تشريح 6.5 أجنة الفئران DPC

اسمي كيلي شيا، وأنا مديرة المختبر وفنية أبحاث في مختبر نيلسن. إن الأمر صعب للغاية لأن الكثير من الأشخاص لا يعرفون كيفية التمييز بين طبقات الأنسجة المختلفة. لذا، ما يجب عليك فعله أساساً هو تقشير جميع طبقات الأنسجة للكشف عن الجنين الموجود تحتها، والذي لا يكون في هذه المرحلة وعائياً بشكل كبير؛ لذا فهو شفاف جداً ويصعب تمييزه.

استخدم ملقطاً ومقصاً ذوي حواف غير حادة. أول خطوة يجب القيام بها هي قرص الحيوان عند الخط الناصف تماماً، ثم البدء بإجراء الشق الأول. ومن تلك النقطة، يمكنك ببساطة سحب الجلد بعيداً للكشف عن منطقة البطن لدى الحيوان.

هناك طبقة رقيقة من الصفاق ستقوم بسحبها باستخدام الملقط، ومن ثم يمكنك قصها بالمقص وثنيها للخلف. ويجب القص على طول خط المنتصف للحيوان وفصل قرني الرحم اللذين يتصلان في المنتصف. يمكنك القص مباشرة عند القاعدة.

من المحتمل أن تحصل على كمية كبيرة من الدهون معها. قم بأخذ قرن الرحم كاملاً من الحيوان، ثم ضعه مباشرة في محلول PBS.

هذا هو الموجود في القرن. وهذه هي مواقع الزرع: 1، 2، 3، 4، 5. كل ما عليك فعله هو مجرد فصلها عن بعضها البعض.

يمكنك ببساطة القص بين مواقع الانغراس هنا. يمكنك إمساك الجنين من جانبه، ثم فصله بعناية. في هذه المرحلة، ستكشف عن الـ deum، وهي أنسجة أكثر إسفنجية تقع تحته.

وبذلك يجب أن يكون الجنين في المنتصف تماماً، هنا. هذه هي قمة السويدة. يجب توجيهه بحيث تكون القمة للأعلى.

ما ستقوم به في النهاية هو قص حوالي خمس المسافة نزولاً من القمة. يجب أن يكون الجنين مستقراً في المنتصف تماماً هنا. ما أفعله هو توجيهه بشكل جانبي، واستخدام زوج من الملاقط للإمساك به، وتثبيته بالزوج الآخر، ثم قص طرفه، وبعد ذلك فصله.

بمجرد إزالة الغطاء، أوقف الجنين على حافته. وكما تلاحظون، توجد فتحة مباشرة عند مكان إزالة الغطاء. كل ما عليك فعله هو إدخال الملقط هناك. نعم.

وفي هذه المرحلة، يكون الجنين مستقراً بشكل غير محكم داخل الـ deum. وبمجرد فتح الـ deum، يمكنك إخراجه بسهولة نسبية طالما تمكنت من الوصول إلى المنطقة أسفل قاعدته. فهو صغير جداً.

هناك أيضاً بعض الأنسجة التي لا تزال متصلة بالجنين. لديك المخروط المشيمي الخارجي (ecto placental cone)، الموجود هنا تماماً عند قمة الجنين. كما يوجد أيضاً بعض الأنسجة الأخرى التي لا تزال متصلة.

لذا، أقوم ببساطة باستخدام الماصّة لسحب الجنين. وفي هذه المرحلة، يجب تثبيت الأجنة، لذا سأستخدم طبقاً يحتوي على PFA.

أردنا دراسة الجينات المرشحة. نحن نستخدم بشكل أساسي تقنيات تهجين الحمض النووي الريبي الموضعي في العينات الكاملة (whole mount RNA in situ) لتصور إنتاج الأحماض النووية في موقعها داخل الجنين. إن هذه الجينات المحددة التي نهتم بها للغاية تشفر علامات مفترضة لسليفات الخلايا الجرثومية، كما يُتوقع أن يتم التعبير عنها في جنين الفأر عند نقطة زمنية محددة تساعد الخلايا الجرثومية على التطور والنضج من سليفات الخلايا الجرثومية المفترضة إلى خلايا جرثومية.

أحد هذه العوامل التي نهتم بها كثيراً في البداية، وهو العامل الأول الذي أجرينا عليه صبغة التهجين الموضعي على كامل الجنين (whole mount in situ) في هذه الأجنة في اليوم 6.5، هو البروتين المكون للعظم 4 BMP four. وهو عضو في عائلة TGF-beta الفائقة، ويعد عاملاً بالغ الأهمية ومطلوباً بشكل مطلق في نضج الخلايا الجرثومية.

كما يتطلب الأمر أن تنتقل الخلايا الجرثومية عبر الجنين وتستقر بالقرب من الخط البدائي للجنين. ويلعب BMP four دوراً حاسماً في كل من إشاراته وعملية النضج التي يجب أن تمر بها الخلايا الجرثومية لكي تستقر في الخط البدائي. لذا، عليك أولاً التأكد من معرفة ما تبحث عنه، ومعرفة مدى صغر حجمه، والمقياس الذي تعمل به، وكذلك الجلوس والتخطيط بدقة شديدة.

تعتمد هذه التقنية، بشكل خاص، على نوع المجهر التشريحي الذي ستستخدمه. وتتمثل إحدى الصعوبات التقنية في أن هذه العملية تتطلب الكثير من المناولة وحركات يد ثابتة للغاية لتجنب إتلاف الجنين. لذا، يُفضل استخدام مجهر تشريحي يوفر مساحة واسعة للمناولة، كما يجب التأكد من تجهيز كافة المستلزمات الضرورية للتجربة مسبقاً، بحيث لا تضطر إلى القيام بأي مناولات إضافية غير ضرورية أثناء عملية التشريح.

وبخلاف ذلك، أعتقد أنك بحاجة إلى المضي ببطء شديد وإزالة طبقات الأنسجة الفردية ببطء شديد حتى تكون على دراية بما تتعامل معه، والتأكد من معرفة موقع الجنين.