استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

مرحبا ، أنا سان لي من مختبر ستيفن هارلم في قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة بجامعة كولومبيا البريطانية. نعرض لك اليوم إجراء لاستخراج الحمض النووي الجيني عالي الوزن الجزيئي من الغابة إلى التربة والذي ينطبق أيضا على مجموعة متنوعة من أنواع التربة والرواسب. نحن نستخدم الجينوم عالي الوزن الجزيئي ، الحمض النووي لبناء مكتبة عداد الغابات للمجتمعات الميكروبية في التربة.

مع وجود هذه المكتبات في متناول اليد ، يمكننا دراسة التنوع وإمكانات التمثيل الغذائي للمجتمعات الميكروبية المقسمة بين آفاق التربة المختلفة. لذلك دعونا نبدأ. يبدأ هذا البروتوكول بتحلل الخلية.

تتمثل الخطوة الأولى في إكمال المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة عن طريق إضافة الإيثانول betta mer capto إلى تركيز 0.5٪ للحصول على أفضل النتائج ، اجعل محلول تغيير الطبيعة طازجا في كل مرة. بدلا من ذلك ، استخدم المخزن المؤقت الذي يقل عمره عن أسبوع واحد والذي تم الاحتفاظ به عند أربع درجات مئوية. للخطوة التالية ، ستحتاج إلى مفاعل من النيتروجين السائل ومدقة وملعقة أوتوكلاف وملاط مبرد مسبقا.

ضع عينة تربة مجمدة سعة 2 جرام في الملاط المبرد مسبقا. أضف ملليلتر واحد من محلول تغيير الطبيعة. ثم أضف النيتروجين السائل لتغطية التربة بالكامل.

استخدم مدقة مبردة مسبقا لطحن العينة حتى تبدو جزيئات التربة مسحوقة ومتجانسة وتبدأ العينة في الذوبان. ثم أضف المزيد من النيتروجين السائل وكرر خطوة الطحن. هذا يكمل خطوة تحلل الخلية باستخدام ملعقة مبردة مسبقا.

انقل العينة الأرضية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. احتفظ بالعينة على الجليد للمتابعة على الفور إلى خطوة استخراج الحمض النووي أو تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لاستخدام اللتر ، قبل بدء استخراج الحمض النووي مباشرة ، أكمل المخزن المؤقت للاستخراج عن طريق إضافة سداسي ديكو ثلاثي ميثيل الأمونيوم بروميد أو CTAB و SDS. أولا.

تحقق مما إذا كان CTAB متبلورا ، وإذا كان الأمر كذلك ، فقم بإذابته عند 60 درجة مئوية قبل المتابعة. ثم أضفه إلى المحلول للحصول على تركيز إجمالي قدره 1٪ بعد ذلك ، أضف محلول SDS 20٪ إلى التركيز النهائي 2٪ المعلق اللبني. هذه الأشكال طبيعية.

بمجرد إضافة SDS ، حافظ على المخزن المؤقت للاستخراج المكتمل متجانسا عن طريق تخزينه عند 60 درجة مئوية بعد 10 إلى 15 دقيقة. بمجرد إذابة المخزن المؤقت للاستخراج جيدا وتجانسها ، أضف تسعة ملليلتر من المخزن المؤقت للاستخراج إلى عينة التربة والدوامة لفترة وجيزة بسرعة منخفضة للخلط. احتضان العينة بمخزن الاستخراج في فرن تهجين 65 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.

أثناء الحضانة ، اقلب الأنابيب برفق كل 10 دقائق أو قم بتدوير الأنابيب باستمرار بأقل سرعة للدوار. أثناء الحضانة ، قد يبدو المحلول لزجا قليلا بعد الحضانة. الخطوة التالية هي استخدام كحول الكلوروفورم إيزواميل لتنقية الحمض النووي بعيدا عن المواد العضوية في خليط التحلل.

ابدأ بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 1800 جيجابايت عند حوالي 10 إلى 14 درجة مئوية في الغطاء، واجمع الحمض النووي المحتوي على مادة طافية عن طريق تحريك طرف الماصة بعناية على طول جانب الأنبوب، وتجنب الطبقة البيج في الأعلى والطبقة العضوية في الأسفل. انقل المادة الطافية إلى أنبوب 50 مليلتر مبرد مسبقا يحتوي على 20 مل من كحول الكلوروفورم ISL أو بعد ذلك ، كرر عملية الاستخراج مرتين أخريين على نفس العينة. في هذه الأثناء ، احتفظ بمستخلص الحمض النووي والكلوروفورم على الجليد في الغطاء.

لاستخراج الحمض النووي الثاني ، ارجع إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات التربة مع مخزن مؤقت للاستخراج المتبقي وأضف خمسة ملليلتر أخرى من مخزن الاستخلاص. يقلب برفق بطرف مليلتر واحد للخلط والدوامة لفترة وجيزة لإعادة تعليق الحبيبات كما كان من قبل. احتضن عند 65 درجة مئوية هذه المرة لمدة 10 دقائق.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 1800 جي إس لمدة 10 دقائق. عند حوالي 10 إلى 14 درجة مئوية في الغطاء ، انقل المادة الطافية إلى الأنبوب الذي يحتوي على الكلوروفورم أو كحول الأيزواميل أو الكلوروفورم i a a والمادة الطافية من الاستخراج السابق. كرر عملية الاستخراج بأكملها مرة أخرى لاستخراج أكبر قدر ممكن من الحمض النووي من عينة التربة.

عندما تنتهي من إجمالي ثلاث عمليات استخراج على عينة التربة الخاصة بك ، قم بهز الأنبوب الذي يحتوي على فوق الطبيعة المجمعة والكلوروفورم i a a على صفيحة دوارة عند 1.25 RRP m لمدة 10 دقائق بعد خطوة الخلط هذه ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1800 Gs لمدة 20 دقيقة عند حوالي 10 إلى 14 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، انقل الطور المائي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي فائق جديد ، مع ترك واحد إلى ملليلترين من SNAT لتجنب إزعاج الواجهة بين المرحلتين المائية والعضوية. الآن لترسيب الحمض النووي ، أضف 0.6 مل من كحول الأيزوبروبيل.

لكل مليلتر من المادة الطافية التي تم جمعها ، اقلب الأنابيب برفق عدة مرات لخلطها. في هذه المرحلة ، قد تتمكن من رؤية الحمض النووي يترسب في خيوط طويلة. ثم احتضان الحمض النووي مع الأيزوبروبانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، حان الوقت لحبيبات الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي ، ووضع علامة على أحد أركان الأنبوب أثناء وضعه في جهاز الطرد المركزي حتى تعرف أين تتوقع دوران حبيبات الحمض النووي عند 16 ، 000 GS لمدة 20 دقيقة عند 20 إلى 25 درجة مئوية بعد الطرد المركزي ، وإزالة كحول الأيزوبروبيل عن طريق الصب و / أو الشفط بالفراغ. احرص على عدم فقد حبيبات الحمض النووي ، التي يتراوح حجمها من بالكاد مرئية إلى تسعة ملليمترات ، اعتمادا على كفاءة الاستخراج والكتلة الحيوية في عينات التربة ، جفف حبيبات الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 20 دقيقة. احرص على عدم الإفراط في الجفاف عندما تجف الحبيبات.

أعد تعليق الحمض النووي في 200 إلى 400 ميكرولتر من te. امزجها عن طريق النقر اللطيف. نقل محلول الحمض النووي إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

حافظ على الحمض النووي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. من أجل إذابة الحمض النووي بالكامل بمجرد استخراج الحمض النووي من عينة التربة ، فإن الخطوات المتبقية للتحقق من تركيز وسلامة الحمض النووي للعينة هي إجراءات قياسية ، والتي تم وصفها بالتفصيل في بروتوكول JoVE آخر من مختبر هالام. حدد تركيز الحمض النووي باستخدام الطريقة التي تختارها.

تحقق أيضا من سلامة الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي عن طريق نفاد 10 إلى 20 ميكرولترا من عينة الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام النبضي أو PFGE. يجب أن يكون متوسط حجم الحمض النووي 36 كيلو قاعدة أو أكثر اعتمادا على تطبيقك النهائي. انتقل إلى خطوة الطرد المركزي المتدرج لكلوريد السيزيوم التالية بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الحمض النووي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل الطرد المركزي الفائق.

الخطوة التالية هي استخدام الطرد المركزي المتدرج لكلوريد السيزيوم لزيادة تنقية الحمض النووي عن طريق إزالة الشوائب ، بعد تركيز الطرد المركزي لتدرج كلوريد السيزيوم ، وزيادة تنقية الحمض النووي باستخدام أجهزة تصفية الطرد المركزي AmCon و MicroCon. يعد الطرد المركزي لتدرج كلوريد السيزيوم مفتاحا لتحقيق الحمض النووي عالي الجودة ويتم وصفه بالتفصيل في بروتوكول JoVE آخر من مختبر هالام. بعد إجراء خطوات الطرد المركزي والتركيز لتدرج كلوريد السيزيوم ، تحقق من تركيز الحمض النووي باستخدام الطريقة التي تختارها.

بعد ذلك ، تحقق من سلامة الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي مرة أخرى عن طريق نفاد عينة صغيرة من الحمض النووي باستخدام PFGE. تتراوح الكمية الإجمالية للحمض النووي الجيني المعزول من جرامين من التربة القسرية من 10 إلى 180 ميكروغراما كما هو موضح في تشغيل الجل قبل وبعد الطرد المركزي الفائق لكلوريد السيزيوم. يتراوح نطاق حجم الحمض النووي المعزول عادة بين 40 إلى 60 كيلوقاعدة موضحة هنا عبارة عن مخطط كروماتومي لعينات الحمض النووي الجينومي قبل وبعد الطرد المركزي الفائق بكلوريد السيزيوم.

تعمل هذه الخطوة على تحسين نقاء الحمض النووي ، مما يزيد من نسبة 60 على نسبة 80 من 1.3 إلى 1.6 قبل إلى 1.8 إلى 1.9 بعد ذلك. علاوة على ذلك ، تم تقليل ذروة الامتصاص عند 230 نانومتر ، مما يعني تلوث حمض الهيوميك بنجاح بعد الطرد المركزي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية عزل الحمض النووي الجيني الجزيئي العالي من المجتمعات الميكروبية في التربة.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تجعل المخزن المؤقت للاستخراج وتغيير الطبيعة باتباع التعليمات بدقة. واحرص على عدم الوصول إلى الحنك النووي الخاص بك بعد ترسيب كحول الأيزوبروبيل. عندما تستعيد نطاق الحمض النووي بعد توسيط تدرج الكلوريد.

لا تنس شطف المحقنة باستخدام TE لتحقيق أقصى قدر من استعادة الحمض النووي. وأخيرا ، للتحقق من كمية ونوعية الحمض النووي المعزول في جميع الخطوات المقترحة. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.