تقنية لتصور في الوقت نفسه للفيروسات محددة CD8 + الخلايا T والخلايا المصابة بالفيروسات في الموضع

من خلال الجمع بين التهجين في الموقع والتلوين الرباعي في تقنية تعرف باسم ISTH ، يمكن تحديد الأعداد النسبية والعلاقات المكانية بين الخلايا المستجيبة المناعية الخاصة بالمستضد الفيروسي والخلايا والأنسجة المصابة فيروسيا. يبدأ ISTH بتضمين الأنسجة المصابة بفيروس SIV الجديد في agros. يتم تقطيع الأنسجة إلى أقسام بسمك 200 ميكرون باستخدام اهتزاز وتلطيخها لمستضد فيروسي.

مضغوط محدد ثماني خلايا موجبة باستخدام tetramers ملائمة C تحمل علامة معقد التوافق النسيجي الكبير. بعد التجميد ، يتم تقطيع أقسام البقع هذه إلى أقسام بسمك ثمانية ميكرومتر باستخدام ناظم البرد ويتم إجراء التهجين في الموقع لتحديد موقع الخلايا المصابة فيروسيا. يستخدم الفحص المجهري متحد البؤر لتصوير أقسام البقعة المزدوجة وإعادة بناء الأقسام السميكة الأصلية في النهاية للكشف عن العلاقة بين المستجيب المناعي والخلايا المستهدفة.

أثبت استخدام هذا الإجراء لفحص عدوى SIV المبكرة أنه مؤشر جيد على شدة المرض الذي أعقب ذلك. مرحبا ، أنا Chinen Lee من شجرة مختبر Ashley HA في قسم علم الأحياء الدقيقة بجامعة مينيسوتا. أنا بام سكينر ، أستاذ مساعد في قسم العلوم الطبية الحيوية البيطرية بجامعة مينيسوتا.

سنعرض لك اليوم إجراء من الداخل في المعهد تهجين أو ISTH باختصار. بالإضافة إلى استخدام تلطيخ inci teer جنبا إلى جنب مع تهجين inci كما نوضح اليوم ، فإننا نستخدم أيضا بشكل روتيني تلطيخ inci teer جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية لتحديد الموقع والوفرة وملف تعريف التعبير عن البروتين لخلايا CD الثماني الخاصة بالمستضد في موقعك. مساعدتنا اليوم في تلوين الأقسام السميكة في الموقع سيكون الدكتور هيون كيم وتيري ماتالا ويساعدوننا في إعداد قسم رقيق وسيكون التهجين في الموقع لذلك دعونا نبدأ.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتبريد حمام Vibram الذي يحتوي على PBSH معقم إلى درجة حرارة تصل إلى درجتين مئويتين. اضبط زاوية شفرة الهزاز على 27 درجة. كلما أمكن ، احتفظ بالمناديل الطازجة مبردة على الثلج وابدأ الإجراء في غضون 24 ساعة بعد حصاد الأنسجة.

من أجل تقليل تقشعر لها الأبدان ، يسهل الاهتزاز أيضا قطع الأنسجة الطازجة ، وتقليم النسيج الضام وتقطيع العينة بمشرط إلى قطع صغيرة ووضع القطع في قارب مصل اللبن وتغطيتها بذوبان منخفض بنسبة 4٪. ذاب Agros في PBS عند حوالي 40 درجة مئوية. تأكد من ملامسة الأنسجة لقاع الطبق وادفع قطع المناديل لأسفل إذا كانت تطفو ، وتتجلب على الجليد لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.

هنا يتم استخدام أنسجة الطحال ، ولكن يمكن أيضا استخدام العقدة الليمفاوية أو المهبل أو عنق الرحم أو الرحم أو غيرها من الأنسجة الطازجة مع مشرط. قم بقص agros حول الأنسجة وباستخدام الملقط ، ونقل الأنسجة المدمجة بعناية إلى كتلة الأنسجة. استمر بطلاء كتلة مناديل Vibram بغراء Loctite.

لا تحرك قطعة الأنسجة بمجرد وضعها على كتلة الأنسجة. اتركه يجف لمدة 10 دقائق على الثلج. بعد ذلك ، قم بتركيب كتلة الأنسجة في الهزاز وقم بتقطيع الأنسجة إلى أقسام بسمك 200 ميكرومتر باستخدام سرعة أمامية بطيئة وسعة عالية نسبيا.

استخدم فرشاة رسم لنقل الأقسام المقطوعة إلى حجرة أنسجة متخصصة موضوعة في بئر صفيحة زراعة أنسجة 24 بئر مملوءة مسبقا بملليلتر واحد من PBSH المبرد. ضع ما يصل إلى أربعة أقسام للأنسجة في كل حجرة من الحجرة الأنسجة. قم بتسمية العينات وتثبيت الغطاء على اللوحة بشريط مطاطي من أجل تلطيخ أقسام الأنسجة للخلايا التائية الفيروسية المحددة.

يتم تخفيف رباعيات ZI المترافقة أولا في حجب المخزن المؤقت إلى nwt 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. يتم سحب المحلول في صفيحة 24 بئرا بمعدل ملليلتر واحد لكل بئر. يتم نقل الأنسجة المقطوعة حديثا إلى الصفيحة في غرف الأنسجة ويسمح لها بالتأرجح طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

احتفظ ببئر فارغة بين غرف الأنسجة التي تحتوي على عينات مختلفة لمنع التلوث المتبادل للمحاليل في الخطوات اللاحقة. في هذه الخطوة يمكن للمرء إضافة أجسام مضادة موجهة ضد البروتينات خارج الخلية أو البروتينات السطحية للخلية. للغسيل ، قم بإعداد لوح زراعة مناديل 24 بئر يحتوي على PBSH المبرد بعد الحضانة الأولية.

يغسل مرتين عن طريق نقل غرف الأنسجة إلى طبق مملوء مسبقا لمدة 20 دقيقة في كل مرة ، تأكد من تصريف معظم السائل من غرف الأنسجة قبل النقل. أيضا ، لا تقم بتقطير محتوى عينة إلى أخرى عند تحريك غرف الأنسجة وراقب الأقسام الموجودة في غرف الأنسجة للتأكد من أنها لا تلتصق بالجانبين. قم بإصلاح الأقسام بنسبة 4٪ بارالديهايد الطازج في PBS لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة بعد التثبيت.

يغسل مرتين باستخدام PBSH البارد لمدة خمس دقائق في كل مرة لتضخيم الإشارة من رباعيات. احتضان الأقسام بأجسام مضادة للأرانب المضادة للفيتزي بنسبة واحد إلى 10،000 في مانع المخزن المؤقت لمدة يوم إلى ثلاثة أيام. في هذه المرحلة ، يمكن للمرء إضافة أجسام مضادة ضد الحلقات داخل الخلايا.

تأكد من اختراق الخلايا وحجب المواقع غير المحددة قبل إضافة الجسم المضاد. قد تكون هناك حاجة أيضا إلى استرجاع المستضد بعد الحضانة الطويلة الثانية التي تهدف إلى تضخيم الإشارة. اغسل الأقسام في PBSH ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة على الأقل وحتى عدة ساعات في كل مرة.

قم بإجراء حضانة نهائية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة ذات العلامات الفلورية. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدام الماعز المضاد للأرانب SI ثلاثة لربط الأجسام المضادة للأرانب المضادة للفيتزي لجعل خلايا صبغة رباعي التألق باللون الأحمر. إذا تم استخدام الأجسام المضادة للفأر لمواجهة البروتينات ذات الأهمية مثل CD ثمانية لتصور الخلايا التائية القاتلة ، فيمكن للمرء استخدام الماعز المضاد للولايات المتحدة Alexa 488 للارتباط بالأجسام المضادة للفأر وجعل خلايا صبغة الجسم المضاد تتألق ، يجب تحديد التخفيفات الخضراء لكل جسم مضاد تجريبيا.

احتضن لمدة يوم إلى ثلاثة أيام ، وحافظ على الأقسام محمية من الضوء عن طريق لف الألواح ورقائق القصدير أثناء هذه الحضانة وبعد ذلك مع سقوط الضوء للنباتات. أخيرا ، قم بإصلاح الأقسام مرة أخرى لتأمين الرباعيات والأجسام المضادة في مكانها. يغسل ويوضع على شريحة مجهرية مع جيلاتين الجلسرين الذي يحتوي على أربعة ملليغرام لكل مليلتر من N الملف الشخصي غالات للتخزين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحضير أقسام رقيقة للتهجين في الموقع.

يمكن الآن تحليل أقسام صبغة رباعي الموضعي باستخدام مجهر متحد البؤر من أجل تحديد وفرة التوطين ونمط تعبير البروتين للقرص المضغوط المحدد للمستضد ، ثماني خلايا تائية موجبة في الصورة الموضحة ، تم تلطيخ أقسام أنسجة الطحال من استراحة SIV المصابة ب tetramers لتسمية CD الخاص ب SIV ، ثماني خلايا تائية إيجابية ، CD 20 ، أجسام مضادة CD 3. نظرا لأن العدادات التي تلطخ بالأجسام المضادة ستفقد في الخطوة التالية. من المهم تحليل رباعيات في الموقع قبل المضي قدما.

ابدأ إجراء التقسيم الرقيق عن طريق تسخين الأقسام التي يبلغ سمكها 200 ميكرون عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق على كتلة حرارية لفصل الأقسام السميكة عن الشريحة. بمجرد فصل الأقسام ، قم بتضمينها في OCT على الثلج الجاف عن طريق ملء قاع القالب البلاستيكي أولا ب OCT. ثم ضع المنديل فوق OCT وقم بتغطيته ب OCT.

استخدم ناظم البرد لقطع أقسام بسمك ثمانية ميكرون من الأقسام المضمنة في OCT ولصق أقسام الميكرون الثمانية بالشرائح المنعزلة. يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح عند 80 درجة مئوية تحت الصفر في صندوق مغلق للتهجين اللاحق في الموقع. يستخدم التهجين القياسي في الموقع للكشف عن الخلايا المصابة بالفيروسات عبر مجسات الأضلاع الخاصة بالفيروسات S 35.

يتضمن الإجراء أيضا أقسام الطلاء بمستحلب المسار النووي وشرائح التركيب. في الفلورسنت ، يتم الحصول على صور متحد البؤر متوسطة متوافقة مع الفلورسنت باستخدام المجهر متحد البؤر BioRad MRC 1000 ، والذي تم تجهيزه بجهاز انعكاس أزرق لأنبوب epi. يتم تصور تلطيخ رباعي الموقع باستخدام EPI one 605 للفلوروكروم الرباعي الأحمر و EPI 2 522 DF 32 للقرص المضغوط الأخضر ثمانية فلوروكروم للتهجين الموضعي

استخدم انعكاس EPI الأزرق للحبيبات الفضية الناتجة عن إشارة التهجين في الموقع في التوقيعات الراديوية المطورة. لبدء الحصول على الصور ، احصل على الصور من كل قسم من اليسار إلى اليمين ومن أعلى إلى أسفل وتأكد من التقاط كل صورة بتداخل بنسبة 20٪ تقريبا مع الصور المجاورة لها. لتجنب الثغرات في صورة المونتاج المعاد بناؤها ، قم بتسمية كل صورة وفقا لإخوانها وعمودها في ملف Excel.

عند اكتمال جمع البيانات من الشرائح، استخدم برنامج المساعد متحد البؤر لعرض الصور التسلسلية Z لكل قناة في صورة واحدة باستخدام إجراء Photoshop السابع المتاح من المؤلفين، ودمج الصورة المعروضة تلقائيا من القنوات الثلاث في صورة RGB واحدة. ثم قم بدمج الصور المدمجة معا في طبقات لإنشاء صورة مونتاج للقسم بأكمله. اربط حبيبات الفضة الفردية وصبغة الترامير بالخلايا الموجودة في المونتاج باستخدام التحول أو Photoshop.

قم بتعيين إحداثيات XY للمراكز أو OIDs للخلايا الإيجابية للحمض النووي الريبي الفيروسي والخلايا الإيجابية الرباعي. قم بتصدير بيانات OID إلى ملفات Excel كأرقام رقمية لكل خلية واستخدم البيانات التي تم جمعها في ملفات Excel لتحديد نسب المستجيب المناعي أو الخلايا الإلكترونية إلى الأهداف الفيروسية أو الخلايا التائية من الأعداد الإجمالية للخلايا الإيجابية للرباعي والخلايا الإيجابية للحمض النووي الريبي الفيروسي في القسم لالتقاط العلاقات المكانية بين الخلايا الرباعية الموجبة والخلايا الموجبة للحمض النووي الريبي. انسخ والصق المخططات الخاصة بها من ملفات Excel في مستند Photoshop في Photoshop.

قم بتقليل عتامة الطبقة لمحاذاة الشبكات وقياسها بحيث تتطابق مع اللون، وحدد، ثم انسخها ولصقها في طبقة جديدة. تتجاهل مواضع الخلايا الموجبة للحمض النووي الريبي الأزرق الطبقة المستخدمة لمحاذاة الشبكات وسيتم الكشف عن مواضع الخلايا الإيجابية للحمض النووي الريبي الرباعي والفيروسي في الصورة المسطحة. باستخدام طريقة ISTH الموضحة هنا ، يمكننا متابعة الاستجابة المناعية لعدوى SIV بعد التلقيح داخل المهبل في بوابة الدخول هذه وفي الأنسجة اللمفاوية التي تنتشر إليها العدوى.

هناك أعداد كبيرة من الخلايا المصابة في مواقع الأنسجة هذه بعد 10 أيام من الإصابة ، ولكن في وقت متأخر من ثلاثة أيام ، توجد خلايا إيجابية CD A للبقع الخضراء ، ولكن ليس بعد. خلايا رباعية موجبة خاصة باللون الأحمر SIV. وبالتالي فإن الاستجابة المناعية قد فات الأوان للتخلص من العدوى.

ومع ذلك ، بعد ثلاثة أسابيع من الإصابة ، يكون الانخفاض في الخلايا المصابة واضحا بوضوح ، خاصة عند بوابة الدخول. استخدمنا ISTH لإظهار أن مدى الانخفاض كان مرتبطا بالقرب المكاني والأعداد النسبية للخلايا المناعية المستجيبة الرباعي. الخلايا المستهدفة الإيجابية N-S-I-V-R-N-A ، نسميها نسبة E إلى T في الجسم الحي.

يتم تصور العلاقات المكانية بسهولة باستخدام هذه الطريقة مع الخلايا المستجيبة باللون الأحمر والأهداف الفيروسية باللون الأزرق في هذه العقدة الليمفاوية المصابة. توجد العديد من الخلايا المستجيبة والمستهدفة على مقربة من بعضها البعض وهناك مناطق تحيط فيها العديد من الخلايا المستجيبة بخلية موجبة واحدة S-I-V-R-N-A بينما في مناطق أخرى تقف الخلية الموجبة S-I-V-R-N-A بمفردها. يتم حساب نسبة ETT ببساطة حيث يتم تحديد مواضع الخلايا وتسجيل الدخول بأرقام كل منها في ملف Excel.

ترتبط أفضل سيطرة على العدوى الفيروسية بفائض كبير في المؤثرات الحمراء على الأهداف الخضراء 43 إلى واحد. في هذه الحالة ، في عنق الرحم والمهبل حيث بدأت العدوى ، كانت نسب ETT أقل في الغدد الليمفاوية. يشير الارتباط الإيجابي بين نسب ETT العالية وتقليل الحمل الفيروسي من الذروة إلى أن الاستجابة المناعية الأكثر قوة عند بوابة الدخول تترجم إلى تحكم أفضل في العدوى.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية اكتشاف خلايا CDAT المحددة للغاية وخلية عدوى الفيروس في الموقع في وقت واحد. تسمح لنا هذه التقنية بتصور الخلايا التائية الخاصة بالمستضد والخلايا المصابة بالفيروس في الأنسجة في نفس الوقت. يمكن تطبيق هذه التقنية لتقييم اللقاح القائم على الخلايا التائية الإيجابية الثمانية المضغوطة وممرض آخر غير ذي قيمة وتفاعل المضيف عند القيام بهذا الإجراء.

من المهم الحفاظ على جميع الكواشف الحمض النووي الريبي خالية قبل الرؤى التي تقوم بتهجينها. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.