الأبهر خاتم الفحص

الهدف العام من اختبار الحلقة الأبهرية هو توفير نظام تجريبي مرن تنبت فيه الأوعية الدموية من قطع كاملة من الشريان الأورطي الفأر داخل مصفوفة ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الشريان الأورطي الصدري أولا من الفأر ثم تنظيفه بعناية من أي بقايا من الأنسجة المحيطة. يتم وضع شرائح من الشريان الأورطي النظيف أو الحلقات الأبهرية في آبار فردية من صفيحة 48 بئر تحتوي كل منها على مستخلص مصفوفة قاعدية أو BME مصبوبة في قباب.

قطرة إضافية من BME تحيط بالحلقة في هيكل ثلاثي الأبعاد. يمكن أن تحتوي المصفوفة على أي كاشف تجريبي من اختياره. بعد الحضانة لعدة أيام ، يمكن ملاحظة أن الأوعية تنبت من حلقات الأبهر ويمكن تقييم إمكانات الأوعية الدموية لمركبات الاختبار.

مرحبا ، أنا كارين بين من مختبر الدكتور إي لويس في قسم الكيمياء الحيوية السريرية في جامعة بيون للسلبيات في بي شيفع إسرائيل. سنعرض لك اليوم إجراء لمقايسة حلقة الأبهر الماوس. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثيرات المواد المختلفة على تكوين الأوعية الدموية.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، اسمح لمستخلص المصفوفة السفلية أو BME بالذوبان على الجليد أو عند أربع درجات مئوية. بمجرد إذابته ، استمر في الحفاظ على BME باردا لمنعه من التصلب مرة أخرى.

في يوم التجربة ، قتل فأر عمره ستة إلى سبعة أسابيع عن طريق حقن الكيتامين والزيلازين القياسي الذي ينزف بسرعة عبر شرايين الرقبة ، متبوعا بخلع عنق الرحم. ابدأ الإجراء بمسح بنسبة 70٪ من الإيثانول في غطاء تدفق رقائقي معقم. بعد ذلك ، أثناء العمل تحت نطاق تشريح ، استخدم ملقطا معقما ومقص تشريح لإجراء شق رأسي للجلد وفتح الجدار البريتوني.

يجب إجراء الشق لكشف القص العلوي حيث يتم قطع القفص الصدري أيضا وإزالة الحجاب الحاجز. استمر في دفع جميع الأعضاء جانبا بعناية لتعريض الشريان الأورطي الصدري الموجود بجانب العمود الفقري مع تعرض الشريان الأورطي تماما ، وأدخل ملاقط رفيعة معقمة بين الشريان الأورطي والعمود الفقري. انشر الملقط مفتوحا وارفع الشريان الأورطي تدريجيا من سريره ، وافصل الجزء الصدري عن بقية الشريان الأورطي.

الآن بعد أن تم فصل الشريان الأورطي ، استخدم مقصا حادا لقطعه بعيدا عن الفأر بدءا من النهاية ، والذي يقع على مقربة من الأوعية الكلوية وينتهي بالقرب من القلب. ضع الشريان الأورطي الصدري المستأصل في طبق بتري مليء ب PBS المعقم البارد. الآن بعد إزالة الشريان الأورطي ، يمكن تحضير الحلقات الأبهرية باستخدام ملاقط معقمة والعمل تحت مجهر.

نظف الشريان الأورطي الصدري من الأنسجة الدهنية المحيطة. تأكد من عدم إتلاف الشريان الأورطي واحتفظ به عند الحواف فقط. يجب غمر الشريان الأورطي بشكل متكرر في طبق بتري PBS الذي يحتوي على منع الجفاف حتى يتم تنظيفه في النهاية.

الآن بعد أن أصبح الشريان الأورطي الصدري نظيفا ، استخدم شفرة جراحية واعمل تحت المجهر لتقطيع الشريان الأورطي بالتساوي إلى حلقات ملليمتر واحد. باستخدام مسطرة موضوعة أسفل سطح القطع كدليل ، تأكد من استخدام شفرة جديدة واستبدالها من وقت لآخر للحفاظ على الحدة. لا يتم استخدام نهايات الشريان الأورطي بعد قطع كل حلقة ، استخدم الملقط لنقلها برفق شديد إلى طبق جديد يحتوي على PBS بارد.

ضع جميع الحلقات في نفس لوحة PBS التي تحتوي على للتأكد من أن الفحص عشوائي. نظرا لأن كل جزء من الشريان الأورطي له إمكانات مختلفة إلى حد ما لتكوين الأوعية الدموية ، احتفظ بالحلقات على الجليد. بعد ذلك ، قم بإعداد لوحة الفحص باستخدام أطراف ماصة مسبقة البرودة.

أضف إلى كل بئر في صفيحة 48 بئر حول قطرة 150 ميكرولتر من BME البارد ، وتتصلب القطرة إلى قبة في منتصف الحركة. يسمح BME بنقل المواد ، والانجذاب الكيميائي للخلايا ، والأهم من ذلك ، تمايز الخلايا وهجرتها التي تؤدي إلى تكوين الأوعية الجديدة تمتلئ الآبار المحيطة ب PBS لتجنب الجفاف BME ، اسمح لانخفاض BME بالتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بمجرد أن تصلب BME ، ارفع بعناية حلقة الأبهري من طبق بتري باستخدام ملاقط لمنع التلف ، يجب نقل الحلقة داخل قطرة الدهون التي تتشكل بين أطراف الملقط نتيجة للتوتر السطحي السائل ، ضع حلقة أورطي واحدة في الجزء العلوي الأوسط من كل قبة واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية فوق كل حلقة ، أضف 150 ميكرولترا إضافيا من BME واحتضنه لمدة 20 إلى 30 دقيقة.

عند 37 درجة مئوية ، يتم تغليف الحلقة الآن بمؤشر كتلة الجسم والمقايسة. يمكن إضافة المواد إلى اللوحة لبدء الفحص. مكمل Pres الذي تم إعداده مسبقا وسط خال من مصل البطان البشري إما مع المواد التجريبية أو مكمل نمو الخلايا البطانية كعنصر تحكم إيجابي للتحكم السلبي.

استخدم الوسيط وحده. أضف 500 ميكرولتر من وسط المكملات الغذائية إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ستة إلى 12 يوما. خلال فترة الحضانة هذه ، افحص الصفيحة تحت المجهر وابحث عن الأوعية التي تنبت من الشريان الأورطي وعن الأوعية الناضجة المتقدمة التي تم تحديدها بواسطة المزيد من الأوعية المتفرعة.

يجب أن تمتد من الأنسجة الحلقية ثلاثية الأبعاد ، قم بتصوير الحلقات بين اليوم السادس و 12 تحت مجسم تباين المرحلة القياسية. بالإضافة إلى ذلك ، اجمع المواد الطافية في أيام مختلفة بين اليوم السادس و 12 وتخزينها في أربع درجات للاستخدام في غضون يوم واحد أو Eloqua وتخزينها عند سالب 20 أو 80 تحت الصفر للاستخدام في المستقبل. يمكن تحليل المواد الطافية بتقنيات مختلفة مثل Eliza ل vgf أو مقايسة الشحوم لمستويات أكسيد النيتريك.

تم جمع هذه الصور بعد 12 يوما من وضع الحلقات في الآبار والحضانة إما بالثقافة أو الوسيط الذي يظهر في الصف العلوي من الصور أو تخطيط القلب المستخدم كعنصر تحكم إيجابي لإنبات السفينة. في اللوحة السفلية. كل صورة عبارة عن لقطة تمثيلية لأربع حلقات من أصل 12 حلقة، والتي تستخدم عادة في الفحص لكل شرط.

زاوية كل حلقة أورطي في كل بئر منفصل سوداء. عند التصوير بهذه الطريقة ، تظهر الحلقات الأبهرية التي تعرضت لتخطيط القلب نمو الأوعية الدموية وتشير الأسهم إلى العديد من الأوعية العديدة التي تشكلت. تتميز كل وعاء بأنها سلاسل من الخلايا البطانية مع تفرع عرضي يشير إلى أنها ناضجة.

لا يمكن ملاحظة أي أوعية تنبت في الثقافة. آبار متوسطة في اللوحة العلوية ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء مقايسة الأبهر عند القيام بهذا الإجراء. من المهم أن تتذكر أن تعمل بدقة وفهم ظروفهم.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.