النظام الآلي للقياسات واحدة الإسفار جزيء من الجزيئات الحيوية سطح يجمد

لدراسة ديناميكيات الجزيئات الفردية على مدى فترة زمنية ممتدة، يجب أولاً تحديد مواقع الجزيئات في الفراغ. ونحقق ذلك عن طريق تثبيتها على سطح خلية مائعية دقيقة. تبدأ العملية بتجميع الخلية، التي تحتوي على أربع غرف حيث سيتم تثبيت الجزيئات الحيوية.

ترتبط الحجرات بالخارج عبر شعيرات دقيقة للدخول والخروج. وتُصنع الخلية عن طريق دمج قرص PDMS منقوش بغطاء من الكوارتز. بعد ذلك، يتم تركيب الخلية المجمعة على مجهر الفلورسنت وتوصيل أنابيب مرنة بالشعيرات الدقيقة للسماح بالتبديل السهل للمحاليل عبر الحجرات؛ ولتنشيط السطح لتثبيت الجزيئات، يتم أولاً تدفق محلول من biotinylated BSA عبر إحدى القنوات.

سيمتص الـ BSA في الغرفة. ثم يتم تمرير محلول من الستريبتاديفين على الأسطح، والذي سيرتبط بدوره بالبيوتين. وأخيراً، يتم تمرير الأوليغونوكليوتيد المبيوتني، الذي سيرتبط بالستريبتاديفين، مما يؤدي إلى تثبيت الجزيء المستهدف على سطح شريحة الغطاء الكوارتزية.

يتم تدفق محلول منظم للتصوير مصمم لزيادة استقرار وعمر وكثافة الفلوروفورات عبر الغرفة بمعدل ثابت طوال فترة الحصول على البيانات. يقوم الإعداد الآلي بمسح أقسام مختلفة من السطح بحثاً عن الجزيئات التي تحتوي على كل من الفلوروفور المانح والمتقبل، ثم ينقلها واحداً تلو الآخر إلى حجم السبر للحصول على تتبع زمني لكثافة الفلورة لكل منها حتى يحدث التبييض الضوئي لكلا الفلوروفورين. مرحباً، أنا Nicholas Dfi من مختبر البروفيسور Miller في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة Boston University.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للحصول على آثار F لجزيئات مفردة من الأحماض النووية المثبتة باستخدام إعداد مجهري بؤري (confocal). نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة ديناميكيات الأحماض النووية والتفاعلات بين الأحماض النووية والإنزيمات. لذا، لنبدأ الآن.

يتم تصنيع خلية Microfluid Excel عن طريق دمج قرص من بولي ثنائي ميثيل السيلوكسان (PDMS) بسمك مليمترين ومزخرف بنقوش مع شريحة غطاء من الكوارتز نظيفة حديثاً. ولصنع قرص PDMS المزخرف، اخلط 10 أجزاء من قاعدة المطاط السيليكوني مع جزء واحد من عامل المعالجة جيداً، ثم قم بإزالة الغازات لمدة ساعة واحدة في جهاز تفريغ. وبعد إزالة الغازات من قاعدة المطاط، صبها برفق في قالب الخلية الموائعية الدقيقة.

اترك خليط الإلاستومر ليتصلب على لوح تسخين عند 70 °C لمدة ساعتين. بعد التصلب، قم بإزالة قرص PDMS بعناية من القالب باستخدام شفرة حلاقة. يحتوي قرص PDMS على أربع غرف مستطيلة سعة كل منها 30 µL.

قم بدمج الجانب المسطح من قرص PDMS، وهو الجانب الذي لا يحتوي على القنوات، فوق نافذة زجاجية بمقاس بوصة واحدة عن طريق أكسدة السطحين بالبلازما لمدة 30 ثانية. تحتوي النافذة الزجاجية على ثماني فتحات بقطر 2 mm عند كلا طرفي القنوات، والتي تم ثقبها مسبقاً. بعد ذلك، يتم إدخال أنبوب شعري مرن من السيليكا المنصهرة بطول 2 بوصة عبر كل فتحة في النافذة الزجاجية.

للقيام بذلك، قم أولاً بإدخال إبرة ثم أدخل الأنبوب الشعري حتى يصل إلى القناة. قم بسد فتحات النافذة الزجاجية باستخدام مركب صب سيليكون سريع التصلب مثل quick cast. اشطف القنوات بالإيثانول والماء بعد تنشيط الخلية وشريحة غطاء كوارتز دائرية بقطر بوصة واحدة تم تنظيفها حديثاً بمحلول piranha لمدة 30 ثانية.

قم بصهر غطاء الشريحة على جانب الخلية التي تحتوي على القنوات. وبهذا تكون الحجرات قد أُغلقت بإحكام. اترك الخلية المجمعة لتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

بعد معالجة خلية Microfluid Excel المجمعة طوال الليل، يتم وضعها في حامل مصنع خصيصاً وتثبيتها على منصة المجهر البؤري (confocal microscope) لبدء تنشيط سطح الخلية. ولتثبيت الجزيئات، قم بتوصيل أنابيب مرنة بالشعيرات الخاصة بالخلية لتسهيل حقن المحلول المنظم باستخدام حقنة وإبرة. الآن، احقن محلولاً من 0.1 mg/mL من BSA المبيوتني (biotinylated BSA) في المحلول المنظم A داخل القناة واتركه في الحاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل.

بعد فترة الحضانة التي استمرت 30 دقيقة، يتم تمرير من 300 إلى 500 µL من buffer A لإزالة أي BSA مرتبط بالبيوتين غير ممتص من القناة، مع الحرص على عدم حبس أي فقاعات هواء داخل الغرفة. بعد ذلك، يتم حقن محلول بتركيز 0.1 mg/mL من STR din في buffer A والحضانة لمدة 15 دقيقة.

بعد تدفق فترة الحضانة لمدة 15 دقيقة، أضف من 300 إلى 500 µL من buffer A لإزالة أي strep din غير ممتص من القناة. وكما سبق، تجنب احتجاز أي فقاعات هواء في الغرفة. وأخيرًا، قم بتدفق محلول بتركيز يتراوح من ثلاثة إلى خمسة pM من العينة المبيوتنة (biotinylated sample).

للتحقق من تغطية الجزيئات الفلورية، يتم إجراء مسح سطحي. يتم تحضين العينة المبيوتنة لمدة 10 دقائق وتكرار تدفق المحلول المنظم. وكما تم توضيحه سابقاً، يتكون محلول التصوير المنظم أو IB من نظام إنزيمي لإزالة الأكسجين ومخمد ثلاثي مثل trol locks لجعل الـ IB يذوب أولاً.

يُذاب 5 mg من trol في 10 mL من منظم الجلوكوز (glucose buffer) عن طريق الرج بمجهاز الـ vortex لمدة دقيقتين والرج لمدة 10 دقائق على الأقل. يُرشح المحلول ويُترك للتخلص من الغازات في جهاز تفريغ هوائي لمدة 10 دقائق. يُمزج محلول TRO lock بلطف مع المحلول الإنزيمي Glocky مع تجنب تكوين فقاعات هوائية.

املأ الخزان بمحلول IB. بعد ذلك، وباستخدام مضخة حقن ميكانيكية للتحكم في معدل التدفق، قم بتدفق محلول IB عبر القناة بمعدل ثابت قدره 5 µL/min، مع ضخ غاز الأرجون في خزان IB لمنع ذوبان أكسجين الغلاف الجوي في المحلول المنظم. يتم التحكم في مسح السطح، وتحديد موقع الجزيئات، والحصول على آثار شدة الجزيء الواحد بواسطة برنامج LabVIEW، والذي يقوم بمسح مناطق بمساحة 20 × 20 µm² بدقة 0.2 µm وبمعدل 0.1 µm/ms.

تتم معالجة البيانات الناتجة عن المسح السطحي فوراً لاستخراج المواقع المرجحة بالكثافة لجميع البكسلات التي تتجاوز قيم العد الخلفية. وبمجرد تحديد مواقع الجزيئات المثبتة، يتم نقلها واحداً تلو الآخر إلى الحجم البؤري (confocal volume)، وتُسجل كثافات الفلوروفور المانح والمستقبل كدالة في الزمن حتى يحدث التبييض الضوئي (photo bleach) لكليهما. بعد ذلك، تُبرمج المنصة للانتقال إلى نقطة أصل جديدة تبعد 100 millimeters، وتتكرر عملية المسح.

يظهر هنا جهاز MICROFLUID Excel بعد تجميعه. هذه مسوحات سطحية تُظهر جزيئات مفردة في القنوات المانحة الخضراء والقابلة الحمراء. كما تظهر بعض آثار الجزيئات المفردة النموذجية التي توضح شدة المستقبل باللون الأحمر والمانح باللون الأخضر.

لقد أوضحنا لكم للتو كيفية الحصول على آثار الجزيئات المفردة من الجزيئات الحيوية المثبتة باستخدام إعداد مجهري بؤري. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر القيام بكل خطوة بعناية والتأني، نظرًا لأن هذه التجربة تمثل تحديًا. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.