استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

مرحباً، أنا سان لي من مختبر ستيفن هارلم في قسم الميكروبيولوجيا وعلم المناعة بجامعة كولومبيا البريطانية. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستخلاص DNA جينومي ذو وزن جزيئي مرتفع من تربة الغابات، وهو إجراء قابل للتطبيق أيضاً على مجموعة واسعة من أنواع التربة والرواسب. نحن نستخدم DNA جينومي ذو وزن جزيئي مرتفع لبناء مكتبة ميتجينومية لمجتمعات الميكروبات في التربة.

باستخدام هذه المكتبات، يمكننا دراسة التنوع والقدرة الاستقلابية للمجتمعات الميكروبية الموزعة بين آفاق التربة المختلفة. لذا، فلنبدأ العمل. يبدأ هذا البروتوكول بتحلل الخلايا.

تتمثل الخطوة الأولى في استكمال محلول التخثير بإضافة betta mer capto ethanol حتى يصل التركيز إلى 0.5%. وللحصول على أفضل النتائج، يُفضل تحضير محلول التخثير طازجاً في كل مرة، أو بدلاً من ذلك، استخدام محلول لم يمر على تحضيره أكثر من أسبوع بشرط حفظه في درجة حرارة 4 °C. وللخطوة التالية، ستحتاج إلى وعاء من النيتروجين السائل، وجهاز تعقيم (autoclave)، وهاون ومدقة مبردة مسبقاً، وملعقة مختبر (spatula).

ضع عينة تربة مجمدة بوزن 2 g في الهاون المبرد مسبقاً. أضف 1 mL من محلول إزالة الطبيعة. ثم أضف النيتروجين السائل لتغطية التربة بالكامل.

استخدم مدقة مبردة مسبقاً لطحن العينة حتى تبدو جزيئات التربة مسحوقة ومتجانسة وتبدأ العينة في الذوبان. ثم أضف المزيد من النيتروجين السائل وكرر خطوة الطحن. وبهذا تكتمل خطوة تحلل الخلايا باستخدام ملعقة مختبرية مبردة مسبقاً.

انقل العينة المطحونة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. احتفظ بالعينة على الثلج للانتقال فوراً إلى خطوة استخلاص DNA أو خزنها عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius. وبالنسبة للاستخدام اللاحق، وقبل البدء في استخلاص DNA مباشرة، أكمل تحضير محلول الاستخلاص المنظم بإضافة hexa deco trimethyl ammonium bromide أو CTAB وSDS.

تحقق مما إذا كان CTAB قد تبلور، وفي حال كان الأمر كذلك، قم بإذابته عند 60 درجة Celsius قبل المتابعة. ثم أضفه إلى المحلول ليصل التركيز الإجمالي إلى 1%بعد ذلك، أضف محلول SDS بتركيز 20% حتى يصل التركيز النهائي إلى 2%يعد تكون المعلق الحليبي أمراً طبيعياً.

بمجرد إضافة SDS، حافظ على تجانس محلول استخلاص المكتمل عن طريق تخزينه عند 60 درجة مئوية بعد مرور 10 إلى 15 دقيقة. وبمجرد ذوبان محلول الاستخلاص وتجانسه جيداً، أضف تسعة ملليلتر من محلول الاستخلاص إلى عينة التربة وقم برجها بجهاز الفورتكس لفترة وجيزة وبسرعة منخفضة للمزج. ثم قم بحضن العينة مع محلول الاستخلاص في فرن تهجين عند 65 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.

أثناء فترة التحضين، اقلب الأنابيب بلطف كل 10 دقائق أو قم بتدوير الأنابيب باستمرار عند أدنى سرعة للدوار. خلال التحضين، قد يبدو المحلول لزجاً قليلاً بعد انتهاء العملية. الخطوة التالية هي استخدام الكلوروفورم وكحول الأيزواميل لتنقية الـ DNA من المواد العضوية الموجودة في خليط التحلل.

ابدأ بطرد العينة مركزياً لمدة 10 دقائق بسرعة 1800 Gs عند درجة حرارة تتراوح بين 10 إلى 14 درجة مئوية داخل غطاء السحب، ثم اجمع الطافي الذي يحتوي على الـ DNA عن طريق تمرير طرف الماصة بعناية على طول جانب الأنبوب، مع تجنب الطبقة البيج في الأعلى والطبقة العضوية في الأسفل. انقل الطافي إلى أنبوب سعة 50 مليلتر مبرد مسبقاً يحتوي على 20 مليلتر من الكلوروفورم والكحول (chloroform ISL alcohol or i a a)، بعد ذلك، كرر عملية الاستخلاص مرتين إضافيتين على نفس العينة. وفي هذه الأثناء، احتفظ بمستخلص الـ DNA والكلوروفورم (chloroform i a a) على الثلج داخل غطاء السحب.

لإجراء عملية استخلاص الحمض النووي DNA الثانية، عُد إلى الأنبوب الذي يحتوي على راسب التربة مع ما تبقى من محلول الاستخلاص المنظم، وأضف خمسة ملليلترات إضافية من محلول الاستخلاص المنظم. حرّك المزيج بلطف باستخدام طرف ماصة سعة واحد ملليلتر للمزج، ثم استخدم جهاز الرج vortex لفترة وجيزة لإعادة تعليق الراسب كما تم سابقاً. يتم التحضين هذه المرة عند 65 درجة Celsius لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بإجراء الطرد المركزي عند 1800 Gs لمدة 10 دقائق. وفي درجة حرارة تتراوح بين 10 إلى 14 درجة Celsius تقريبًا داخل غطاء السحب، انقل الطافي إلى الأنبوب الذي يحتوي على الكلوروفورم وكحول الأيزواميل، أو chloroform i a a، والطافي الناتج عن عملية الاستخلاص السابقة. كرر عملية الاستخلاص بأكملها مرة أخرى لاستخلاص أكبر كمية ممكنة من DNA من عينة التربة.

عندما تنتهي من إجراء ما مجموعه ثلاث عمليات استخلاص على عينة التربة، قم برج الأنبوب الذي يحتوي على الطافي المجموع والكلوروفورم برفق شديد على صفيحة دوارة بسرعة 1.25 RRP m لمدة 10 دقائق. بعد خطوة الخلط هذه، قم بإجراء عملية طرد مركزي للأنبوب عند 1800 Gs لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة تتراوح بين 10 و 14 درجة Celsius تقريباً. بعد الطرد المركزي، انقل الطور المائي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي فائق جديد، مع ترك واحد إلى اثنين مللي لتر من SNAT لتجنب تعكير الواجهة بين الطورين المائي والعضوي. الآن، ولترسيب الـ DNA، أضف 0.6 مللي لتر من كحول الإيزوبروبيل.

لكل مللي لتر من السائل الطافي الذي تم جمعه، اقلب الأنابيب برفق عدة مرات للمزج. في هذه المرحلة، قد تتمكن من رؤية ترسب الـ DNA على شكل خيوط طويلة. بعد ذلك، قم بحضن الـ DNA مع الإيزوبروبانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد فترة التحضين، يحين وقت ترسيب الحمض النووي DNA عن طريق الطرد المركزي؛ قم بتحديد زاوية واحدة من الأنبوب عند وضعه في جهاز الطرد المركزي لتعرف الموقع المتوقع لراسبة الـ DNA. قم بالتدوير بسرعة 16,000 GS لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 20 إلى 25 درجة Celsius. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة كحول الإيزوبروبيل عن طريق السكب و/أو الشفط الفراغي. احذر من فقدان راسبة الـ DNA، والتي يتراوح حجمها من غير مرئية تقريباً إلى 9 مليمترات عرضاً، اعتماداً على كفاءة الاستخلاص والكتلة الحيوية في عينات التربة. جفف راسبة الـ DNA في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 5 إلى 20 دقيقة، مع الحرص على عدم تجفيفها بشكل مفرط عندما تصبح الراسبة جافة.

أعد تعليق الـ DNA في 200 إلى 400 µL من te. اخلطه عن طريق النقر الخفيف. انقل محلول الـ DNA إلى أنبوب سعة 1.5 mL.

يُحفظ الـ DNA عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. ومن أجل إذابة الـ DNA تماماً بمجرد استخلاصه من عينة التربة، تُعد الخطوات المتبقية للتحقق من تركيز الـ DNA وسلامته إجراءات قياسية، والتي تم وصفها بالتفصيل في بروتوكول JoVE آخر من مختبر Hallam. يتم تحديد تركيز الـ DNA باستخدام الطريقة التي تختارها.

تحقق أيضاً من سلامة الحمض النووي DNA ذي الوزن الجزيئي العالي عن طريق تشغيل 10 إلى 20 µL من عينة DNA باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ذي المجال النبضي أو PFGE. يجب أن يكون متوسط حجم DNA هو 36 kb أو أكثر اعتماداً على التطبيق اللاحق. انتقل إلى خطوة طرد مركزي تدرج كلوريد السيزيوم التالية، وبدلاً من ذلك، يمكن تخزين DNA في درجة حرارة -20 °C أو -80 °C قبل عملية الطرد المركزي الفائق.

تتمثل الخطوة التالية في استخدام عملية الطرد المركزي بتدرج كلوريد السيزيوم لمزيد من تنقية الحمض النووي DNA عن طريق إزالة الشوائب، يلي ذلك تركيز الحمض النووي DNA وتنقيتة بشكل أكبر باستخدام أجهزة الفلترة بالطرد المركزي AmCon وMicroCon. ويعد الطرد المركزي بتدرج كلوريد السيزيوم مفتاحاً للحصول على DNA عالي الجودة، وقد وُصف بالتفصيل في بروتوكول آخر من JoVE خاص بمختبر Hallam. بعد إتمام خطوات الطرد المركزي بتدرج كلوريد السيزيوم والتركيز، تحقق من تركيز DNA باستخدام الطريقة التي تفضلها.

بعد ذلك، تحقق من سلامة الحمض النووي DNA عالي الوزن الجزيئي مرة أخرى عن طريق تشغيل عينة صغيرة من الـ DNA باستخدام الفصل الكهربائي للهلام ذو المجال النبضي (PFGE). وتتراوح الكمية الإجمالية للحمض النووي الجينومي المستخلص من جرامين من التربة القسرية بين 10 و 180 ميكروغرام، كما هو موضح في عملية الفصل الكهربائي قبل وبعد الطرد المركزي الفائق باستخدام كلوريد السيزيوم. وعادة ما يتراوح نطاق حجم الـ DNA المستخلص بين 40 و 60 كيلو قاعدة، وما يظهر هنا هو مخطط كروماتوغرافي لعينات الحمض النووي الجينومي قبل وبعد الطرد المركزي الفائق باستخدام كلوريد السيزيوم.

تعمل هذه الخطوة على تحسين نقاء DNA، حيث ترفع نسبة 260/280 من 1.3 إلى 1.6 قبل العملية، ومن ثم إلى 1.8 إلى 1.9 بعدها. علاوة على ذلك، فقد تم تقليل ذروة الامتصاص عند 230 nanometers، والتي تشير إلى التلوث بحمض الهيوميك، بنجاح بعد عملية الطرد المركزي. لقد استعرضنا الآن كيفية عزل genomic DNA عالي الوزن الجزيئي من المجتمعات الميكروبية في التربة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير محلول الاستخلاص ومحلول إزالة الطبيعة (denaturing buffer) بدقة وفقاً للتعليمات. وتوخَّ الحذر لعدم لمس قرص الحمض النووي (DNA palate) بعد الترسيب باستخدام الكحول الإيزوبروبيلي. وذلك عند استعادة حزمة الـ DNA بعد عملية الطرد المركزي بتدرج الكلوريد.

لا تنسَ شطف المحقنة بمحلول TE لزيادة استخلاص DNA إلى الحد الأقصى. وأخيراً، تحقق من كمية وجودة DNA المعزول في جميع الخطوات المقترحة. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.