تعيش تشريح ذبابة الفاكهة الأجنة : طرق مبسطة للفحص من قبل مجموعات المسخ تلطيخ جسم
December 29th, 2009
وصفنا بروتوكول مبسط لتوليد "فيليه" الاستعدادات للأجنة ذبابة الفاكهة من المورثات المحددة. هذا البروتوكول يسمح التنفيذ الفعال لمجموعة متنوعة من شاشات الجينية. كما يسمح التصور ممتازة الهياكل في الجنين في وقت متأخر.
هنا نرى إجراء جمع الأجنة. نقل الذباب من القوارير إلى أنابيب غرفة التجميع ذات خمسة براميل. ثم ضع طبق العنب فوق الغرفة واترك الذباب يضع البيض لبضع ساعات.
عندما تكون الأجنة في المرحلة الصحيحة ، انقلها من العنب إلى شريط لاصق مزدوج باستخدام فرشاة الرسم. الآن قم بتدوير الأجنة من كونها واصطفها على كتلة أجار مع جوانبها البطنية. في المنتصف ، نرى شريحة بها مستطيل من الشمع وقطعة من الشريط اللاصق المزدوج في أحد طرفيه ، اقلب الشريط اللاصق المزدوج فوق الكتلة مع الأجنة المبطنة ولمسها على الأجنة لنقلها إلى الشريحة.
سيكونون الآن الجانب الظهري لأعلى على الفور. أضف PBS إلى منطقة الشريحة المحاطة بمستطيل الشمع لتغطية الأجنة. يعرض الجزء العلوي عرضا جانبيا للشريحة ويظهر الجزء السفلي عرضا علويا.
قطع شق على طول الغشاء الشرير بإبرة تشريح زجاجية. كزة الأجنة في منطقة الدماغ ، وارفعها ونقلها إلى صفوف على الزجاج. ثم قم بتشريح كل جنين لعمل فيليه.
في نهاية الإجراء ، سيكون لديك شريحة بها صفوف من أجنة فيليه. إنه الآن جاهز للإصلاح. مرحبا ، أنا بيتر لي ، ملصق في مختبر كايزنز في قسم علم الأحياء في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا.
مرحبا ، أنا آشلي رايت ، طالبة دراسات عليا في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا في مختبر كايزنز. أنا كايزن ، أستاذ في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، وتعمل مجموعتي البحثية على تطوير الجهاز العصبي في ذباب الفاكهة. سنعرض لك اليوم إجراء لتشريح أجنة العقيق الحي.
لقد استخدمنا هذه الطرق للبحث عن روابط المستقبلات اليتيمة. نقوم بذلك عن طريق فحص مجموعات من الخطوط فوق البروتينات السطحية للخلية عن طريق التلوين الحي للأجنة ببروتينات اندماج المستقبلات. نستخدم هذا الإجراء أيضا في المختبر لدراسة الأنماط الظاهرية الجنينية وإجراء الشاشات الجينية.
لقد أجريت فحص نقص للأفعال الحركية على الأنماط الظاهرية للتوجيه. لذلك دعونا نبدأ. سيوضح لك بيتر كيف يتم ذلك.
للبدء ، استخدم ملعقة لوضع بقعة من عجينة الخميرة على طبق جمع بيض العنب الزراعي المقابل لكل برميل من برميل غرفة جمع الأجنة. بعد ذلك ، قم بحقن غاز ثاني أكسيد الكربون في قوارير الذباب لوضع الذباب في النوم. انقل بضع مئات من الذباب مباشرة إلى غرفة التجميع.
ثم قم بتغطية الحجرة بلوحة جمع البيض واضغط لأسفل باستخدام شريط بطول 20 بوصة من شريط الملصقات ، اربط الغرفة واللوحة معا بدءا من منتصف لوحة الأجار. سوف يتداخل الشريط على لوحة جمع البيض. بعد أن يستيقظ الذباب ، احتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعتين أو ثلاث ساعات في وضع أفقي بعد الحضانة ، واضغط على الذباب لأسفل واستبدل لوحة التجميع.
إذا كان هناك أقل من 100 جنين في كل قطاع من اللوحة التي تمت إزالتها. استمر في إجراء مجموعات لمدة ساعتين حتى يتم جمع أجنة كافية. يمكن تجميع الأجنة التي تم جمعها وفقا للمواصفات الواردة في البروتوكول المكتوب المصاحب.
لعمر الأجنة ، ضع قطعة مبللة من ورق الترشيح الدائري 90 ملم في غطاء طبق بتري وضع لوحة التجميع مع الأجنة رأسا على عقب. احتضان اللوحة للمدة المطلوبة وفي درجة الحرارة المطلوبة ، وقم بإعداد شريحة لتنظيم الأجنة وفرزها عن طريق وضع شريط لاصق على الوجهين على شريحة. ثم ضع لوحا مستطيلا من أجار العنب على شريحة S.
يجب أن يكون البيضة كبيرا بما يكفي لاستيعاب خمسة إلى 10 صفوف من 10 إلى 15 جنينا. بمجرد وصول الأجنة إلى المرحلة المرغوبة ، قم بإزالة الأجنة من الحاضنة. انقل الأجنة القديمة من لوحة التجميع إلى الشريط اللاصق على الوجهين.
باستخدام فرشاة رسم مبللة ، انشر الأجنة بالتساوي عبر الشريط. تحت مجهر تشريح GFP أجنة SOAR للتعبير المناسب عن GFP ، مما يشير إلى النمط الجيني. في هذه التجربة ، يتم إجراء التنميط الجيني عن طريق اختيار الأجنة التي تفتقر إلى التعبير عن الذراع المجعد الموازن ، GFP.
نظرا لأن التنميط الجيني للأجنة سيختلف اعتمادا على الموازن المستخدم ، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب المصاحب لمزيد من المعلومات حول إجراء ذلك. درج. بعد ذلك ، باستخدام إبرة تشريح ضعيفة ، قم بتغطية الأجنة عن طريق لفها برفق عبر الشريط اللاصق على الوجهين. في المرحلة 16 ، انقسمت القناة الهضمية إلى ثلاثة نطاقات.
بعد ذلك ، تبدأ القناة الهضمية في تطوير أشرطة قطرية بالقرب من الذيل ثم تلتف ويصبح الجنين أكثر وضوحا. بعد ذلك ، استخدم إبرة التشريح لدحرجة كل جنين فوق القنبلة أو الأجنة الأخرى. تجنب ملامسة الشريط ، ارفع الجنين وانقله إلى لوح أجار العنب.
قم بمحاذاة الأجنة المطلية على هذه البلاطة بحيث تكون جوانبها الظهرية مقابل لوح أجار والنهايات الخلفية متجهة لأسفل. ثم ضع الشريحة في طبق بتري بورق ترشيح مبلل واحتضان الأجنة في درجة حرارة الغرفة حتى تصل إلى العمر المطلوب للتشريح ، قم بإعداد شريحة للتشريح الحي عن طريق قطع قطعة مستطيلة صغيرة من الشريط اللاصق على الوجهين. ضع الشريط بالقرب من أحد طرفي شريحة Super Frost plus باستخدام قلم شمع.
ارسم مستطيلا بعرض الشريحة وطوله 30 إلى 40 ملم حول الشريط. يجب أن يكون هناك ما يقرب من ثلاثة ملليمترات من المسافة بين الشمع والشريط. ثم انقل الأجنة من لوح اللوحة الكبيرة إلى الشريط عن طريق قلب الشريحة وخفضها برفق على الأجنة المبطنة بحيث يتلامس الشريط معها.
يجب توجيه الأجنة مع النهايات الخلفية لأسفل. بعد النقل ، سيتم وضع الأجنة على الجانب الظهري لأعلى على الشريحة على الفور إضافة XPBS واحد فوق الأجنة لملء مستطيل الشمع باستخدام إبرة تشريح زجاجية ، والتي يتم تصنيعها على مجتذب إبرة مثل إبرة الحقن. قطع على طول خط الوسط الظهري بدءا من الطرف الخلفي للجنين.
الآن كزة الطرف الأمامي للجنين وارفعه. بدءا من الجزء السفلي ، انقل الجنين إلى يمين شريط الشريط ، مع الاحتفاظ به في المخزن المؤقت. استمر في تشريح الأجنة ونقلها ، وقم بعمل صف منظم من الأجنة على الشريحة يطابق كل صف على البلاطة الزراعية.
باستخدام إبرة التشريح ، ادفع برفق اللوحات من جدار الجسم على الشريحة. تجنب شد أو إزالة المواد من سطحها. يجب أن تتصل الإبرة فقط بالزوايا الأمامية والخلفية عند الحواف الظهرية لجدار الجسم.
نظرا لأن المحاور الحركية لا تمتد إلى هذا الحد. ظهريا ، تجنب لمس إبر الشريحة لأنها ستنكسر بعد نقل جميع الأجنة وتثبيتها على الشريحة. قم بإزالة القناة الهضمية من كل جنين عن طريق فصل الأمعاء الأربعة عن منطقة الدماغ وسحب القناة الهضمية بأكملها بعيدا عن الجنين.
قم بإزاحة القناة الهضمية الخلفية على الشريحة. بمجرد اكتمال جميع عمليات التشريح، استخدم ماصتين سابقتين لتوصيل درجة حرارة الغرفة في وقت واحد، 5٪ من الفورمالديهايد إلى أحد أركان الشمع، والمستطيل، وإزالة المحلول من الزاوية المقابلة. استبدل المحلول المثبت ثلاث مرات باستخدام حجم إجمالي يبلغ حوالي ستة ملليلتر.
احتضان الأجنة في محلول التثبيت لمدة 45 دقيقة. من المهم جدا عدم السماح للغضروف المفصلي بالاتصال بالأجنة لأن ذلك سيؤدي إلى تدميرها. استخدم ماصة سابقة لإزالة معظم محلول التثبيت.
يغسل باستخدام PB S3 مرات باستخدام طريقة ماصة المراعي. ثم يغسل ب PBT ثلاث مرات لاختراق الأجنة. هذه الخطوة تجعل الأجنة أقل حساسية للغضروف المفصلي.
بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة PBT بعناية عن طريق قلب الشريحة ولمس مسح Kim لفترة وجيزة في زاوية المنطقة المحاطة بالشمع لإزالة المحلول الزائد. باستخدام رجل ماصة محمل مسبقا ، أضف على الفور 200 ميكرولتر من كتلة محلول المنع لمدة 10 إلى 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول الانسداد باستخدام منديل Kim.
ثم أضف على الفور 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المطلوب المخفف في محلول الحظر. ضع الشريحة في طبق رطب واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في هذه التجربة ، يتم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة 1D four لتسمية المحاور الحركية.
في اليوم التالي ، قم بإزالة الأطباق من أربع درجات مئوية وغسل الأجنة ثلاث مرات على منصة هزازة باستخدام PBT لمدة 15 دقيقة على الأقل لكل غسلة. لجميع خطوات الغسيل ، تأكد من وجود PBT كاف لغمر الشريحة تماما أثناء التأرجح. بعد غسل الأجنة ، قم بسد الشريحة كما كان من قبل.
بعد الحظر ، أضف على الفور 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية ومحلول الحجب واحتضان ساعتين في درجة حرارة الغرفة هنا ، فإن Alexa 4 88 تذهب ضد الولايات المتحدة. يستخدم الثانوي بالاقتران مع رودين فين لتسمية ألياف العضلات. مرة أخرى ، اغسل ثلاث مرات باستخدام PBT على المنصة الهزازة لمدة 15 دقيقة على الأقل لكل غسلة.
انقل الشرائح إلى صينية مختلفة لإزالة المنظفات المتبقية. ثم اغسلها مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. قم بإزالة الشريحة من مخطط PBS معظم PBS المتبقية من البئر باستخدام مسحة كيميائية ، وأضف على الفور 500 ميكرولتر من 70٪ من الجلسرين.
نظرا لأن الجلسرين له نفس معامل الانكسار مثل الجنين الذي يقوم بهذه الخطوة سيجعل التلوين أكثر وضوحا ، قم بتنظيف الأجنة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة الجلسرين بمنديل كيم. ستؤدي إزالة كل الجلسرين تقريبا إلى تسطيح الأجنة بينما ستؤدي إزالة كمية أقل من الجلسرين إلى بنية ثلاثية الأبعاد.
بمجرد إزالة الجلسرين ، ضع قسيمة الغطاء رقم واحد. الأجنة جاهزة للتصوير ويمكن تصور الأجنة المقطعة والملطخة عن طريق الفحص المجهري المناعي الفلوري. هنا تم تلطيخ الجنين المقطوع بجسم مضاد لعلامة المحور العصبي الحركي 1D أربعة.
تشبه هذه الصورة في مظهرها الصور الأكثر شيوعا التي تم فيها استخدام الكيمياء المناعية HRP للتصور باستخدام التألق المناعي. من الممكن الحصول على صور عالية الجودة تظهر فيها تفاصيل فروع محور المحرك بشكل أكثر وضوحا. يسمح تلطيخ cos باستخدام rho domine المسمى phin ، والذي يربط الأكتين ، بالتصور المتزامن للعضلات.
يعطي هذا صورة أوضح عن طبقات العضلات وتنظيمها ، ثم يمكن الحصول عليها باستخدام تلطيخ HRP هنا ، تظهر 1D أربعة أو المحاور الحركية باللون الأخضر Fein أو تظهر العضلات باللون الأحمر. لقد أوضحنا للتو كيفية تشريح أجنة ذبابة الفاكهة الحية من مجموعات من الخطوط الطافرة. عند القيام بهذه الإجراءات ، من المهم أن تبدأ بخطوط سهلة مثل lio و armadilo و GFP والأسهم المتوازنة ، والقيام ببضعة أسطر في كل مرة.
عندما تصبح أكثر خبرة وأسرع في التشريح ، يمكنك القيام بما يصل إلى 10 أسطر يوميا وسيسمح لك ذلك بفحص مجموعة من 200 خط متحور أو نحو ذلك في فترة 20 يوما أو نحو ذلك. لذلك يعد هذا إجراء فعالا للغاية بمجرد أن تصبح خبيرا في تنفيذ جميع الخطوات. هذا كل شيء ، وشكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا مبسطًا لإنشاء تحضيرات "فيليه" من أجنة Drosophila من أنماط جينية معينة. يسهل البروتوكول التنفيذ الفعال للشاشات الجينية المختلفة ويوفر تصورًا ممتازًا للهياكل في الأجنة المتأخرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- علم الأحياء التنموي
الخلفية
- تُستخدم أجنة Drosophila على نطاق واسع في الدراسات الجينية.
- تسمح تحضيرات الفيليه بالفحص المفصل للهياكل الجنينية.
- تعزز البروتوكولات الفعالة القدرة على إجراء الشاشات الجينية.
- تعتبر تقنيات التصور ضرورية لفهم العمليات التنموية.
هدف الدراسة
- لتطوير بروتوكول لإنشاء تحضيرات فيليه من أجنة Drosophila.
- لتحسين كفاءة طرق الفحص الجيني.
- لتعزيز تصور الهياكل الجنينية.
الطرق المستخدمة
- جمع الأجنة باستخدام غرفة مكونة من خمسة براميل.
- نقل الأجنة إلى شريط لاصق مزدوج لتحديد المحاذاة.
- استخدام كتل الأغار لتحديد موقع الأجنة.
- عكس الشريط لنقل الأجنة إلى الشرائح لمراقبة.
النتائج الرئيسية
- يسمح البروتوكول بجمع الأجنة وتحضيرها بسهولة.
- يمكن محاذاة الأجنة بكفاءة للتصور.
- يمكن الحصول على صور عالية الجودة للهياكل الجنينية.
- يدعم الأسلوب تطبيقات فحص جيني مختلفة.
الاستنتاجات
- يعزز هذا البروتوكول المبسط دراسة تكوين جنين Drosophila.
- يوفر أداة قيمة للباحثين الذين يجرونه فحصًا جينيًا.
- تساهم تقنيات التصور المحسنة في فهم أفضل لعلم الأحياء التنموي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput phenotypic screening of Drosophila mutant collections by combining live dissection with antibody staining, supporting target validation in neurodevelopmental pathways. It reduces time and labor compared to fixed dissection methods, allowing screening of up to 10 lines per day with quantitative scoring of 4-7 mutant embryos per line. The approach enhances predictive confidence in early discovery by facilitating detection of low-penetrance phenotypes across hundreds of balanced lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic screening of mutant collections for neurodevelopmental targets.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genotype to observable axon and muscle phenotypes in live embryos.
- Translational Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct visualization of motor axon guidance and muscle organization phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fillet preparations suitable for antibody-based readouts of neuronal and muscular structures.
- Quantitative Output: Enables scoring of up to 70 hemisegments per line at high magnification with 40X water-immersion lens for robust phenotypic quantification.
- Scalability: Streamlined workflow accommodates screening of hundreds of balanced mutant lines in genetic screens for orphan receptor ligands.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying neurodevelopmental phenotypes with conservation to human axon guidance pathways.
- Preclinical Continuity: Supports translational biomarker alignment by enabling consistent phenotyping from discovery through validation stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows identification of subtle, low-penetrance mutations that may inform target selection and de-risking decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neurodevelopmental biology and enabling scalable screening prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through direct observation of motor axon and muscle phenotypes in genetically defined embryos.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible fillet preparations with quantitative immunofluorescence readouts for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates quantitative phenotypic data (e.g., axon branching patterns, muscle layering) that enable comparative analysis across genetic conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conservation of axon guidance mechanisms and muscle development pathways relevant to human neurodevelopmental disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform for neurodevelopmental target validation across multiple projects and mutant collections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through high-content phenotypic screening.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of embryonic dissections across users and experimental batches.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling screening of large mutant collections in compressed timelines (e.g., 200 lines in ~20 days).
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying phenotypes with variable penetrance that might be missed in lower-throughput assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila embryo handling, genotyping via GFP balancer screening, and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on instrumentation including compound microscopes with 40X water-immersion lenses, wax-coated slides, and humidified chambers for antibody incubation.
- Necessitates standardization of embryo staging (stages 14-17), dissection timing, and antibody staining protocols across users.
- Involves adaptation considerations for different balancer systems (e.g., GFP, Curly) affecting genotyping strategies.
- Practical limitations include the need for trained personnel to achieve optimal throughput (10 lines/day) and sensitivity to embryo health and staging accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:21
Introduction
2:14
Collection of Embryos From Fly Crosses
4:15
Staging Embryos and Sorting for GFP Expression
6:34
Drosophila Embryo Live Dissection
8:31
Embryo Fixation and Antibody Staining
12:11
Immunofluoresent Imaging of Dissected Drosophila Embryos
12:58
Conclusion
