قياس معاملات إنتشار عبر ثنائي الفوتون الاسترداد بعد الإسفار Photobleaching

مضان الفوتون المتعدد. يمكن إثبات التعافي بعد إجراء التبييض الضوئي بسهولة باستخدام عينة منتشرة بحرية من جزيئات صبغة الفلورسنت. أولا ، يتم إرسال شعاع ليزر منخفض الكثافة إلى العينة لتوليد مستوى مرجعي من التألق من جزيئات D داخل الحجم البؤري لليزر.

بعد ذلك ، يتم إرسال وميض ليزر قصير عالي الكثافة في التبييض الضوئي لجزء من جزيئات الصبغة داخل الحجم البؤري. أخيرا ، يتم تخفيف شعاع الليزر إلى مستوى الكثافة المنخفض السابق ويتم مراقبة التألق حيث تنتشر الجزيئات المبيضة الضوئية إلى الخارج ويتم استبدالها بجزيئات فلورية ثابتة من خارج الحجم البؤري. يتم تحليل التألق الناتج كدالة لمنحنى الوقت لإنتاج معامل الانتشار.

مرحبا ، أنا كيلي سوليفان من مختبر إدوارد براون في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة روتشستر. سنوضح لك اليوم كيفية إجراء استعادة مضان الفوتون المتعدد بعد التبييض الضوئي. نستخدم هذه التقنية في مختبرنا لدراسة الانتشار في كل من الأنظمة البيولوجية في المختبر وفي الجسم الحي.

لذلك دعونا نبدأ. للبدء ، اضبط الطول الموجي لليزر المطلوب وأدخل المرشح المناسب أمام أنبوب مضاعف الصورة أو PMT. بعد ذلك لتجنب تلف الخلية PCAL ، اضبط طاقة الليزر على 200 مللي واط أو أقل.

هناك مرآتان موجهتان في الشكل أربعة في المنبع من خلية PCAL. هذه المرايا ضرورية وكافية لمحاذاة شعاع الليزر من خلال خلية PCAL. اضبط إزاحة الجهد على وحدة التحكم في انحياز الخلايا PCAL على الصفر ، واضبط مسار الليزر عبر الخلية PCAL بحيث يتمركز الليزر في النوافذ الأمامية والخلفية.

استخدم المرآة في المنبع في الشكل أربعة لتوسيط الشعاع في النافذة الأمامية والمرآة في اتجاه مجرى النهر في الشكل أربعة لتوسيط الشعاع في النافذة الخلفية. الآن اضبط الجهد عبر بلورة الخلية PCAL على القيمة القصوى. تعتمد القيمة المناسبة على الأطوال الموجية ويمكن العثور عليها في دليل تعليمات خلية PCAL.

اضبط المرايا في الشكل الرابع في المنبع من خلية PCAL حتى يتم تعظيم طاقة الخرج من خلية PCAL. الآن قم بتبديل الجهد عبر البلورة إلى الصفر وضبط إزاحة الجهد على وحدة التحكم في التحيز لتقليل طاقة الخرج من الخلية PCAL. أعد حادث طاقة الليزر على خلية PCAL إلى القيمة المطلوبة للتجربة.

الآن بالانتقال إلى المجهر ، احصل على تركيز بصري جيد على عينة فلورية موحدة. نحن هنا نستخدم حبوب اللقاح الفلورية الثابتة. بمجرد التركيز ، أغلق المجهر ، واضبط طاقة الليزر على مستوى مناسب لتصوير العينة عن طريق تغيير الجهد عبر بلورة الخلية PCAL.

أخيرا ، أطفئ الأنوار واقلب PMT. ابدأ مسح صورة متكرر للعينة القياسية واضبط المرايا في اتجاه مجرى الخلية PCAL حتى يتم الحصول على صورة حادة للعينة. الآن دعونا نلقي نظرة على تحديد قوة الشاشة الآمنة للتركيز الشعبي داخل العينة.

لغرض هذا الفيديو ، سنستخدم عينة من الصبغة المائية الموجودة داخل منخفض في شريحة زجاجية ومغطاة بقلة غطاء. خفف الليزر إلى طاقة منخفضة ولكن معقولة لتوليد التألق داخل العينة. أغلق المجهر ، وقم بتحويل الإخراج من PMT إلى عداد الفوتون.

أطفئ الأضواء ، واقلب PMT ، وابدأ مسح النقطة على برنامج المجهر. اضبط عداد الفوتون للتكامل على نطاق زمني أطول بكثير من وقت استرداد التألق المتوقع وسجل عددا معقولا من نقاط البيانات. قم بزيادة الطاقة وخذ سلسلة أخرى من بيانات عدد الفوتونات.

استمر في زيادة الطاقة حتى يبدو أن الزيادة في عدد الفوتونات تتضاءل بشكل كبير. فيما يتعلق بمخطط زيادة الطاقة ، يتم احتساب سجل الفوتون كدالة لسجل الطاقة. أي انحراف عن منحدر اثنين يشير إلى التبييض.

أثناء الشاشة، حدد طاقة شاشة معقولة أقل من هذا الانقطاع. الآن دعنا نحدد معلمات الإدخال إلى القشارة متعددة القنوات ومولد النبض. على مولد النبض.

اضبط وقت التدريس المسبق ليكون أكبر بمرة إلى مرتين من وقت الاسترداد النصفي المتوقع ووقت التبييض ليكون واحدا من عشر وقت الاسترداد المتوقع على القشارة. قم بتعيين عرض الحاوية إلى نصف مدة التبييض تقريبا وقم بتعيين عدد الصناديق لكل سجل، بحيث يكون ناتج عرض الحاوية المحددة والصناديق لكل سجل أكبر من وقت الاسترداد الكامل المتوقع. بالإضافة إلى ذلك ، تعود أوقات التحضير والتبييض إلى مولد النبض وتضبط تردد تسلسل التحضير والتبييض مساويا لقيمة أصغر بقليل من معكوس ناتج عرض الحاوية مضروبا في عدد الصناديق لكل سجل.

أخيرا ، قم بتعيين عدد السجلات لكل مسح ضوئي على القشارة بناء على شدة الإشارة عند طاقة الشاشة التي اخترتها. الآن اضبط طاقة الشاشة على مستوى آمن واضبط طاقة التبييض على حوالي 200 مللي واط فوق قطع التبييض الذي يحدده أثناء اختبار تبييض الشاشة. يتم تعيين كل من هذه القوى على شكل جهد مختلف عبر ختم بلورة الخلية ، ويقوم المجهر بإيقاف تشغيل الأضواء.

قم بتشغيل PMT. ابدأ مسح النقاط على برنامج التصوير. ثم ابدأ تشغيل مولد النبض والقشارة.

لتحليل منحنى الاسترداد الناتج ، حدد ثلاث نقاط مهمة. التألق الجاهز ، والتألق بعد التبييض مباشرة والتألق في نهاية مجموعة البيانات. استخدم قيم التألق قبل وبعد التبييض مباشرة لتقدير نصف وقت الاسترداد بشكل أفضل.

الآن ، استخدم القواعد الموضحة في الخطوات السابقة لتحديث قيم التبييض الجاهز وبدء فترات العرض. خذ منحنى جديدا واستمر في تعديل المعلمات حتى يظهر المنحنى الناتج تبييضا قويا وتعافيا سلسا. تحقق من تشبع الإثارة عن طريق رسم سجل معلمة عمق التبييض كدالة لسجل الطاقة.

أي انحراف عن منحدر اثنين يشير إلى تشبع الإثارة. اختر قوة التبييض التي تنتج مبيضا قويا ولكنها لا تسبب التشبع. أخيرا ، مع تحديد المعلمات المناسبة ، استمر في أخذ استعادة مضان الفوتون المتعدد بعد التبييض الضوئي أو منحنيات MP FP لعينة اهتمامك.

سنعرض الآن نتائج تمثيلية لكل من بيانات MP frap الأولية في منحنى التفاف MP F الطبيعي الذي تم تركيبه ، ومعامل الانتشار ، وبيانات MP F frap الأولية ، والتبييض القوي والاسترداد السلس. مع الإبلاغ عن الاسترداد الكامل للنصف الأخير من البيانات لتناسب البيانات. نقوم أولا بتطبيع الاسترداد إلى متوسط التألق الجاهز ثم نقوم بإجراء مربع غير خطي مؤجر

فيما يتعلق بالنموذج المناسب. تم أخذ كلتا مجموعتي البيانات في الفلورسين المائي ومعاملات انتشار الغلة. تمشيا مع الأدبيات ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء استعادة مضان متعدد الفوتون بعد تجربة التبييض الضوئي.

عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم توخي الحذر وتعيين المعلمات التجريبية الخاصة بك ، على وجه الخصوص ، مدة التبييض وقوى التبييض والمراقبة إلى الحدود الآمنة المحددة في البروتوكول. لذا شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.