Lensless على رقاقة التصوير من الخلايا يوفر أداة جديدة للإنتاجية عالية الأحياء الخلوي والتشخيص الطبي

في هذا الفيديو، يتم عرض إثبات المفهوم لنظام تصوير على الشريحة يعتمد على قائمة عدسات يسمى Lucas. يرمز Lucas إلى منصة مصفوفة مراقبة الخلايا ذات مجال رؤية فائق الاتساع والقائمة على قائمة عدسات وتعتمد على التصوير الظلي. وبخلاف إعدادات التصوير التقليدية، لا تتطلب منصة Lucas أي عدسات شيئية للمجهر أو مكونات بصرية ضخمة أخرى.

بالنسبة لجهاز Lucas، يتم وضع العينة المراد دراستها على شريحة مجهرية ويتم تغطيتها برفق بغطاء زجاجي مماثل. وباستخدام قلم تفريغ، يتم تحميل العينة على المنطقة النشطة من مصفوفة المستشعرات الإلكترونية البصرية. بعد ذلك، تقوم منصة التصوير بتسجيل الظلال أو الهولوغرامات الرقمية لعدسة كل خلية مستهدفة ضمن مجال رؤيتها.

يمكن للمعالجة الرقمية الآلية لظلال هذه الخلايا تحديد نوع الخلايا وعددها ومواقعها النسبية داخل المحلول. ويمكن أن يمتد مجال الرؤية إلى مساحة تصل إلى 18 centimeter squared مع عمق مجال يبلغ حوالي خمسة مليمترات. ومن ثم تتم معالجة صور الحيود المكتسبة رقمياً بواسطة خوارزمية اتخاذ قرار مطورة خصيصاً لتمكين توصيف وتحديد الخلايا أو الجسيمات المستهدفة.

يوفر Lucas منصة مصغرة تقلل من التكلفة وتزيد بشكل كبير من الإنتاجية للتجارب القائمة على التصوير، مما يجعلها متوافقة مع التقنيات المتقدمة والمتطورة في الموائع الدقيقة والبحوث البيولوجية. مرحباً، أنا من مختبر ROM Bio and Nano في قسم الهندسة الكهربائية بجامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس، وأنا أنتوني إيرلينجر، أيضاً من مختبر Nano and Biophotonics. سنعرض لكم اليوم إجراءً عالي الإنتاجية وعدسات لتصوير محلول SA غير متجانس مثل عينة دم كاملة.

يستخدم هذا الإجراء في مختبرنا تقنية تصوير مبتكرة، نطلق عليها اسم منصة مراقبة مصفوفة الخلايا ذات المجال فائق الاتساع وقائمة العدسات القائمة على التصوير الظلي، ونختصرها باسم Lucas. لذا، دعونا نبدأ. لبدء العملية، يتم الحصول على 3 mL من الدم الكامل وحبيبات مجهرية من البولي ستيرين بأقطار مختلفة مثل 5 و10 و20 µm، وتُترك لتصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

باستخدام ماصة سيرولوجية، أضف 2 mL من الوسط السائل التقليدي RPMI 1640 كعامل تخفيف في أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 5 mL. وبعد فترة ترسيب مدتها 30 دقيقة، اسحب 10 µL من عينة الكريات الحمراء من قاع أنبوب جمع الدم الكامل وانقلها إلى محلول RPMI. أضف حجماً إجمالياً قدره 20 µL من حبيبات البوليسترين الدقيقة إلى تخفيف الكريات الحمراء في RPMI، ورج محلول الخلايا عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة. انقل من 5 إلى 15 µL من المحلول غير المتجانس إلى شريحة غطاء باستخدام الملاقط.

ضع غطاءً زجاجياً ثانياً مماثلاً فوق المحلول. يجب أن تكون العينة محصورة بشكل متساوٍ بين الغطاءين الزجاجيين. بعد ذلك، وباستخدام قلم شفط تفريغي، قم بتحميل العينة على المنطقة النشطة من مصفوفة المستشعر من أجل التصوير.

بعد ذلك، يتم تحضير كاشف الصبغ المائي عن طريق دمج 0.1% من المحلول المنظم SNY ومحلول ميثيلين الأزرق الجديد (NMB) المخفف بنسبة حجمية تبلغ 2:1؛ يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب المرفق للحصول على تفاصيل تحضير محاليل SNY وميثيلين الأزرق. ثم في كؤوس بولي بروبيلين، يتم دمج كاشف الصبغ ACOA مع عينة الدم الكامل بنسبة حجمية 1:1، مع التقليب باستخدام خلاط مغناطيسي لمدة دقيقتين. بعد ذلك، يتم تحضين المزيج لمدة 10 دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم تحضين المحلول بإضافة 1.99 milliliters من محلول RPMI 1640 classic السائل في أنبوب بولي بروبيلين سعة 5 milliliters.

بعد ذلك، انقل 10 µL من محلول الدم المصبوغ إلى وسط RPMI لتحقيق نسبة حجمية تبلغ 1 إلى 200. ثم قم برج المحلول باستخدام جهاز Vortex لمدة 30 ثانية، واسحب بواسطة الماصة من 10 إلى 100 µL من محلول الخلايا المصبوغة لوضعها بين شرائح التغطية أو داخل خزان مائع دقيق. ثم وباستخدام قلم شفط مفرغ، ضع العينة على المنطقة النشطة من مصفوفة المستشعر.

تستخدم منصة Lucas مصفوفة من المستشعرات الإلكترونية الضوئية لتسجيل الهولوغرامات الرقمية للخلايا بدون عدسات. ولتحقيق هذا الغرض، تُستخدم أجهزة شحنة مقترنة أو CCDs لتمكين الإضاءة ذات الطول الموجي القابل للضبط؛ حيث يمكن استخدام مفرق لوني (monochromator) مزود بمصباح زينون مع ليف من السيليكا المنصهرة من الدرجة القياسية، والذي يتكون من حزمة من الألياف وثقب صغير بقطر يبلغ حوالي 100 µm يقع على ارتفاع يتراوح بين 5 إلى 10 cm تقريبًا فوق سطح المستشعر لتوفير إضاءة ذات طول موجي قابل للضبط. وتوفر الإضاءة ذات الطول الموجي القابل للضبط منصة مرنة حيث يمكن ضبط التواقيع الهولوغرافية للخلايا بدقة، كما يمكن تخليق تواقيع رقمية هجينة عن طريق دمج أكثر من طول موجي واحد لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتباين صورة Lucas.

لتحقيق توصيف أفضل ودقة أعلى، يتم تحميل العينات المحصورة بين شريحتين غطائيتين على المنطقة النشطة من مصفوفة المستشعر، حيث يتم إضاءتها بشكل موحد بواسطة مصدر الضوء. تسقط الهولوغرامات الحيودية لكل خلية أو جسم دقيق ضمن محلول غير متجانس على مصفوفة المستشعر لتشكل صورة لوكاس. وتتم معالجة صور حيود لوكاس المكتسبة بواسطة خوارزمية اتخاذ قرار مطورة خصيصاً، والتي تستخدم مكتبة إحصائية لصور الحيود من أجل التوصيف والتعرف الآلي على الخلايا المستهدفة أو الأجسام الدقيقة.

يوضح هذا الشكل صورة تقليدية باستخدام عدسة شيئية بقوة 40x لمحلول غير متجانس يتكون من حبيبات مجهرية من البوليسترين بأحجام 5 و10 و20 ميكرومتر، وخلايا دم حمراء. تختلف المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد، ومعامل الانكسار، والتعقيد البيني لهذه الجسيمات جميعاً عن بعضها البعض.

يمكن تمييز بعض هذه الميزات باستخدام مجهر تقليدي، ولكن ضمن مجال رؤية محدود للغاية يقل عن 0.5 مليمتر مربع في منصة Lucas. وتُظهر جميع هذه الجسيمات الدقيقة أنماطاً هولوغرافية مختلفة وفريدة تشبه بصمة الإصبع؛ وبناءً على ذلك، يمكن توصيفها دون أي غموض استناداً إلى أنسجتها ثنائية الأبعاد.

يمكن لنظام Lucas مراقبة مجال رؤية فائق الاتساع يمكن أن يصل حجمه إلى 10 إلى 20 سنتيمتر مربع، وهو أكبر بعدة رتب مقدارية من المجاهر القياسية القائمة على العدسات. هذه صورة مأخوذة باستخدام عدسة شيئية بقوة 40x لعينة دم كاملة ومصبوغة باستخدام منصة Lucas.

تتفاوت السمات الداخلية لكريات الدم البيضاء المصبوغة بكفاءة من خلال تعديل معامل الانكسار وخصائص التشتت لنوى الخلايا. ويقوم مصفوف الاستشعار بتسجيل أنماط حيود مميزة لكل خلية على حدة. وهذا يظهر ميزة أخرى لمنصة Lucas كأداة قوية لقياس التدفق الخلوي في نقاط الرعاية وللأغراض التشخيصية.

باعتبارها منصة مؤتمتة بالكامل للتوصيف السريع للخلايا المستهدفة، تتم معالجة صور حيود لوكاس رقمياً باستخدام برنامج اتخاذ قرار تم تطويره خصيصاً لهذا الغرض. في هذا الشكل، تقوم الواجهة بمعالجة خليط غير متجانس من خلايا الدم الحمراء والحبيبات الدقيقة. وتتميز الخوارزمية بقدرتها العالية على اكتشاف المناطق ذات الكثافة العالية، بالإضافة إلى الجسيمات ذات نسبة الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة، مثل الحبيبات ذات الحجم 3 µm.

تظهر هنا صورة معالجة في واجهة Lucas المخصصة. يتيح البرنامج إدخال مواصفات مختلفة مثل حجم بكسل المستشعر أو الطول الموجي للإضاءة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحديدات لأجزاء من الصورة وتحديد أنماط الخلايا.

يتم عدّ العينة بناءً على هذه البيانات، وتُعرض الصورة المحددة للمستخدم. لقد قدمنا لكم للتو كيفية تصوير وتوصيف الخلايا باستخدام منصة Lucas عالية الإنتاجية. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن التجارب الموضحة يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الخلايا والجسيمات الدقيقة.

كما أنها تتيح توصيف الخلايا في مجال واسع للغاية وبإنتاجية عالية لمحلول غير متجانس. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.