الأبهر خاتم الفحص
نوفمبر 24, 2009
الأوعية الدموية ، يرتبط تنتشر الأوعية الدموية من الأوعية الدموية الموجودة من قبل ، مع كل من العمليات الطبيعية والمرضية. نحن هنا تدل على وجود عصابة مقايسة الأبهر الذي يسمح potentiators عائية ومثبطات المضافة مباشرة إلى حلقات الأبهر في الثقافة. تنتشر ويمكن تحديدها عن طريق التفتيش ثمرة neovessel الحلقات الأبهر على مدى فترة من 6-12 أيام.
الهدف العام من اختبار الحلقة الأبهرية هو توفير نظام تجريبي مرن تنبت فيه الأوعية الدموية من قطع كاملة من الشريان الأورطي الفأر داخل مصفوفة ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الشريان الأورطي الصدري أولا من الفأر ثم تنظيفه بعناية من أي بقايا من الأنسجة المحيطة. يتم وضع شرائح من الشريان الأورطي النظيف أو الحلقات الأبهرية في آبار فردية من صفيحة 48 بئر تحتوي كل منها على مستخلص مصفوفة قاعدية أو BME مصبوبة في قباب.
قطرة إضافية من BME تحيط بالحلقة في هيكل ثلاثي الأبعاد. يمكن أن تحتوي المصفوفة على أي كاشف تجريبي من اختياره. بعد الحضانة لعدة أيام ، يمكن ملاحظة أن الأوعية تنبت من حلقات الأبهر ويمكن تقييم إمكانات الأوعية الدموية لمركبات الاختبار.
مرحبا ، أنا كارين بين من مختبر الدكتور إي لويس في قسم الكيمياء الحيوية السريرية في جامعة بيون للسلبيات في بي شيفع إسرائيل. سنعرض لك اليوم إجراء لمقايسة حلقة الأبهر الماوس. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثيرات المواد المختلفة على تكوين الأوعية الدموية.
لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، اسمح لمستخلص المصفوفة السفلية أو BME بالذوبان على الجليد أو عند أربع درجات مئوية. بمجرد إذابته ، استمر في الحفاظ على BME باردا لمنعه من التصلب مرة أخرى.
في يوم التجربة ، قتل فأر عمره ستة إلى سبعة أسابيع عن طريق حقن الكيتامين والزيلازين القياسي الذي ينزف بسرعة عبر شرايين الرقبة ، متبوعا بخلع عنق الرحم. ابدأ الإجراء بمسح بنسبة 70٪ من الإيثانول في غطاء تدفق رقائقي معقم. بعد ذلك ، أثناء العمل تحت نطاق تشريح ، استخدم ملقطا معقما ومقص تشريح لإجراء شق رأسي للجلد وفتح الجدار البريتوني.
يجب إجراء الشق لكشف القص العلوي حيث يتم قطع القفص الصدري أيضا وإزالة الحجاب الحاجز. استمر في دفع جميع الأعضاء جانبا بعناية لتعريض الشريان الأورطي الصدري الموجود بجانب العمود الفقري مع تعرض الشريان الأورطي تماما ، وأدخل ملاقط رفيعة معقمة بين الشريان الأورطي والعمود الفقري. انشر الملقط مفتوحا وارفع الشريان الأورطي تدريجيا من سريره ، وافصل الجزء الصدري عن بقية الشريان الأورطي.
الآن بعد أن تم فصل الشريان الأورطي ، استخدم مقصا حادا لقطعه بعيدا عن الفأر بدءا من النهاية ، والذي يقع على مقربة من الأوعية الكلوية وينتهي بالقرب من القلب. ضع الشريان الأورطي الصدري المستأصل في طبق بتري مليء ب PBS المعقم البارد. الآن بعد إزالة الشريان الأورطي ، يمكن تحضير الحلقات الأبهرية باستخدام ملاقط معقمة والعمل تحت مجهر.
نظف الشريان الأورطي الصدري من الأنسجة الدهنية المحيطة. تأكد من عدم إتلاف الشريان الأورطي واحتفظ به عند الحواف فقط. يجب غمر الشريان الأورطي بشكل متكرر في طبق بتري PBS الذي يحتوي على منع الجفاف حتى يتم تنظيفه في النهاية.
الآن بعد أن أصبح الشريان الأورطي الصدري نظيفا ، استخدم شفرة جراحية واعمل تحت المجهر لتقطيع الشريان الأورطي بالتساوي إلى حلقات ملليمتر واحد. باستخدام مسطرة موضوعة أسفل سطح القطع كدليل ، تأكد من استخدام شفرة جديدة واستبدالها من وقت لآخر للحفاظ على الحدة. لا يتم استخدام نهايات الشريان الأورطي بعد قطع كل حلقة ، استخدم الملقط لنقلها برفق شديد إلى طبق جديد يحتوي على PBS بارد.
ضع جميع الحلقات في نفس لوحة PBS التي تحتوي على للتأكد من أن الفحص عشوائي. نظرا لأن كل جزء من الشريان الأورطي له إمكانات مختلفة إلى حد ما لتكوين الأوعية الدموية ، احتفظ بالحلقات على الجليد. بعد ذلك ، قم بإعداد لوحة الفحص باستخدام أطراف ماصة مسبقة البرودة.
أضف إلى كل بئر في صفيحة 48 بئر حول قطرة 150 ميكرولتر من BME البارد ، وتتصلب القطرة إلى قبة في منتصف الحركة. يسمح BME بنقل المواد ، والانجذاب الكيميائي للخلايا ، والأهم من ذلك ، تمايز الخلايا وهجرتها التي تؤدي إلى تكوين الأوعية الجديدة تمتلئ الآبار المحيطة ب PBS لتجنب الجفاف BME ، اسمح لانخفاض BME بالتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بمجرد أن تصلب BME ، ارفع بعناية حلقة الأبهري من طبق بتري باستخدام ملاقط لمنع التلف ، يجب نقل الحلقة داخل قطرة الدهون التي تتشكل بين أطراف الملقط نتيجة للتوتر السطحي السائل ، ضع حلقة أورطي واحدة في الجزء العلوي الأوسط من كل قبة واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية فوق كل حلقة ، أضف 150 ميكرولترا إضافيا من BME واحتضنه لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
عند 37 درجة مئوية ، يتم تغليف الحلقة الآن بمؤشر كتلة الجسم والمقايسة. يمكن إضافة المواد إلى اللوحة لبدء الفحص. مكمل Pres الذي تم إعداده مسبقا وسط خال من مصل البطان البشري إما مع المواد التجريبية أو مكمل نمو الخلايا البطانية كعنصر تحكم إيجابي للتحكم السلبي.
استخدم الوسيط وحده. أضف 500 ميكرولتر من وسط المكملات الغذائية إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ستة إلى 12 يوما. خلال فترة الحضانة هذه ، افحص الصفيحة تحت المجهر وابحث عن الأوعية التي تنبت من الشريان الأورطي وعن الأوعية الناضجة المتقدمة التي تم تحديدها بواسطة المزيد من الأوعية المتفرعة.
يجب أن تمتد من الأنسجة الحلقية ثلاثية الأبعاد ، قم بتصوير الحلقات بين اليوم السادس و 12 تحت مجسم تباين المرحلة القياسية. بالإضافة إلى ذلك ، اجمع المواد الطافية في أيام مختلفة بين اليوم السادس و 12 وتخزينها في أربع درجات للاستخدام في غضون يوم واحد أو Eloqua وتخزينها عند سالب 20 أو 80 تحت الصفر للاستخدام في المستقبل. يمكن تحليل المواد الطافية بتقنيات مختلفة مثل Eliza ل vgf أو مقايسة الشحوم لمستويات أكسيد النيتريك.
تم جمع هذه الصور بعد 12 يوما من وضع الحلقات في الآبار والحضانة إما بالثقافة أو الوسيط الذي يظهر في الصف العلوي من الصور أو تخطيط القلب المستخدم كعنصر تحكم إيجابي لإنبات السفينة. في اللوحة السفلية. كل صورة عبارة عن لقطة تمثيلية لأربع حلقات من أصل 12 حلقة، والتي تستخدم عادة في الفحص لكل شرط.
زاوية كل حلقة أورطي في كل بئر منفصل سوداء. عند التصوير بهذه الطريقة ، تظهر الحلقات الأبهرية التي تعرضت لتخطيط القلب نمو الأوعية الدموية وتشير الأسهم إلى العديد من الأوعية العديدة التي تشكلت. تتميز كل وعاء بأنها سلاسل من الخلايا البطانية مع تفرع عرضي يشير إلى أنها ناضجة.
لا يمكن ملاحظة أي أوعية تنبت في الثقافة. آبار متوسطة في اللوحة العلوية ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء مقايسة الأبهر عند القيام بهذا الإجراء. من المهم أن تتذكر أن تعمل بدقة وفهم ظروفهم.
هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة فحص حلقة الأبهر المصمم لدراسة تكوين الأوعية الدموية من خلال السماح بنمو الأوعية الدموية من الأبهر الفأري في بيئة خاضعة للتحكم. يتيح الفحص إضافة مباشرة للمركبات المولدة للأوعية لتقييم تأثيراتها على نمو الأوعية الجديدة على مدار أيام.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تكوين الأوعية الدموية
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- الفحوصات التجريبية
الخلفية
- تكوين الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية لكل من العمليات الفسيولوجية والمرضية.
- يوفر فحص حلقة الأبهر نموذجًا لدراسة تكوين الأوعية الدموية.
- يمكن أن يؤدي فهم تكوين الأوعية الدموية إلى رؤى حول أمراض مختلفة.
- يسمح الفحص باختبار مركبات مختلفة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.
غرض الدراسة
- لتطوير نظام مرن لدراسة تكوين الأوعية الدموية.
- لتقييم تأثيرات محفزات ومثبطات تكوين الأوعية الدموية.
- لملاحظة نمو الأوعية من حلقات الأبهر في المختبر.
الطرق المستخدمة
- تشريح الأبهر الصدري من الفئران.
- إعداد حلقات الأبهر ووضعها في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.
- حضانة حلقات الأبهر مع الكواشف التجريبية.
- مراقبة نمو الأوعية الجديدة على مدار 6-12 يومًا.
النتائج الرئيسية
- نمو ناجح للأوعية الدموية من حلقات الأبهر.
- تقييم الإمكانات المولدة للأوعية لمركبات مختلفة.
- استعراض مرونة الفحص لظروف تجريبية مختلفة.
- رؤى حول آليات تكوين الأوعية الدموية.
الاستنتاجات
- يعتبر فحص حلقة الأبهر أداة قيمة لدراسة تكوين الأوعية الدموية.
- يتيح اختبارًا مباشرًا للعوامل المولدة للأوعية في بيئة خاضعة للتحكم.
- يمكن أن تسهم النتائج في فهم تطور الأوعية الدموية والأمراض ذات الصلة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
The aortic ring assay provides a physiologically relevant organotypic model for evaluating angiogenic and anti-angiogenic compounds in early discovery. By enabling direct compound testing in a 3D matrix with quantifiable neovessel outgrowth, it supports mechanistic de-risking of vascular targets and pathway validation. This assay bridges in vitro endothelial screens and in vivo models, improving predictive confidence in lead identification for cardiovascular, oncology, and ischemic disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing compound effects on sprouting from intact aortic tissue.
- Operational Value: Enables functional validation of angiogenic targets using a native vascular explant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with measurable effects on vessel formation in a disease-relevant context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for dose-response screening of angiogenic modulators.
- Operational Value: Standardizes readouts through phase-contrast imaging and supernatant collection for biomarker analysis.
- Scalability Value: Supports 6-replicate testing per condition to address biological variability and ensure assay robustness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through use of murine aorta, reflecting in vivo-like angiogenic responses.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of neovessel outgrowth.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by identifying compounds with consistent pro- or anti-angiogenic activity across replicates.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a functional readout that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking compound treatment to phenotypic changes in vessel sprouting and maturation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized BME embedding and randomized ring placement to minimize positional bias.
- Analytics: Generates quantitative outputs via image analysis of sprout length/branching and ELISA-based measurement of angiogenic factors in supernatants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling angiogenic responses in a tissue-contextual system.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening diverse compound libraries across therapeutic areas involving vascular pathology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by observing direct effects on neovessel formation from native tissue.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized ring preparation, BME doming, and replicate testing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic validation of vascular activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on angiogenic efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and tissue handling under sterile conditions.
- Dependent on consistent BME quality and proper gelation at 37°C for dome formation.
- Necessitates standardized imaging protocols and blinded analysis to minimize observer variability.
- Involves optimization of compound dosing and incubation times based on solubility and stability in aqueous medium.
- Limited by biological variability between aortic segments, necessitating replicate testing for statistical confidence.
