تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

مرحباً، أنا ليا كنت من STEM Gen. سنوضح لكم اليوم كيفية إذابة وتجميد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. لذا، فلنبدأ.

لإذابة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، يتم إخراج أنبوب الحفظ بالتجميد من النيتروجين السائل وإذابته بسرعة. وفي حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C، يتم نقل معلق الخلايا من أنبوب الحفظ إلى أنبوب مخروطي يحتوي على وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية للتخفيف، ثم يُجرى له الطرد المركزي. ولتكوين كريّة خلوية صغيرة، يتمت إزالة السائل الطافي ثم إعادة تعليق كريّة الخلايا بوسط زراعة خلايا جذعية جنينية بشرية جديد داخل الأنبوب، وذلك قبل زراعتها في بئر واحد من طبق زراعة خلايا مكون من ستة آبار تم تحضيره مسبقاً بطبقة مغذية من خلايا meth المشععة.

قبل يوم واحد من إذابة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (human ES cells)، يتم زرع طبقة مغذية من الخلايا الليفية الجنينية للفئران المشععة، أو الخلايا الجذعية الميزنكيمية (mes) في وسط استزراع في بئر واحدة من طبق زراعة أنسجة مكون من ستة آبار ومطلي بالجيلاتين. يتم تحضين الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون.

لضمان عملية إذابة فعالة وناجحة، تأكد من تجهيز جميع المعدات والكواشف اللازمة قبل إخراج خلايا ESL البشرية من النيتروجين السائل. باستخدام ملقط معدني، أخرج أنبوباً مبرداً يحتوي على خلايا E ESL البشرية من خزان تخزين النيتروجين السائل.

قم بدحرجة القارورة بين يدين ترتديان القفازات لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس ثوانٍ. ولإزالة الصقيع، قم بتدوين المعلومات الموجودة على ملصق القارورة باستخدام ملقط معدني. ثم اغمر القارورة في حمام مائي درجة حرارته 37 °C.

قم بتدوير القارورة برفق وراقب تقدم عملية الإذابة بشكل متكرر وسريع من خلال رفع القارورة أمام الضوء لرؤية حجم بلورة الثلج. لا تغمر غطاء القارورة في الحمام المائي لأن ذلك قد يؤدي إلى تلوث الخلايا.

عندما تتبقى بلورة صغيرة فقط من الثلج، اغمر الأنبوبة في الإيثانول لتعقيمها داخل كابينة سلامة بيولوجية معقمة، ثم انقل محتويات أنبوبة الحفظ بالتجميد مباشرة إلى قاع أنبوبة مخروطية سعة 15 milliliter. أضف ببطء أربعة milliliters من وسط استنبات خلايا ES البشرية إلى الأنبوبة.

قم بهز الأنبوب برفق لمزج الخلايا باستمرار أثناء إضافة الوسط الجديد إلى الأنبوب. قم بطرد خلايا human E es مركزياً لمدة خمس دقائق عند 200 Gs أثناء وجود الخلايا في جهاز الطرد المركزي. استخرج طبق meth feeder المُعد مسبقاً من الحاضنة عند 37 درجة Celsius وضع عليه ملصقاً يحتوي على معلومات human ESL المناسبة مثل الخط الخلوي، ورقم الممر، وتاريخ الإذابة Thaw.Date.

قم بشفط وسط استزراع خلايا MEF وأضف 1 mL من PBS إلى البئر. أعد راسب خلايا human E ESL إلى كابينة السلامة البيولوجية وقم بشفط السائل الطافي بعناية. احذر من شفط الكتلة الخلوية الراسبة، ولكن أزل أكبر قدر ممكن من السائل الطافي لأن هذا المحلول يحتوي على DMSO من وسط التجميد. إعادة التعليق.

قم بتعليق الراسب برفق شديد عن طريق إضافة 2.5 milliliters من وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (human ESL). وباستخدام ماصة زجاجية سعة خمسة milliliters، قم بسحب محلول PBS من بئر خلايا MEF المغذية عن طريق السحب والتدوير ثلاث إلى أربع مرات. ثم أضف ببطء كامل كمية معلق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية البالغة 2.5 milliliters إلى البئر المجهز في الطبق ذي الستة آبار.

ضع الطبق في الحاضنة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وحركه بعناية من الأمام إلى الخلف ومن جانب إلى آخر لتوزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء البئر، وذلك لتجنب تركيز المستعمرات في المركز. لا تقم بتدوير الطبق بحركة دائرية.

اترك الخلايا لتلتصق عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون طوال الليل في اليوم التالي لعملية الإذابة. قم بإزالة الوسط مع أي خلايا عائمة وأضف 2.5 milliliters من وسط زراعة خلايا ES البشرية الطازج إلى البئر.

يتم تحضين الأطباق عند 37 درجة Celsius و5% carbon dioxide طوال الليل، والاستمرار في الزراعة حتى تصبح المستعمرات جاهزة للنقل. يبدأ بروتوكول تجميد خلايا ES البشرية بمستعمرات خلايا ES بشرية سليمة متوسطة الحجم مستزرعة في طبق ذي ستة آبار. وبعد تحضين المزرعة مع إنزيم collagenase four، يتم كشط المستعمرات باستخدام ماصة زجاجية سعة 5 milliliter وجمعها في أنبوب مخروطي ثم إجراء الطرد المركزي لتكوين كريّة خلوية رخوة.

بعد سحب السائل الطافي، يتم إعادة تعليق كتلة الخلايا؛ أولاً باستخدام وسط استزراع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، ثم تخفيفها باستخدام وسط الحفظ بالتجميد بتركيز 2x. تُوزع الخلايا بالتساوي في حصص بحجم 1 mL، وتُجمد في أنابيب مخصصة للتجميد العميق.

بينما تكون الخلايا في جهاز الطرد المركزي، قم بتسمية الأنابيب المبردة (cryogenic vials) داخل كابينة السلامة برقم ممر السلالة الخلوية وتاريخ التجميد. تكون الكثافة النموذجية لتجميد خلايا E es البشرية عبارة عن خلايا بئر واحدة من طبق ستة آبار لكل أنبوب تبريد. عندما يتم الانتهاء من طرد خلايا human E ESL مركزياً، أعد الأنبوب إلى كابينة السلامة البيولوجية.

قم بسحب السائل الطافي من الأنبوب. مع الحرص على عدم تعكير راسب الخلايا المتجمع بشكل مفكك، قم بإعادة تعليق راسب الخلايا باستخدام الكمية المناسبة من وسط زراعة ESL البشري.

وسط زراعة خلايا ESL البشرية بمقدار 0.5 milliliters لكل أنبوب تجميد. يجب توخي الحذر الشديد عند السحب بالماصة، حيث تتعافى خلايا E es البشرية بشكل أفضل عند تجميدها في قطع مستعمرات كبيرة نسبياً، أضف الكمية المناسبة من وسط تجميد خلايا human E es بتركيز two x إلى الخلايا ببطء مع رج الأنبوب بلطف.

بمجرد إضافة وسط التجميد، يُخلط المحلول عن طريق السحب والضخ بالماصة برفق شديد، من مرة إلى مرتين، ثم يُضاف بسرعة ولكن برفق 1 mL من معلق الخلايا إلى كل أنبوب تجميد. تُنقل الأنابيب إلى حاوية تجميد تحتوي على الإيزوبروبانول وتوضع في مجمد بدرجة حرارة 80- °C طوال الليل. ستتجمد الخلايا بمعدل 1 °C في الدقيقة داخل حاوية تجميد الإيزوبروبانول في اليوم التالي.

انقل القوارير المجمدة بسرعة إلى خزان تخزين النيتروجين السائل باستخدام ملقط معدني. في اليوم الأول بعد إذابة خلايا ES البشرية، قد تبدو المستعمرات الصغيرة شفافة ويصعب رؤيتها تحت المجهر. وبما أنها أُذيبت حديثاً، تميل خلايا e ESL البشرية إلى التكاثر ببطء شديد.

قد تستغرق بضعة أيام في المزرعة حتى تظهر كمستعمرات مستقرة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إذابة وتجميد مزارع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.