Electrospinning السقالات بوليمر الليفية للهندسة الأنسجة والخلايا الثقافة

يعرض هذا الفيديو عملية الغزل الكهربائي للبوليمرات، وهي تقنية شائعة في هندسة الأنسجة وزراعة الخلايا لإنشاء سدائل ليفية تحاكي بنية ومقياس حجم المصفوفة خارج الخلوية الطبيعية. نقوم هنا بالغزل الكهربائي لحمض الهيالورونيك النشط ضوئياً والقادر على التشابك عند التعرض للضوء، كما نطرح تطبيقات معالجة إضافية مثل التشكيل الضوئي، وهي عملية تعمل على إنشاء قنوات وسدائل ومسامية متعددة المقاييس لزيادة الارتشاح الخلوي وتوزيع الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، نستخدم تكوين سدائل من بوليمرات متعددة تسمح بالغزل الكهربائي لبوليمرين مختلفين في نفس الحصيرة، مما يتيح ضبط ميكانيكا السدالة وتحللها، وتفصيل المسامية بما يتناسب مع الارتشاح الخلوي.

مرحباً، أنا جيمي كوفي من مختبر جيسون بيرديك في قسم الهندسة الحيوية بجامعة بنسلفانيا. ومرحباً، أنا هاريني سوين، أيضاً من مختبر بيرديك. سنعرض لكم اليوم إجراءً للغزل الكهربائي لسقالات الألياف المستخدمة في هندسة الأنسجة.

سنقوم أيضاً بتقديم قدرات المعالجة الإضافية الخاصة بالتنميط الضوئي وتكوين السقالات متعددة البوليمرات. نحن نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لدراسة تفاعلات وتغلغل خلايا HMSE في سقالات حمض الهيالورونيك. كما نستخدم هذه التقنيات مع بوليمرات أخرى مختلفة لدراسة الأنسجة المعززة بالألياف مثل الغضروف الهلالي وعضلة القلب.

لنبأ الآن. قم بتحضير محلول من البادئ الضوئي بتركيز 0.5% من الوزن. أقوم بإذابة Irgacure 2959 أو I 2959 في ماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لعدة أيام.

يُستخدم I cure إذا كانت هناك حاجة إلى بوليمر تفاعلي ضوئي لعملية الغزل الكهربائي. لتحضير محلول الغزل الكهربائي، يتم دمج التراكيز النهائية في ماء منزوع الأيونات: 2%weight من حمض الهيالورونيك الميثيلي أو MEHA، و3%weight من بولي إيثيلين أكسيد أو PEO، ومحلول 0.05%weight I 2 9 5 9، ثم يتم الخلط باستخدام جهاز vortex لمدة خمس دقائق والتحضين عند 37 degrees Celsius طوال الليل. لإذابة المحلول، يتم نقل المحلول إلى سرنجة وتوصيل إبرة ذات طرف غير مدبب قياس 18 gauge وطول ست بوصات في طرفها.

بعد ذلك، استخدم مضخة حقنة واضبطها على معدل دفع قدره 1.2 milliliters per hour. أدخل إبرة محرك الحقنة في مضخة الحقنة. ثم قم بتوصيل السلك المؤرض لمصدر طاقة عالي الجهد بجهاز التجميع.

في هذا الإجراء، سنستخدم محوراً دواراً بسرعة تبلغ حوالي 10 meters per second. ولجمع الألياف المصطفة، قم بتوصيل السلك الموجب بالشحنة بالإبرة، ثم اضبط الإبرة أو جهاز الجمع بحيث تكون المسافة بينهما 15 centimeter. ابدأ تدفق مضخة السرنجة، وعندما يظهر السائل على طرف الإبرة، قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط الجهد الكهربائي على 22 kilovolts.

اجمع الألياف على السقالة حتى يتم الوصول إلى السمك المطلوب. يعتمد وقت الجمع على السمك المطلوب وحجم محلول الغزل الكهربائي المستخدم. بالنسبة للنمذجة الضوئية، نستخدم حصائر مغزولة كهربائياً لمدة 16 ساعة.

قم بإزالة السقالة من جهاز التجميع بعد اكتمال عملية التجميع، واحفظها تحت تفريغ هوائي طوال الليل لضمان الإزالة الكاملة للمذيب. باستخدام مقص، قم بقص عينات بقياس 5 mm في 5 mm من حصيرة السقالة. ضع كل سقالة على شريحة زجاجية مغطاة بورق القصدير للتحضير لعملية الربط التشابكي، وضع قناع الضوء مباشرة فوق السقالة، ثم غطها بشريحة زجاجية نظيفة وثبت طرفي الشريحة باستخدام مشابك الورق.

باستخدام غرفة نيتروجين، قم بتطهير السقالة لمنع تقليل التشبيك الناتج عن التعرض للأكسجين. ضع تجهيزات السقالة في غرفة النيتروجين تحت ضوء بطول موجي 365 nanometer وبقدرة حوالي 10 milliwatts per centimeter square مع استخدام محول تجميع لمدة خمس دقائق. أخرج كل سقالة وضعها في طبق زراعة أنسجة مكون من 12 بئراً.

أضف 2 mL من الماء منزوع الأيونات إلى كل بئر. قم بتغطية الطبق لمنع تبخر الماء وضعه في درجة حرارة 37 °C لمدة 24 ساعة. قم بتغيير الماء كل ثماني ساعات باستخدام ماصة تفريغ لسحب الماء منزوع الأيونات من البئر بين عمليات الغسيل.

قم بتحضير محلول من PEO بتركيز 5% وزني في إيثانول بتركيز 90% باستخدام لوح تسخين. قم بالتقليب بسرعة 700 RPM عند درجة حرارة 50 °C لمدة ساعتين على الأقل قبل البدء في الإجراء. بعد التقليب، أضف DPI ليصل التركيز النهائي إلى 10 µg/mL.

انقل محلول PEO و DPI إلى حقنة سعة ثلاثة ملليلتر وقم بتغليفها بورق الألومنيوم لحمايتها من الضوء. بعد ذلك، قم بتحضير محلول الغزل الكهربائي الموضح في القسم الثاني وأضف methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B بتركيز نهائي قدره 25 micromolar باستخدام الماصة الدقيقة في حقنة سعة ثلاثة ملليلتر. ثم غلفها بورق الألومنيوم لحمايتها من الضوء.

استخدم شريطاً لاصقاً بعناية لتثبيت حواف شرائح زجاجية تغطية ميثيلية بمقاس 22 مليمتر في 22 مليمتر على سطح المندريل، بحيث تحيط الشرائح الزجاجية بمحيط المندريل. وباستخدام قطعة من أنبوب سيليكون بطول خمسة مليمتر، قم بتوصيل أحد طرفيها بإحدى المحاقن المزودة بوصلات Lure lock. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر بإبرة، وأدخل المحقنة في مضخة المحاقن ومرر الإبرة عبر الفتحة الموجودة في المروحة.

تنتقل المراوح على طول محور الدوران وتُستخدم لضمان توزيع متساوٍ لكلا البوليمرين في السقالة الناتجة. تأكد من تمركز رؤوس الإبر على محور الدوران بالنسبة للمحقنة التي تحتوي على MEHA. حدد موقع رأس الإبرة على مسافة 15 سنتيمتر من محور الدوران واضبط المروحة على مسافة ستة سنتيمتر من رأس الإبرة.

برمج مضخة السرنجة لتقديم 1.2 milliliters في الساعة واضبط مصدر الطاقة على 22 kilovolts. جهز السرنجة التي تحتوي على PEO بنفس الطريقة تماماً، ولكن ضع طرف الإبرة على مسافة 10 centimeters من mandrel واضبط مصدر الطاقة على 15 kilovolts. بعد ذلك، أطفئ الأنوار وقم بتشغيل mandrel ومضخات السرنجة.

قم بإزالة رقائق الألومنيوم من المحاقن عندما يصبح السائل مرئياً على أطراف كلتا الإبرتين. قم بتشغيل وحدات تزويد الطاقة في نفس الوقت وتوصيل المراوح بالكهرباء عند اكتمال عملية الجمع. أوقف تشغيل وحدات تزويد الطاقة والمغزل وافصل المراوح بعناية.

قم بإزالة شرائح الغطاء والشريط اللاصق باستخدام شفرة حلاقة. يمكن معاينة الألياف باستخدام مجهر فلوري مجهز بمرشحات لـ rumine و dpi. ضع كل شريحة غطاء مثبت بها بوليمر electro spon في بئر منفرد من طبق سداسي.

صفيحة الآبار؛ قم بحضن السقالات في 2 mL من PBS طوال الليل لضمان الإزالة الكاملة للمذيب والملوثات. بعد 24 ساعة، استخدم الشفط بالتفريغ لسحب PBS من صفيحة الآبار، ثم ضع السقالات تحت مصباح UV مبيد للجراثيم في خزانة التدفق الصفائحي لمدة 30 دقيقة. للتعقيم، قم بإجراء زراعة خلوية قياسية وجهز معلقاً خلوياً مركزاً بكثافة الخلايا المطلوبة.

على سبيل المثال، استخدم 100 milliliters من معلق الخلايا لغطاء شريحة بمقاس 22 by 22 millimeter. ضعها في الحاضنة لمدة ساعة واحدة. أضف الكمية المناسبة من وسط زراعة الخلايا إلى كل منها.

ضع السقالات مرة أخرى في الحاضنة. صبغ الخلايا باستخدام طقم تحديد الخلايا الحية والميتة المتاح تجارياً من شركة Invitrogen لتصور الخلايا والألياف باستخدام مجهر فلوري مجهز بمرشحات لـ trissy و fitzy؛ حيث يُتوقع أن تظهر السقالات التي جُمِعت على لوحة مسطحة مؤرضة أليافاً موزعة عشوائياً، بينما تظهر السقالات التي جُمِعت على مغزل دوار أليافاً منظمة.

لإنتاج ألياف محاذية عند فحصها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح أثناء عملية الربط التشابكي الضوئي للسقالة، نضع قناعاً ضوئياً بين السقالة ومصدر الضوء بعد غمر السقالة في ماء منزوع الأيونات و ha غير تفاعلي. المناطق المحجوبة عن الضوء يتم فيها إزالة PEO، ونلاحظ تشكل مسامات كبيرة كما يتضح من الصبغة الفلورية. ويؤدي الغزل الكهربائي المتزامن لنفاثات MEHA و PEO إلى إنتاج سقالة مركبة تحتوي على مجموعات ألياف متميزة تتكون من البوليمرات الفردية.

يبدو أن الخلايا العضلية القلبية (HMCs) تتفاعل بشكل إيجابي مع الألياف. فهي لا تظل حية فحسب، كما هو واضح من الصبغة الخضراء، بل يبدو أيضاً أنها تتوجه لتنظيم نفسها بحيث تكون محاذية للألياف الحمراء. لقد عرضنا لكم للتو كيفية غزل ألياف السقالات كهربائياً لهندسة الأنسجة.

لقد قدمنا أيضاً إمكانيات إضافية مثل التنميط الضوئي والغزل الكهربائي لمتعددات البوليمر. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحسين معاملات الغزل الكهربائي لكل بوليمر لتكوين ألياف منتظمة قبل محاولة إجراء أي تجارب إضافية. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.