Name: مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة /em (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: تعلم تقنية فصل أقراص العين التخيلية في ذبابة الفاكهة باستخدام مراسل البروتين الفلوري الأحمر. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد أنواع الخلايا المحددة أثناء تطور العين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل كينجز كوليدج بلندن ، والجمعية الملكية.

<ol&gt;<li&gt; المركز الأول انخفاضا من برنامج تلفزيوني على طبق Sylgard تشريح تحت المجهر.</li&gt;<li&gt; إزالة عدة التالي تجول اليرقات طور مرحلي الثالث من قنينة أو زجاجة باستخدام ملعقة ووضعها في برنامج تلفزيوني.</li&gt;<li&gt; للبدء في استخدام الملقط تشريح يدك اليسرى (إذا كنت الحق وسلم) لفهم إن يرقة من ثلثي الطريق نحو الخلفي ومن ثم استخدام هذا الزوج أخرى لعقد الظلام السنانير الفم الملونة في نهاية الأمامي.</li&gt;<li&gt; الآن برفق اليرقة وبصرف النظر عن طريق تحريك كل من أزواج من ملاقط بعيدا عن بعضها البعض. يجب أن يأتي بعيدا من فمها بقية الجسم مع مجمع العين / الدماغ المرفقة.</li&gt;<li&gt; إلى وصمة عار على أقراص لإصلاح العين المناعي الأقراص عند هذه النقطة عن طريق وضعها في بارافورمالدهيد 4 ٪ / برنامج تلفزيوني عن حل 30-45 دقيقة على الجليد. ثم يغسل الأقراص أربع مرات مع وصمة عار PBST ثم مع الأجسام المضادة المناسبة.</li&gt;<li&gt; ومن الأسهل لتشريح العين الأقراص مباشرة على الشريحة. وضع قطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة ونقل الأقراص إلى تراجع في برنامج تلفزيوني عن طريق عقد فمها.</li&gt;<li&gt; تخيلي والأنسجة وشفافة وذلك في أول أقراص العين يصعب التعرف عليها. ليسهل التعرف عليهم استخدام المجهر مع القدرة على تشريح مضان. ويمكن استخدام العين مراسل RFP سطر تكون أقراص العين رؤيتها بوضوح في الانسجة أحمر فلوري تتراكب مع فصوص كروية البصري (الشكل 1).</li&gt;<li&gt; إذا كنت تستخدم الألياف البصرية المباشرة الباردة مصدر الضوء ضوء بزاوية مائلة إلى الشريحة ، وهذا سوف يتيح للأقراص أكبر التباين. وترد الأقراص العين / antennal إلى فصوص البصرية عبر السويقة البصرية في الخلفية وعلى فمها عبر السويقة القادمة من القرص antennal في الأمامية.</li&gt;<li&gt; لتشريح العين الأقراص الاستمرار على فمها باستخدام زوج واحد من واستخدام ملاقط الزوج الآخر لفصل أقراص العين من الدماغ اليرقات. فصل المقبل أقراص العين من فمها. أخيرا إزالة الشريحة من فمها وهذه يمكن أن تمنع ساترة من الاستلقاء.</li&gt;<li&gt; عندما يكون لديك كل تشريح العين أقراص مغطاة الشريحة بلطف والجافة قبالة PBS الزائدة. ثم تضاف قطرة من Vectashield ومكان بلطف ساترة على القمة.</li&gt;<li&gt; الأقراص هي الآن جاهزة للتصوير المجهري إما epifluorescence مبائر أو (الشكل 2).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"نتائج الممثل&gt;</p&gt;<p class="jove_content"&gt; عند تشريح بشكل صحيح يجب على القرص العين / antennal الاستلقاء على الشريحة واضحة من أي نسيج دخيلة مثل الدماغ. مقوسة القطبين الظهرية والبطنية من القرص العين وتميل إلى أضعاف ذلك ، ولكن يمكن تجنب ذلك عن طريق اتخاذ سلسلة Z - مبائر على المجهر وحذف هذه المقاطع من الإسقاط. على الرغم من أن القرص هو ظهارة المونولاير مواقف متغير من نوى يتطلب إسقاط Z - سلسلة للحصول على صورة شاملة للقرص. ويرد الإسقاط من العين العين النموذجية RFP / القرص antennal المتخذة بشأن المجهر مبائر في الشكل 2. نحن نأخذ عادة 1 ميكرون المقاطع من خلال القرص باستخدام عدسة 20X أو 40X. المراسل العين RFP المترجمة النووية وذلك مع النمط الذي شهدناه في الشكل رقم 2 يمثل نواة الخلايا معربا عن RFP.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="figure 1" /<br /<strong&gt; الشكل 1. الأولي تشريح العين / المعقدة الدماغ من العين الثالثة ، يرقة ذبابة الفاكهة RFP طور مرحلي.</strongويمكن رؤية&gt; العين / القرص تخيلي antennal (المبين) التي تعلق على فمها (MP) ، وتتراكب الفص البصري (ر) في الدماغ. لقد التقطت الصورة باستخدام المجهر مضان تشريح لإظهار التعبير RFP في القرص العين. الأمامي وإلى اليسار. شريط الحجم : 300 ميكرومتر.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="figure 2" /<br /<strong&gt; الشكل 2. التعبير لمراسل RFP العين في العين القرص تخيلي.</strong&gt; طور مرحلي العين الثالثة (ED) / القرص antennal (م) من تشريح العين اليرقة RFP عرض RFP التعبير (الحمراء). وكان القرص مع الملون phalloidin (الأخضر) ، والتي بقع أسطح الخلية قمية ويظهر ثلم التخلق (رأس السهم). وأعرب عن طلب تقديم العروض في الخلايا السليفة حول القوة المتعددة الجنسيات ، في مبصرات 1،6،7 والخلايا المخروطية. الأمامي وإلى اليسار. شريط الحجم : 25 ميكرون.</p

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

تشريح العين القرص تخيلي ذبابة الفاكهة واضح ومباشر ، ولكن يمكن أن يستغرق وقتا طويلا لاتقان. الخطوات الحاسمة هي تحديد القرص تشريح العين وبعيدا عن الدماغ اليرقات. يتم تحديد القرص العين أسهل باستخدام خط العين RFP الموصوفة هنا. التعديلات الممكنة لإزالة القرص أو الغشاء antennal peripodial ، أو ترك الفص البصري المرفقة تصور المحاوير PR دخول الدماغ. تم إنشاء خط العين RFP عن طريق الاستنساخ رواية عنصر العين محددة م...

مراسل rfp رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العين هو النظام النموذجي قوية لدراسة مجالات مثل تنبيغ الخلايا العصبية الإشارات ، وتنكس عصبي. جعل العديد من الاكتشافات التي تستخدم هذا النظام استفاد من طبيعة spatiotemporal التمايز مبصرة في القرص العين النامية تخيلي. لاستخدام هذا النظام فإنه من الضروري أولا للباحث لتعلم لتحديد وتشريح العين القرص. وصفنا مراسل RFP رواية للمساعدة في التعرف على القرص العين وتصور أنواع معينة من الخلايا في العين النامية. نحن بالتفصيل منهجية لتشريح العين القرص تخيلي من اليرقات طور مرحلي الثالث وتصف كيف مراسل RFP العين يمكن ان تساعد في هذا التشريح. وأعرب فقط هذا المراسل RFP العين في العين ويمكن تصور باستخدام المجهر مضان إما في الأنسجة الحية أو بعد التثبيت دون الحاجة إلى تضخيم الإشارات. علينا أن نبين كيف يمكن استخدام هذا المراسل لتحديد أنواع خلايا معينة داخل القرص العين. وهذا البروتوكول ، واستخدام لمراسل العين RFP الباحثون باستخدام المساعدات<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العين لمعالجة مسائل جوهرية البيولوجية الهامة.

وصفنا أحمر فلوري رواية البروتين (RFP) المراسل ان يتم التعبير عن وتحديدا في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العين. نحن بالتفصيل منهجية لتشريح العين تخيلي القرص ، وكيف يمكن استخدام هذا المراسل للمساعدة في تشريح وتحديد أنواع معينة من الخلايا في العين النامية.

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

تُعد عين ذبابة الفاكهة (Drosophila) نظاماً نموذجياً فعالاً لدراسة مجالات مثل التكون العصبي، ونقل الإشارات، والتحلل العصبي. وقد تم التوصل إلى العديد من الاكتشافات...

يُعبّر خط ذبابة الفاكهة (Drosophila) المعدل وراثياً والجديد، IRFP Reporter، عن البروتين الفلوري الأحمر أو RFP في خلايا محددة في القرص التخيلي I. ويمكن لهذا الخط المعدل وراثياً أن يساعد في تحديد وتشريح ووسم أنواع محددة من الخلايا في العين النامية. ولتشريح القرص التخيلي للعين، يتم إزالة اليرقات في المرحلة الثالثة المتجولة من جانب القارورة باستخدام ملعقة مسطحة (spatula).يتم بعد ذلك وضع اليرقات في قطرة من PBS على طبق sill guard. تُزال أجزاء الفم الملتصقة بها أقراص العين من بقية اليرقة باستخدام الملاقط، ثم تُنقل أقراص العين إلى شريحة حيث يتم تشريحها وفصلها عن أجزاء الفم والدماغ. مرحبًا، أنا آمنة كول من مختبر جوزيف بيتمان في مركز وولفسون للأمراض المرتبطة بالعمر، كينجز كوليدج لندن.سنعرض لكم اليوم إجراءً لكيفية تشريح أقراص العين التخيلية من ذبابة Drosophila. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الجينات المشاركة في التكون العصبي. لذا، فلنبدأ.لبدء تشريح أقراص تخيل العين، ضع قطرة من PBS على طبق بتري مغطى بطبقة من Syl Guard. تحت مجهر التشريح، ستساعد طبقة Syl Guard في حماية الملاقط من التلف أثناء عملية التشريح. بعد ذلك، وباستخدام ملعقة مسطحة (spatula)، خذ يرقة في طور اليرقة الثالث (third instar larva) وضعها في قطرة PBS. وبإمساك ملاقط في كل يد، أمسك اليرقة بملاقط واحدة عند ثلثي المسافة باتجاه الطرف الخلفي. الآن، استخدم مجموعة الملاقط الأخرى للإمساك بأجزاء الفم داكنة اللون عند الطرف الأمامي لليرقة.اسحب اليرقة بلطف عن طريق تحريك الملاقط بعيداً عن بعضها البعض. يجب أن تنفصل أجزاء الفم عن بقية الجسم مع بقاء معقد العين والدماغ ملتصقاً بها. بعد ذلك، ضع قطرة من PBS على شريحة وانقل الأقراص إلى قطرة PBS عن طريق الإمساك بأجزاء الفم.انتقل الآن إلى وضع الفلورة في المجهر التشريحي؛ وبما أن الأقراص التخيلية للعين هي الوحيدة التي تعبر عن RFP، فيمكن تحديدها بسهولة كنسيج فلوري أحمر يغطي الفصوص البصرية الكروية لزيادة تباين الأقراص. وجه مصدر الضوء البارد بالألياف الضوئية بزاوية مائلة تجاه الشريحة. ترتبط الأقراص التخيلية للعين بالفصوص البصرية عبر السويقة البصرية من الناحية الخلفية، وبأجزاء الفم عبر سويقة قادمة من قرص الهوائي من الناحية الأمامية.لتشريح أقراص العين التخيلية، أمسك الأجزاء باستخدام زوج واحد من الملاقط واستخدم الزوج الآخر لفصل أقراص العين التخيلية عن دماغ اليرقة. بعد ذلك، افصل أقراص العين التخيلية عن أجزاء الفم. وبمجرد فصل أجزاء الفم عن أقراص العين التخيلية، قم بإزالتها من الشريحة.يجب أن تستقر أقراص العين التخيلية الآن بشكل مسطح على الشريحة، ويجب أن تكون خالية من أي أنسجة زائدة بما في ذلك أنسجة الدماغ. استمر في تشريح بقية أقراص العين التخيلية. وبمجرد الانتهاء من تشريح جميع أقراص العين التخيلية، أمل الشريحة برفق واستخدم قطعة صغيرة من المناديل الورقية لتجفيف فائض الـ PBS.أضف الآن قطرة من وسط التثبيت vector shield ثم ضع غطاء الشريحة بلطف في الأعلى. أصبحت الأقراص الآن جاهزة للتصوير إما باستخدام المجهر الفلوري العاكس (epi fluorescence) أو المجهر البؤري (confocal microscopy). وإذا كان التصوير سيتم في وقت لاحق، تُخزن الشريحة عند درجة حرارة 4 °C.سيبقى البروتين الفلوري الأحمر (RFP) مرئياً لمدة سنة واحدة على الأقل؛ وعند التصوير، يجب الحصول على صور Z Series باستخدام مجهر confocal أو مجهر Zeiss aome بتباعد قدره 1 micrometer باستخدام عدسة 20 x أو 40 x، ومن ثم يمكن إنشاء صور الإسقاط باستخدام برنامج المجهر. تم تشريح الأقراص التخيلية للذباب الذي يعبر عن IRFP وصبغها بـ Phin، ثم أُجري التصوير باستخدام مجهر zes aome بتباعد قدره 1 micrometer باستخدام عدسة 20 x. وتظهر خلايا قرص العين، التي تعبر عن RFP، باللون الأحمر.يتم تصور الثلم المورفوغيني عن طريق الصبغ والتلوين ويظهر باللون الأخضر. تكون الأقطاب الظهرية والبطنية لقرص العين منحنية وتميل إلى الانطواء. يمكن استبعاد هذه المقاطع من صورة الإسقاط النهائية.على الرغم من أن القرص عبارة عن ظهارة أحادية الطبقة، إلا أن المواقع المتغيرة للنوى تتطلب استخدام إسقاط السلسلة Z (Z Series projection) للحصول على صورة عامة للقرص. ونظرًا لأن المراسل IRFP يتمركز في النواة، فإن النمط الظاهر هنا يمثل التعبير النووي لـ RFP. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تنفيذ إجراء تشريح أقراص العين المهبلية من ذبابة الدروزوفيلا drosophila.عند استخدام هذا الإجراء، يفضل استخدام ملقط دقيق، ومن المستحسن أيضاً تجنب شرب القهوة في هذه المرحلة. شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في جميع تجاربكم.

a-novel-rfp-reporter-to-aid-visualization-eye-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة الهجرة من الخلايا الدبقية في عين ذبابة الفاكهة النامية باستخدام التحليل المجهري مع الخلايا الحية المقترنة GFP الدبقية المفتاحية.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

Source: Hellerman، M.B.، et al. Live-imaging of the ذبابة الفاكهة العين العذراء.  J. Vis. Exp. (2015)يوضح الفيديو تقنية تصوير مباشر لدراسة زخرفة العين في ذبابة الفاكهة خادرة ميلانوغاستر. تتيح العلامات الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) تصور التنظيم الخلوي والتمايز أثناء تكوين بنية العين النامية.

التصوير الحي لعين ذبابة الفاكهة العذراء باستخدام الفحص المجهري الفلوري

ينطوي على طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT تصور خلايا مستقبلة للضوء الفسيفساء في ذبابة الفاكهة الحية. ويمكن استخدامه لمتابعة مصائر فردية خلية مستقبلة للضوء في شبكية العين لعدة أيام أو أسابيع. هذه الطريقة مثالية للدراسات تنكس الشبكية وأمراض الاعصاب أو تطوير خلايا مستقبلة للضوء.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

الهياكل البالغة لذبابة الفاكهة مشتقة من هياكل تشبه الكيس تسمى الأقراص الخيالية. يوفر تحليل هذه الأقراص نظرة ثاقبة للعديد من العمليات التنموية بما في ذلك تحديد الأنسجة ، وإنشاء حدود المقصورة ، وتكاثر الخلايا ، ومواصفات مصير الخلية ، وقطبية الخلية المستوية. يستخدم هذا البروتوكول لإعداد أقراص خيالية للفحص المجهري الضوئي / الفلوري.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من ذبابة الفاكهة السوداء البطن

يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لتصوير ذبابة الفاكهة الظهارية العصبية الحية للعين العذراء. تعوض هذه الطريقة عن حركة الأنسجة والطوبولوجيا غير المتكافئة ، وتعزز تصور حدود الخلية من خلال استخدام العديد من بروتينات التوصيل الموسومة ب GFP ، وتستخدم جهاز تصوير سهل التجميع.

يعيش التصوير لل ذبابة الفاكهة العذراء العين

الهدف من هذه التقنية هو تمكين الباحثين من إجراء تشريح وتلطيخ مناعي وتركيب أقراص عين العذراء من ذبابة الفاكهة السوداء في أي عمر.

تشريح وتركيب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء أقراص العين

يوضح هذا البروتوكول كيفية توليد أورام نسيلي ملحوظ fluorescently، الذي يعرف وراثيا في ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي antennal (EAD) العين /. فهو يصف كيفية تشريح EAD والدماغ من يرقات العمر الثالث وكيفية معالجتها لتصور وتحديد التغييرات التعبير الجيني وغزو الورم.

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لعلى المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لقرص تخيلي ذبابة الفاكهة. وهو يدل التمايز مبصرة والتناوب ommatidial في غضون فترة 10 ساعة من التصوير المباشر لقرص العين. بروتوكول بسيط ولا يتطلب الإعداد مكلفة.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

وقد يؤثر توقيت التعرض للمضايق علي اثارها الانمائيه. هنا نعرض كيفيه الإفراج عن صوره من البروتين الوراثي العظام دروفوليا (BMP) تسمي النيابة التقدمية من خلايا القرص الجناح.

التصوير التقدمي الإفراج عن القرص الجناح دروفيا

تصف هذه المقالة بروتوكول تقطيع القرص التخيلي الفعال وتلوين الأجسام المضادة الاقتصادي، وهو اقتصادي مع المواد التفاعلية ويسهل التعامل مع الأقراص التخيلية بأعداد قليلة.

تشريح صغير النطاق وتلوين الأجسام المضادة للأقراص التخيلية للعين والجناح من ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر

تعلم تقنية فصل أقراص العين التخيلية في ذبابة الفاكهة باستخدام مراسل البروتين الفلوري الأحمر. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد أنواع الخلايا المحددة أثناء تطور العين.

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة

استكشف المزيد من الفيديوهات