العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

أنا كريستينا سيسو. أنا باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر ديفيد دن وأعمل على الخلايا الجذعية المكونة للدم. سنقوم اليوم بتنقية الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل وسنقوم بزرعها في فأر.

نبدأ برش الفئران بالكحول حتى يبدأ العقل أولا وقبل كل شيء في التعقيم ولا يتداخل الشعر أيضا مع التشريح. نستخدم PBS مع مصل 2٪ للتشريح. قطعت جلد الظهر وأفصل الجلد عن بعضه البعض من أجل كشف الأنسجة.

من أجل عزل الساق ، أمسك الساق بالملاقط. لقد قطعت الوتر أعلى الركبة وقطعت العضلات أسفل الركبة وبعد ذلك قطعت الركبة حتى لا يتم توصيل إصابات الدماغ الرضية ببقية الطرف بعد الآن وأنا أسحبها من أجل عزلها. ثم أمسك السل رأسا على عقب وباستخدام المقص أفصل القدم عن الساق من أجل الحصول على عظم الفخذ.

قطعت العضلات حول عظم الفخذ ثم خلع عظم الفخذ من الورك. من أجل عزل الورك ، قمت بقطع العضلة حول عظم الورك على جانب ذيل الفأر ثم أسحب الورك بعيدا عن جسم الفم من أجل عزل العمود الفقري. قطعت الذيل في أقرب وقت ممكن من بداية الظهر ثم قطعت جانبي العمود الفقري وأسفل العمود الفقري ، محاولا البقاء قريبا قدر الإمكان من العمود الفقري حتى لا يتم قطع الصفاق وترك الأمعاء كما هي.

تتم الجولة الأولى من تنظيف العظام بمشرط يستخدم لكشط العظام والعضلات بعيدا عن العظام. المشرط جيد لتنظيف عظم الفخذ والورك والعمود الفقري. من أجل تنظيف الساق ، أمسكها بالملقط وأستخدم الملقط لإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة.

تتم الجولة الثانية من التنظيف باستخدام مناديل نظيفة لتنظيف العظام تماما خارج العضلات ، وأستخدم المناديل F لتنظيف الساق وعظم الفخذ والوركين. هكذا تبدو العظام. بعد التنظيف ، أفضل 50 أنبوبا مع مرشحات في الأعلى وأقوم بنقل العظام إلى الهاون.

أقوم بإضافة وسائط القسم وسحق العظام التي تسأل عن الجولة الأولى من تحطم العظام. لقد قمت بوضع الخليط في الأنابيب من أجل إطلاق أكبر عدد ممكن من الأنماط في المحلول وتقليل التكتلات. قمت بنقل الخليط على الأنابيب من خلال المرشحات وهذا ما تبدو عليه شظايا العظام بعد الجولة الأولى من التكسير.

لذلك أضيف المزيد من وسيط التشريح إلى شظايا العظام وأقوم بوميضها مرة أخرى. قمت بنقل خليط السيلين إلى الأنابيب من خلال المرشحات وفي هذه المرحلة تكون شظايا العظام المتبقية بيضاء ولم يتبق نخاع عظم. تمتلئ الأنابيب بمصل PBS 2٪ ومن أجل الحصول عليها جميعا بنفس الوزن بحيث تكون متوازنة في جهاز الطرد المركزي ، ولكن أيضا من أجل غسل المرشحات حتى نحصل على أكبر عدد ممكن من الخلايا ، ثم أقوم بالطرد المركزي لخليط الخلية وبعد الطرد المركزي ، يشمل الشعف خلايا نخاع العظم.

أقوم بشفط الوسيط وأتحرك للخلف وللأمام الأنبوب الموجود على الرف بحيث يصبح الأنبوب فضفاضا ويتم تشكيل عدد أقل من المشابك. عندما أقوم بإضافة وسيط ، في هذه المرحلة أقوم بإضافة مل واحد من الوسط لكل أنبوب وأنا أقوم بفرز الخلايا الجذعية المكونة للدم. في وقت لاحق ، سأقوم بتخزين إخراج ALI لأحجام نخاع العظام الإجمالية في هذه المرحلة ، والتي سأستخدمها لاحقا لحقيقة التحكم في اللون الفردي.

أضيف كوكتيل الأجسام المضادة للنسب. أمرت العينات بخلطها جيدا وغزت أربع درجات لمدة 15 دقيقة. في غضون ذلك ، أبدأ في إعداد الأعمدة لتقسيم النسب.

أضع الأعمدة على المغناطيس وأقوم بإعداد أنابيب إيان تحت الأعمدة. لقد قمت أيضا بإعداد PBS الغاز باستخدام مرشح الوجه الأستر وربطه بالمكنسة الكهربائية بحيث تتحرك جميع فقاعات الهواء في الجزء العلوي من الفلتر. ثم أقوم بإضافة ثلاثة مل من DBS الغاز إلى كل عمود حتى يصبح العمود مبللا.

بعد الحضانة بالأجسام المضادة ، أقوم بإضافة وسيط إلى عينات الخلايا وأقوم بالطرد المركزي لها لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. بعد الطرد المركزي ، تكون خلايا البقعة في البليت. أقوم بشفط الوسيط وأعلق البليت في ميل واحد من الغاز PBSI أضف حبوب الشريط ، وأقوم بخلط الخلايا وأحتضن لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات.

بعد الحضانة ، أضع أنابيب elucian جديدة تحت الأعمدة. أقوم بإضافة ملتين من PBS إلى كل أنبوب مع الخلايا وقمت بنقل خليط الخلية إلى العمود من خلال مرشح 40 ميكرون. أغسل الأنابيب بمزيد من الوسط من أجل جمع كل الخلايا المتبقية وأقوم بتطبيق الوسيط المتبقي من خلال المرشحات على الأعمدة.

يتم التلميح إلى سلالة الخلايا السلفية المنخفضة في طرق عرض المجموعة. سحبت العينات المحظورة وأرسلت لها التوفو. لذلك بعد الطرد المركزي ، تكون الخلايا المستنفدة في طبق أبيض.

أقوم بسحب الوسط وإعادة تعليق الخلايا. أقوم بتخزين كمية كافية من الخلايا المستنفدة وأضيف الأجسام المضادة إلى خليط الخلية للفرز وأيضا إلى جميع عناصر التحكم أحادية اللون. يتم تحضين الأجسام المضادة بالحجم لمدة 15 دقيقة في الثلاجة.

بعد التشكيل ، أقوم بإضافة وسيط إلى الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لها لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. بعد الطرد المركزي ، تكون الخلايا في pt ، وأقوم بسحب الوسائط التي أعلق الخلايا وأقوم بنقل الخلايا إلى أنابيب الثعلب بمرشح أزرق. في هذه المرحلة ، تكون الخلايا جاهزة للفرز.

أضع الماوس تحت مصباح التدفئة لبضع دقائق حتى تتمدد الأوردة ويمكن رؤيتها بسهولة أكبر. عند تحضير المحقنة ، عليك أن تكون حريصا على التخلص من جميع الفقاعات من الخليط الموجود في المحقنة ثم ثني الإبرة عند 90 درجة. أضع الفأر تحت كوب زجاجي بوزن في الأعلى حتى يتمكن من الهرب.

أقوم بتعقيم الذيل بضمادة الكحول بحيث يكون موقع الحقن معقما ، ولكن من الأسهل أيضا التعرف على الوريد. إذا نظرت إلى ذيل الفأر من الأعلى في منتصف وأعلى الذيل ، فهناك شريان بينما يوجد على الجانبين الوريد ونقوم بحقن الخلايا في أحد الوريدين. أقوم بإدخال الإبرة في الوريد وأحقن بعد الحقن.

هو الانتظار لبضع ثوان قبل إزالة الإبرة والإبرة وبعد ذلك أقوم بتنظيف جانب الحقن. هذا تمثيل للحقنة مع إبرة بن مثنية عند 90 درجة مع الركبة ، في هذا الكاحل مقارنة بالذيل ، مما يجعل الحقن أسهل. عند حقن ذيل الفأر ، عليك أن تضع في اعتبارك أن وريد الذيل سطحي للغاية ، لذلك هذا هو اتجاه الإبرة مقارنة بالذيل.

ويبدو أنك ستستمر في الانزلاق فوق الذيل ، لكنك في الواقع ستدخل في الذيل بعد ذلك. أنا كريستينا سيسو. أنا وظيفة في مختبر ديفيد كادن ، وأعمل على الخلايا الجذعية المكونة للدم.

عادة ما أستخدمها للحيوانات في البداية ، وكان لدي المزيد من التباين في البداية ، ولكن بمجرد أن تصبح متسقا مع أساليبك ، أحصل باستمرار على حوالي 50،000 إلى 60،000 خلية جذعية للفئران. حصلت على درجة الدكتوراه في لندن مع الدكتورة فيونا وات التي تعمل على الخلايا الجذعية الجلدية. بعد ذلك ، أردت فقط أن يكون لدي معرفة أوسع بالخلايا الجذعية البالغة في الأنسجة المختلفة ، ولذا قررت الانتقال إلى مختبر ديفيد كادن للعمل على الخلايا الجذعية المكونة للدم ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن الأشياء المعروفة عن الخلايا الجذعية المكونة للدم هي الأشياء غير المعروفة للخلايا الجذعية للبشرة وعدد من المقايسات التي يمكن إجراؤها باستخدام epi.

لم يتم الانتهاء من الخلايا الجذعية للبشرة بعد مع الخلايا الجذعية المكونة للدم ، ولذا في هذه المرحلة أحاول تجميع المعرفة من المجالين المختلفين ، وفي النهاية أنا مهتم بدراسة آلية تنظيم مستشعرات الأنسجة البالغة بشكل عام ، لذلك ليس فقط البشرة أو الخلايا الجذعية ، ولكن أيضا أنسجة مختلفة نظرا لوجودها ، هناك آلية متشابهة ، وهي دائما نفس الجينات التي تشارك في التنظيم والتي تتفاعل مع بعضها البعض بطرق مختلفة ، ومن المثير للاهتمام أن نفهم ما الذي يجعل كل خلية جذعية جذعية ، ولكن في النهاية خلية جذعية في نسيج مختلف. مما يؤدي إلى ظهور بروتين مختلف.