تعيش تشريح ذبابة الفاكهة الأجنة : طرق مبسطة للفحص من قبل مجموعات المسخ تلطيخ جسم

نرى هنا إجراء جمع الأجنة. انقل الذباب من القوارير إلى أنابيب غرفة جمع خماسية الفتحات. ثم ضع طبق زراعة العنب (grape agri plate) فوق الغرفة واترك الذباب يضع البيض لعدة ساعات.

عندما تصل الأجنة إلى المرحلة المناسبة، انقلها من طبق العنب إلى شريط لاصق مزدوج الوجه باستخدام فرشاة رسم. الآن، قم بدحرجة الأجنة لإخراجها من أكياسها وصفّها على كتلة أغار بحيث تكون جوانبها البطنية للأعلى. في المنتصف، نرى شريحة تحتوي على مستطيل من الشمع وقطعة من شريط لاصق مزدوج الوجه. عند أحد الطرفين، اقلب الشريط اللاصق المزدوج الوجه فوق الكتلة التي تحتوي على الأجنة المصفوفة، ثم لامسه بالأجنة لنقلها إلى الشريحة.

ستكون الأجنة الآن في وضعية الظهر للأعلى مباشرةً. أضف PBS إلى منطقة الشريحة المحاطة بمستطيل الشمع بحيث يتم تغطية الأجنة. يوضح الجزء العلوي منظراً جانبياً للشريحة بينما يوضح الجزء السفلي منظراً علوياً.

أحدث شقاً على طول الغشاء الجنيني باستخدام إبرة تشريح زجاجية. قم بوخز الأجنة في منطقة الدماغ، ثم ارفعها وانقلها لتوضع في صفوف على الزجاج. بعد ذلك، قم بتشريح كل جنين لعمل شريحة طولية.

في نهاية هذا الإجراء، ستحصل على شريحة تحتوي على صفوف من أجنّة سمك المبروك (filet). وهي الآن جاهزة للتثبيت. مرحباً، أنا بيتر لي، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر كايزن بقسم البيولوجيا في معهد كالتيك.

مرحباً، أنا آشلي رايت، طالبة دراسات عليا في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا (Caltech) في مختبر كايزن. أنا كايزن، أستاذ في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا (Caltech)، وتعمل مجموعتي البحثية على تطوير الجهاز العصبي في ذباب الفاكهة. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتشريح أجنة opal الحية.

لقد استخدمنا هذه الطرق للبحث عن ربيطات المستقبِلات اليتيمة. ونقوم بذلك من خلال فحص مجموعات من السلالات التي تفرز البروتينات السطحية الخلوية بشكل مفرط عن طريق الصبغ الحي للأجنة باستخدام بروتينات دمج للمستقبِلات. كما نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة الأنماط الظاهرية الجنينية وإجراء الفحوصات الجينية.

لقد أجريت فحصاً للنقص في الأفعال الحركية على الأنماط الظاهرية للتوجيه. لذا، فلنبدأ. سيقوم بيتر بتوضيح كيفية القيام بذلك.

للبدء، استخدم ملعقة مسطحة لوضع بقعة من معجون الخميرة على لوحة تجميع بيض العنب (grape agri egg collection plate) بما يتوافق مع كل برميل من براميل غرفة تجميع الأجنة. بعد ذلك، احقن غاز ثاني أكسيد الكربون في أنابيب الذباب لتخدير الذباب. انقل بضع مئات من الذباب مباشرة إلى غرفة التجميع.

بعد ذلك، قم بتغطية الغرفة بصفيحة جمع البيض واضغط لأسفل. وباستخدام شريط تسمية بطول 20 بوصة، قم بربط الغرفة والصفيحة معاً بدءاً من منتصف صفيحة الآجار. سيتداخل الشريط فوق صفيحة جمع البيض. بعد استيقاظ الذباب، يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعتين أو ثلاث ساعات في وضع أفقي؛ وبعد التحضين، قم بالنقر على الذباب لأسفل واستبدل صفيحة الجمع.

إذا كان عدد الأجنة في كل قطاع من الطبق الذي تمت إزالته أقل من 100 جنين، استمر في إجراء عمليات الجمع كل ساعتين حتى يتم جمع عدد كافٍ من الأجنة. ويمكن تجميع الأجنة التي تم جمعها وفقاً للمواصفات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق.

لتعتيق الأجنة، ضع قطعة مبللة من ورق الترشيح الدائري بقطر 90 مليمتر في غطاء طبق بتري، ثم ضع طبق الجمع الذي يحتوي على الأجنة مقلوباً فوقها. قم بحضن الطبق للمدة المطلوبة وفي درجة الحرارة المحددة، وقم بتجهيز شريحة لتصنيف الأجنة وفرزها عن طريق وضع شريط لاصق مزدوج الوجه على الشريحة. بعد ذلك، ضع قطعة مستطيلة من أغار العنب على الشريحة.

يجب أن يكون وعاء التجميع (egger) كبيراً بما يكفي لاستيعاب خمسة إلى 10 صفوف من 10 إلى 15 جنيناً. وبمجرد وصول الأجنة إلى المرحلة المطلوبة، يتم إخراجها من الحاضنة. ثم تُنقل الأجنة المسنة من طبق التجميع إلى الشريط اللاصق مزدوج الجوانب.

باستخدام فرشاة رسم مبللة، قم بتوزيع الأجنة بالتساوي فوق الشريط اللاصق. وباستخدام مجهر تشريح GFP، افحص أجنة SOAR للتأكد من التعبير المناسب لـ GFP، والذي يشير إلى النمط الجيني. في هذه التجربة، يتم تحديد النمط الجيني عن طريق اختيار الأجنة التي تفتقر إلى التعبير عن الذراع المجعد الموازن، GFP.

بما أن التنميط الجيني للأجنة سيختلف اعتماداً على الموازن المستخدم، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب المرفق لمزيد من المعلومات حول تنفيذ هذه الخطوة. بعد ذلك، وباستخدام إبرة تشريح غير مدببة، قم بتثبيت الأجنة عن طريق دحرجتها بلطف فوق شريط لاصق مزدوج الوجه. في المرحلة 16، تكون الأمعاء قد انقسمت إلى ثلاث نطاقات.

بعد ذلك، تبدأ الأمعاء في تكوين أحزمة قطرية بالقرب من الذيل ثم تلتف، ويصبح الجنين أكثر وضوحاً. بعد ذلك، استخدم إبرة التشريح لتدوير كل جنين فوق الكوريون أو فوق أجنة أخرى. مع تجنب ملامسة الشريط، ارفع الجنين وانقله إلى شريحة أغار العنب.

قم بمحاذاة الأجنة المطلية على هذه الشريحة بحيث تكون جوانبها الظهرية ملامسة لشريحة الآجار والنهايات الخلفية متجهة للأسفل. ثم ضع الشريحة في طبق بتري يحتوي على ورق ترشيح مبلل، واترك الأجنة في درجة حرارة الغرفة حتى تصل إلى العمر المطلوب. ولأغراض التشريح، قم بتجهيز شريحة للتشريح الحي عن طريق قص قطعة مستطيلة صغيرة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه، ثم ثبت الشريط بالقرب من أحد طرفي شريحة super frost plus باستخدام قلم شمعي.

ارسم مستطيلاً بعرض الشريحة وطول يتراوح من 30 إلى 40 مليمتر حول الشريط. يجب أن تكون هناك مسافة تبلغ ثلاثة مليمترات تقريباً بين الشمع والشريط. بعد ذلك، انقل الأجنة من لوح الطبقة العظيمة إلى الشريط عن طريق قلب الشريحة وإنزالها برفق فوق الأجنة المصطفة بحيث يلامسها الشريط.

يجب توجيه الأجنة بحيث تكون النهايات الخلفية للأسفل. بعد النقل، ستكون الأجنة في وضعية تكون فيها الجهة الظهرية للأعلى على الشريحة؛ أضف على الفور كمية واحدة من XPBS فوق الأجنة لملء المستطيل الشمعي باستخدام إبرة تشريح زجاجية، والتي يتم تصنيعها بواسطة ساحب الإبر مثل إبرة الحقن. قم بالقص على طول الخط الناصف الظهري بدءاً من النهاية الخلفية للجنين.

الآن قم بوخز الطرف الأمامي للجنين وارفعه للأعلى. ابدأ من الأسفل، ثم انقل الجنين إلى يمين شريط اللاصق، مع إبقائه في المحلول المنظم. استمر في تشريح ونقل الأجنة، لتكوين صف منظم من الأجنة على الشريحة يطابق كل صف على لوح الزراعة (agri slab).

باستخدام إبرة التشريح، اضغط برفق على شرفات جدار الجسم لتثبيتها على الشريحة، مع تجنب شد المادة أو إزالتها من سطحها. يجب أن تلامس الإبرة فقط الزوايا الأمامية والخلفية عند الحواف الظهرية لجدار الجسم.

بما أن المحاور الحركية لا تمتد إلى هذا الحد. ومن الناحية الظهرية، تجنب لمس إبر الشريحة لأنها ستنكسر بعد نقل جميع الأجنة وتثبيتها على الشريحة. قم بإزالة الأمعاء من كل جنين عن طريق قطع الأمعاء الأربعة من منطقة الدماغ وسحب الأمعاء بأكملها بعيداً عن الجنين.

قم بإزاحة المعى الخلفي إلى الشريحة. بمجرد الانتهاء من جميع عمليات التشريح، استخدم ماصتين لتحليل العينات لإضافة مادة الفورمالدهيد بتركيز 5% في درجة حرارة الغرفة في وقت واحد إلى إحدى زوايا المستطيل الشمعي، وقم بإزالة المحلول من الزاوية المقابلة. استبدل محلول التثبيت ثلاث مرات باستخدام حجم إجمالي يبلغ حوالي 6 milliliters.

قم بتحضين الأجنة في محلول التثبيت لمدة 45 دقيقة. ومن المهم جدًا عدم السماح لسطح السائل (السطح المقعر) بملامسة الأجنة لأن ذلك سيؤدي إلى إتلافها. استخدم ماصة باست لإزالة معظم محلول التثبيت.

اغسل باستخدام PB S ثلاث مرات باستخدام طريقة ماصة باستير المزدوجة. ثم اغسل باستخدام PBT ثلاث مرات لنفاذ الأجنة. تجعل هذه الخطوة الأجنة أيضاً أقل حساسية للسطح المقعر.

بعد الغسلة النهائية، أزل PBT بعناية عن طريق إمالة الشريحة، ولمس زاوية المنطقة المحاطة بالشمع بمسحة Kim wipe لإزالة المحلول الزائد. وباستخدام ماصة محملة مسبقاً، أضف فوراً 200 microliters من محلول الحجب (blocking solution) واتركه لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة. وفي درجة حرارة الغرفة، أزل محلول الحجب باستخدام مسحة Kim wipe.

بعد ذلك، أضف فوراً 200 µL من الجسم المضاد الأولي المطلوب والمخفف في محلول الحجب. ضع الشريحة في طبق رطب واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في هذه التجربة، يُستخدم الجسم المضاد أحادي النسيلة 1D4 لوسم المحاور الحركية.

في اليوم التالي، أخرج الأطباق من درجة حرارة 4 °C واغسل الأجنة ثلاث مرات على منصة هزازة باستخدام PBT لمدة 15 دقيقة على الأقل في كل غسلة. في جميع خطوات الغسل، تأكد من وجود كمية كافية من PBT لغمر الشريحة بالكامل أثناء الهز. بعد غسل الأجنة، قم بحجب الشريحة كما فعلت سابقاً.

بعد عملية الحجب، أضف فوراً 200 µL من محلول الحجب والأجسام المضادة الثانوية، واحضن العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة؛ حيث يتم هنا استخدام Alexa 488 goat anti-US. يُستخدم الجسم المضاد الثانوي بالتزامن مع Rodine Phin لوسم الألياف العضلية. كرر عملية الغسل ثلاث مرات باستخدام PBT على المنصة الهزازة لمدة 15 دقيقة على الأقل لكل غسلة.

انقل الشرائح إلى حوض مختلف لإزالة بقايا المنظف. بعد ذلك، اغسلها مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. أخرج الشريحة من PBS وقم بإزالة معظم كمية PBS المتبقية من البئر باستخدام منديل كيميائي (chem wipe)، ثم أضف فوراً 500 microliters من glycerol بتركيز 70%.

بما أن للجلسرين نفس معامل الانكسار الخاص بالجنين، فإن تنفيذ هذه الخطوة سيجعل الصبغة أكثر وضوحاً؛ قم بتصفية الأجنة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل في درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بإزالة الجلسرين باستخدام منديل كيم وايب (KimWipe). إن إزالة معظم الجلسرين ستؤدي إلى تسطح الأجنة، بينما ستؤدي إزالة كمية أقل من الجلسرين إلى الحصول على بنية أكثر ثلاثية الأبعاد.

بمجرد إزالة الغليسرول، ضع غطاء شريحة رقم واحد. الأجنة الآن جاهزة للتصوير؛ حيث يمكن معاينة الأجنة المشرحة والمصبوغة باستخدام مجهر التألق المناعي. يظهر هنا جنين مُشرّح تم صبغه باستخدام الجسم المضاد 1D4 المخصص لوسم المحاور العصبية الحركية.

تشبه هذه الصورة في مظهرها الصور الأكثر شيوعاً التي استُخدم فيها الكيمياء النسيجية المناعية لإنزيم HRP للتصوير باستخدام الفلورة المناعية. ومن الممكن الحصول على صور ذات جودة أعلى تظهر فيها تفاصيل فروع المحاور الحركية بشكل أكثر وضوحاً. ويتيح التصبيغ المشترك باستخدام phin المسمى بـ rho domine، والذي يرتبط بالأكتين، التصوير المتزامن للعضلات.

يعطي هذا صورة أوضح لطبقات العضلات وتنظيمها مما يمكن الحصول عليه باستخدام صبغة HRP. هنا، تظهر المحاور العصبية الحركية باللون الأخضر، بينما تظهر العضلات باللون الأحمر. لقد شرحنا للتو كيفية تشريح أجنة Drosophila حية من مجموعات سلالات طافرة. عند تنفيذ هذه الإجراءات، من المهم البدء بسلالات سهلة مثل سلالات lio و armadillo و GFP المتوازنة، والعمل على سلالات قليلة في كل مرة.

مع اكتسابك مزيداً من الخبرة والسرعة في عمليات التشريح، يمكنك تشريح ما يصل إلى 10 سلالات يومياً، وهو ما سيتيح لك فحص مجموعة مكونة من 200 سلالة طافرة تقريباً في فترة زمنية تبلغ 20 يوماً أو نحو ذلك. لذا، فإن هذا الإجراء فعال للغاية بمجرد أن تصبح خبيراً في تنفيذ جميع الخطوات. هذا كل شيء، وشكراً للمتابعة، وبالتوفيق في تجاربكم.