إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

يشرح هذا الفيديو كيفية إجراء المجهر الإلكتروني النافذ، والمعروف أيضاً باسم TEM، على قلب جنين ذبابة الفاكهة drosophila. لقد برز القلب كنظام نموذج قيم لدراسة هجرة الخلايا، والالتصاق الخلوي الخلوي، وتغيرات شكل الخلايا. تتيح هذه التقنية تصور شكل تجويف القلب، بالإضافة إلى المكونات فائقة البنية مثل أغشية الخلايا، والروابط الخلوية الخلوية، والغشاء القاعدي.

لبدء هذا الإجراء، يتم تحضير محلول تثبيت مناسب للمجهر الإلكتروني النافذ لأجنة Drosophila. بعد ذلك، توضع مجموعة من الأجنة المغلفة التي تتراوح أعمارها من 0 إلى 20 ساعة في محلول التثبيت. وعند الانتهاء، تُزال الأجنة من محلول التثبيت وتُجهز أثناء تثبيتها على شريط لاصق مزدوج الوجه.

في طبق بتري يحتوي على محلول منظم منزوع الأيونات، تطفو الأجنة في المحلول ويتم استعادتها باستخدام ماصة. بعد ذلك، يتم تثبيت الأجنة نهائيًا وتخضع لتدرج تجفيف. وبمجرد تغلغل الراتنج فيها، تُنقل إلى قالب طمر حيث يتم محاذاتها.

يتم قطع الكتلة الناتجة باستخدام سكين ماسي. ثم تُنقل المقاطع إلى شبكات نحاسية، وتُصبغ وتُفحص. مرحباً، أنا نادين لوب من مختبر سونيتا كرامر في قسم الباثولوجيا والطب المختبري بجامعة الطب وطب الأسنان في نيوجيرسي في كلية روبرت وود جونسون الطبية.

أنا راج باتيل، أخصائي المجهر الإلكتروني من قسم الباثولوجيا في PON. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحضير وتصوير أجنة oph باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التخلق الشكلي لقلب Drosophila. لذا، دعونا نبدأ.

قبل التعامل مع أجنّة ذبابة الدروزوفيلا، قم بتحضير محلول التثبيت حديثاً لطريقة نفاذية الهبتان لتثبيت الأجنّة. داخل خزانة استخلاص الغازات، انقل باستخدام الماصة 2 mL من محلول محضر حديثاً يحتوي على 12.5% glutaraldehyde في محلول Cate buffer إلى قارورة وميض زجاجية. أضف 8 mL من ADA heptane ورج القارورة بقوة.

ثم انتظر لمدة دقيقة واحدة. وبترك الطورين ينفصلان، سيحتوي الطور العلوي على هبتان ADA، المشبع بالغلوتارالدهيد، وهو محلول التثبيت. انقل الطور العلوي باستخدام الماصة إلى قارورة نظيفة واتركها جانباً. ولجمع الأجنة التي يتراوح عمرها من 0 إلى 20 ساعة، استخدم غرفة جمع الأجنة، وهي عبارة عن سلة صغيرة ذات حشوة شبكية قابلة للإزالة.

ابدأ بإزالة طبق عصير العنب الذي يحتوي على الأجنة وإزالة أي ذباب ميت. ثم باستخدام الماء وفرشاة رسم، قم بتحرير الأجنة من طبق عصير العنب، وانقل الأجنة إلى غرفة تجميع الأجنة باستخدام زجاجة مربعة تحتوي على الماء.

اشطف الأجنة لإزالة أي خميرة زائدة من طبق عصير العنب. أزل غشاء الكوريون الخارجي عن طريق نقع الأجنة في محلول مبيض بتركيز 50% لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أو حتى تطفو الأجنة على السطح. اشطفها جيداً بالماء المقطر ثم جفف الأجنة على منشفة ورقية.

باستخدام الملقط، ارفع قطعة الشبك، التي يجب أن تكون الآن مغطاة بالأجنة المطلية. ضع قطعة الشبك في المثبت، مما يسمح للأجنة بالسقوط من الشبك. اترك الأجنة لتثبت لمدة ساعة ونصف عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب باستخدام هزاز مداري.

بمجرد انتهاء فترة الحضن، ضع الأجنة في طبق بتري مبطن بشريط لاصق مزدوج الوجه مع محاولة نقل أقل كمية ممكنة من المادة المثبتة. هز الطبق لتوزيع الأجنة في طبقة واحدة، ثم وضعه في غطاء كيميائي للسماح للهبتان بالتبخر. وبمجرد جفاف الأجنة، قم بتغطيتها بمحلول منظم يحتوي على 0.1%tween hand de vize.

أجنة في المرحلة 16 المتأخرة تحت مجهر تشريحي باستخدام إبرة تنجستن غير مدببة. الأجنة التي تم تثبيتها تطفو ويمكن استعادتها باستخدام ماصة باستور، ثم تُنقل الأجنة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter. تُغسل الأجنة في محلول منظم cacodylate بتركيز 0.1 molar، ثم تُثبت لاحقاً في Osmium tetroxide بتركيز 1% لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد انتهاء عملية التحضين، يتم شطف الأجنة باستخدام محلول Cate المنظم. ثم تُجفف الأجنة مرة أخرى باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول والأسيتون. ابدأ بـ 50% ethanol لمدة 10 دقائق، يليها 70% Ethanol لمدة 10 دقائق، ثم التجفيف في 90% acetone لمدة 10 دقائق، وأخيراً في 100% acetone في خطوات مدة كل منها 10 دقائق.

أزل الأسيتون. ابدأ عملية الارتشاح بإضافة خليط بنسبة واحد إلى واحد من راتنج الرش ein والأسيتون. تأكد من وضع العينة تحت ضغط تفريغ، ثم استخدم الميكروويف لمدة ثلاث دقائق.

حافظ على ضغط التفريغ لمدة خمس دقائق إضافية. استبدل خليط الراتنج والأسيتون براتنج بنسبة 100%، ثم استخدم الميكروويف مرة أخرى تحت ضغط التفريغ. استبدل الراتنج واستخدم الميكروويف تحت الضغط.

مرة أخيرة لإتمام ثلاث خطوات من التغلغل. انقلي الأجنة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى قالب طمر من السيليكون. رتبي الأجنة في صف بحيث يكون الطرف الخلفي للجنين محاذياً للحافة المستدقة للقالب.

يُوضع اللحم المقدد في فرن بدرجة حرارة 70 °C طوال الليل. ثم تُخرج الكتلة الناتجة لتقطيعها. يُستخدم الميكروتوم لقطع مقاطع بسمك 1 µm من الأجنة.

بمجرد الانتهاء من تقطيع الكتلة والوصول إلى الجنين، استخدم حلقة لنقل مقطع واحد إلى شريحة زجاجية لتحديد ما إذا كان قد تم الوصول إلى العمق المناسب لرؤية القلب قبل البدء في عملية التصوير. سخن المقطع لفترة وجيزة على لوح تسخين وصبغه بصبغة الميثيلين الأزرق عن طريق إضافة قطرة واحدة إلى الشريحة أولاً، ثم التسخين لفترة وجيزة.

اشطف مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات وافحص المقطع تحت المجهر عند عمق التقطيع المطلوب. يجب أن يكون تجويف القلب قابلاً للتمييز باستخدام المجهر الضوئي تلبيةً لقيود المساحة. أعد تهذيب الكتلة لتشمل بحد أقصى خمسة أجنة في مقطع عرضي تظهر فيها القلوب الجنينية.

قم بقص مقاطع بسمك 90 nanometer باستخدام الميكروتوم. ثم التقط عدة مقاطع على شبكة نحاسية. قم بصبغ الشبكة باستخدام 3%al acetate لمدة 10 دقائق، ثم اشطفها ثلاث مرات بالماء المقطر.

قم الآن بصبغ الشبكة باستخدام سترات الرصاص لمدة دقيقتين ونصف في غرفة تحتوي على حبيبات هيدروكسيد الصوديوم لتهيئة بيئة خالية من ثاني أكسيد الكربون. بعد فترة الحضانة، اشطف الشبكة ثلاث مرات بالماء المقطر. افحص المقاطع باستخدام المجهر الإلكتروني عند 80 kilovolts وقم بالتصوير بواسطة كاميرا CCD.

من أجل تحديد ما إذا كانت عملية التقطيع وتحديد المراحل قد تمت بشكل صحيح، يجب أن يكون من الواضح تكوّن تجويف قلب ناضج بين الخلايا القلبية (cardio blasts) في الخط المتوسط الظهري. ولتحديد ما إذا كانت الأغشية الخلوية سليمة، افحص تجويف القلب للبحث عن وجود المادة الخلالية (extracellular matrix) وابحث عن وجود الأعراف (cristae) والميتوكوندريا. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحديد البنية الدقيقة لقلب جنين Drosophila. عند القيام بهذا الإجراء.

من المهم تذكر تحديد مرحلة أجنة Drosophila بشكل صحيح، وقياس مكونات الراتنج بدقة وخلطها جيداً. شكراً للمتابعة، وبالتوفيق في تجربتكم.