى يحدث التبييض الضوئي (photo bleach) لكليهما. بعد ذلك، تُبرمج المنصة للانتقال إلى نقطة أصل جديدة تبعد 100 millimeters، وتتكرر عملية المسح.يظهر هنا جهاز MICROFLUID Excel بعد تجميعه. هذه مسوحات سطحية تُظهر جزيئات مفردة في القنوات المانحة الخضراء والقابلة الحمراء. كما تظهر بعض آثار الجزيئات المفردة النموذجية التي توضح شدة المستقبل باللون الأحمر والمانح باللون الأخضر.لقد أوضحنا لكم للتو كيفية الحصول على آثار الجزيئات المفردة من الجزيئات الحيوية المثبتة باستخدام إعداد مجهري بؤري. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر القيام بكل خطوة بعناية والتأني، نظرًا لأن هذه التجربة تمثل تحديًا. هذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا الفيديو يبين تحليل التجارب مع لاحقة من البروتين البروتين التفاعلات عن طريق استخدام الصغرى منقوشة السطوح. النهج توفر إمكانية الكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية ، ويجمع بين قدرات إنتاجية عالية مع إمكانية استخراج المعلومات الكمية.

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يتم تصور تفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا ذات الدقة المكانية النانومترية من خلال الجمع بين تكميل التألق ثنائي الجزيئات (BiFC) والفحص المجهري للتوطين المنشط ضوئيا (PALM). الموصوف هنا هو استخدام BiFC-PALM لتصوير تفاعلات Ras-Raf في خلايا U2OS لتصور التجميع النانوي وانتشاره لمجمعات Ras-Raf الفردية.

Photoactivated التعريب المجهري مع ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC-PALM)

يظهر هنا تحضير طبقات دهنية مستوية مدعومة بالزجاج المستوي الوظيفي ، وتحديد حركة البروتين داخل وقياس كثافة البروتين. تم تحديد خارطة طريق لبناء مجهر انعكاس داخلي إجمالي منخفض الضوضاء ، مما يسمح بتصور الفلوروكروم المقيم في طبقة ثنائية الطبقة بدقة زمانية مكانية عالية.

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

نقدم الإعداد والإجراء التجريبي للحصول على بيانات smFRET من شبكات المانحين المتقبلين الكبيرة باستخدام مجهر TIRF. ينتج عن التحليل خطوة بخطوة لهذه القياسات باستخدام برنامج الاستدلال البايزي Fast-NPS معلومات هيكلية عالية الدقة من خلال تطبيق نماذج الصبغة المكيفة.

معلومات الهيكلية من جزيء واحدة الحنق التجارب باستخدام سريع نانو لتحديد المواقع نظام

نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على بيانات ألوان سمفريت وتحليلها مع فرقة 3D نموذج ماركوف المخفي. مع هذا النهج، يمكن استخراج العلماء المعلومات الحركية من نظم البروتين المعقدة، بما في ذلك كوبيراتيفيتي أو التفاعلات المرتبطة.

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تجانس وضع العلامات لكل أنواع البروتين في عينة بروتين معقدة على مستوى جزيء واحد.

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

توفر هذه المقالة إرشادات خطوة بخطوة لإجراء قياسات FRET دقيقة تم تصحيحها بالكامل على الجزيئات الحيوية الفردية المنتشرة بحرية باستخدام smfBox مفتوح المصدر وغير مكلف ، من التبديل ، من خلال المحاذاة والتركيز ، إلى جمع البيانات وتحليلها.

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

تقدم هذه المقالة طريقة للتحليل المكاني الزماني للمجسات المتنقلة أحادية الجزيء Förster القائمة على نقل الطاقة بالرنين (smFRET) باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال. تسمح مجموعة أدوات البرامج المطورة حديثا بتحديد آثار الوقت smFRET للمجسات المتحركة ، بما في ذلك كفاءة FRET الصحيحة والمواقع الجزيئية ، كوظائف للوقت.

التحليل المكاني الزماني الآلي ثنائي الأبعاد لمجسات FRET أحادية الجزيء المتنقلة

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإجراء وتحليل ربط وتنقل وتجميع جزيئات مفردة على أغشية دهنية مزدحمة اصطناعية باستخدام مجهر التألق الداخلي الكلي للانعكاس الداخلي (smTIRF) أحادي الجزيء.

نشر جزيء واحد وتجميعها على أغشية الدهون المزدحمة بالبوليمر

هنا ، نقدم البروتوكول لدراسة المرونة والديناميكيات المحلية للجزيئات الحيوية باستخدام تباين الخواص الفلوري الذي تم حله بمرور الوقت على مستوى الجزيء الفردي في وضع الفحص المجهري متحد البؤر.

تباين الخواص الفلورية الذي تم حله بمرور الوقت من الجزيئات المفردة لتوصيف المرونة المحلية في الجزيئات الحيوية

يصف هذا البروتوكول تصنيف الجسم المضاد الواحد (SAL) لحل التنظيم المكاني على نطاق نانوي لبروتينات الغشاء البلازما. من خلال الاستفادة من التفاعلات التراكمية بين الأجسام المضادة والحامضة على مستوى الجزيئات الفردية، يقوم SAL الغشائي (mSAL) برسم توزيعات الملحمة المحلية مع التقاط سلوك ارتباط الأجسام المضادة في البيئة الخلوية الأصلية.

المجهر الفريد لتحديد الجزيء الواحد لبروتينات الغشاء باستخدام وسم الجسم المضاد الواحد

تعلم تقنية FRET لجزيئات الحمض النووي الفردية باستخدام مجهر متحد البؤر مؤتمت. تتيح هذه الطريقة دراسة ديناميكيات الجزيئات الحيوية وتفاعلاتها مع الإنزيمات في الوقت الفعلي.

النظام الآلي للقياسات واحدة الإسفار جزيء من الجزيئات الحيوية سطح يجمد

استكشف المزيد من الفيديوهات