مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة

يُعبّر خط ذبابة الفاكهة (Drosophila) المعدل وراثياً والجديد، IRFP Reporter، عن البروتين الفلوري الأحمر أو RFP في خلايا محددة في القرص التخيلي I. ويمكن لهذا الخط المعدل وراثياً أن يساعد في تحديد وتشريح ووسم أنواع محددة من الخلايا في العين النامية. ولتشريح القرص التخيلي للعين، يتم إزالة اليرقات في المرحلة الثالثة المتجولة من جانب القارورة باستخدام ملعقة مسطحة (spatula).

يتم بعد ذلك وضع اليرقات في قطرة من PBS على طبق sill guard. تُزال أجزاء الفم الملتصقة بها أقراص العين من بقية اليرقة باستخدام الملاقط، ثم تُنقل أقراص العين إلى شريحة حيث يتم تشريحها وفصلها عن أجزاء الفم والدماغ. مرحبًا، أنا آمنة كول من مختبر جوزيف بيتمان في مركز وولفسون للأمراض المرتبطة بالعمر، كينجز كوليدج لندن.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لكيفية تشريح أقراص العين التخيلية من ذبابة Drosophila. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الجينات المشاركة في التكون العصبي. لذا، فلنبدأ.

لبدء تشريح أقراص تخيل العين، ضع قطرة من PBS على طبق بتري مغطى بطبقة من Syl Guard. تحت مجهر التشريح، ستساعد طبقة Syl Guard في حماية الملاقط من التلف أثناء عملية التشريح. بعد ذلك، وباستخدام ملعقة مسطحة (spatula)، خذ يرقة في طور اليرقة الثالث (third instar larva) وضعها في قطرة PBS. وبإمساك ملاقط في كل يد، أمسك اليرقة بملاقط واحدة عند ثلثي المسافة باتجاه الطرف الخلفي. الآن، استخدم مجموعة الملاقط الأخرى للإمساك بأجزاء الفم داكنة اللون عند الطرف الأمامي لليرقة.

اسحب اليرقة بلطف عن طريق تحريك الملاقط بعيداً عن بعضها البعض. يجب أن تنفصل أجزاء الفم عن بقية الجسم مع بقاء معقد العين والدماغ ملتصقاً بها. بعد ذلك، ضع قطرة من PBS على شريحة وانقل الأقراص إلى قطرة PBS عن طريق الإمساك بأجزاء الفم.

انتقل الآن إلى وضع الفلورة في المجهر التشريحي؛ وبما أن الأقراص التخيلية للعين هي الوحيدة التي تعبر عن RFP، فيمكن تحديدها بسهولة كنسيج فلوري أحمر يغطي الفصوص البصرية الكروية لزيادة تباين الأقراص. وجه مصدر الضوء البارد بالألياف الضوئية بزاوية مائلة تجاه الشريحة. ترتبط الأقراص التخيلية للعين بالفصوص البصرية عبر السويقة البصرية من الناحية الخلفية، وبأجزاء الفم عبر سويقة قادمة من قرص الهوائي من الناحية الأمامية.

لتشريح أقراص العين التخيلية، أمسك الأجزاء باستخدام زوج واحد من الملاقط واستخدم الزوج الآخر لفصل أقراص العين التخيلية عن دماغ اليرقة. بعد ذلك، افصل أقراص العين التخيلية عن أجزاء الفم. وبمجرد فصل أجزاء الفم عن أقراص العين التخيلية، قم بإزالتها من الشريحة.

يجب أن تستقر أقراص العين التخيلية الآن بشكل مسطح على الشريحة، ويجب أن تكون خالية من أي أنسجة زائدة بما في ذلك أنسجة الدماغ. استمر في تشريح بقية أقراص العين التخيلية. وبمجرد الانتهاء من تشريح جميع أقراص العين التخيلية، أمل الشريحة برفق واستخدم قطعة صغيرة من المناديل الورقية لتجفيف فائض الـ PBS.

أضف الآن قطرة من وسط التثبيت vector shield ثم ضع غطاء الشريحة بلطف في الأعلى. أصبحت الأقراص الآن جاهزة للتصوير إما باستخدام المجهر الفلوري العاكس (epi fluorescence) أو المجهر البؤري (confocal microscopy). وإذا كان التصوير سيتم في وقت لاحق، تُخزن الشريحة عند درجة حرارة 4 °C.

سيبقى البروتين الفلوري الأحمر (RFP) مرئياً لمدة سنة واحدة على الأقل؛ وعند التصوير، يجب الحصول على صور Z Series باستخدام مجهر confocal أو مجهر Zeiss aome بتباعد قدره 1 micrometer باستخدام عدسة 20 x أو 40 x، ومن ثم يمكن إنشاء صور الإسقاط باستخدام برنامج المجهر. تم تشريح الأقراص التخيلية للذباب الذي يعبر عن IRFP وصبغها بـ Phin، ثم أُجري التصوير باستخدام مجهر zes aome بتباعد قدره 1 micrometer باستخدام عدسة 20 x. وتظهر خلايا قرص العين، التي تعبر عن RFP، باللون الأحمر.

يتم تصور الثلم المورفوغيني عن طريق الصبغ والتلوين ويظهر باللون الأخضر. تكون الأقطاب الظهرية والبطنية لقرص العين منحنية وتميل إلى الانطواء. يمكن استبعاد هذه المقاطع من صورة الإسقاط النهائية.

على الرغم من أن القرص عبارة عن ظهارة أحادية الطبقة، إلا أن المواقع المتغيرة للنوى تتطلب استخدام إسقاط السلسلة Z (Z Series projection) للحصول على صورة عامة للقرص. ونظرًا لأن المراسل IRFP يتمركز في النواة، فإن النمط الظاهر هنا يمثل التعبير النووي لـ RFP. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تنفيذ إجراء تشريح أقراص العين المهبلية من ذبابة الدروزوفيلا drosophila.

عند استخدام هذا الإجراء، يفضل استخدام ملقط دقيق، ومن المستحسن أيضاً تجنب شرب القهوة في هذه المرحلة. شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في جميع تجاربكم.