تحلل الدم ميكروفلويديك الآلي بروتوكول لتخصيب اعارة خلايا الأنوية

لإثراء الخلايا ذات النواة المنتشرة في الدم. يتم أولاً تحضير الجهاز الموائع الدقيقة (microfluidic device) باستخدام XPBS واحد للتخلص من الفقاعات، ثم يتم تمرير ماء منزوع الأيونات و2% paraldehyde في XPBS اثنين عبر الجهاز باستخدام مضخات حقن قبل تحميل عينة الدم. بعد ذلك، تتم معالجة الدم من خلال جهاز الموائع الدقيقة وجمعه، وتشمل مرحلة ما بعد معالجة العينة عملية الطرد المركزي وإزالة السائل الطافي (supernatant).

أخيراً، يتم تحليل العينة عن طريق قياس التدفق الخلوي لإنتاج مخططات fax. مرحباً، أنا ويليام وايت من مختبر التكنولوجيا الحيوية مجهرية النطاق في قسم الهندسة الحيوية بجامعة Wool. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإثراء الخلايا النواوية الدائرة عن طريق تحلل الدم الكامل عبر الموائع الدقيقة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الالتهابات في عمليات مرضية مختلفة لضمان إثراء الكريات البيضاء والخلايا الأخرى ذات النواة في الدورة الدموية دون فقدانها أو تنشيطها. لذا، لنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بتركيب أنابيب وصول ذات قطر أكبر قليلاً من فتحات الوصول للقناة في فتحات المدخل والمخرج.

ثم لتوفير الواجهة بين النطاق الكلي والنطاق المجهري، قم بتثبيت إبرة محقنة قياس 30 gauge في الأنبوب الموجود عند كل من المداخل. بعد ذلك، املأ محقنة سعة 1 mL بمحلول one XPBS مع التأكد من التخلص من الفقاعات. صِل المحقنة بالمدخل الأول وادفع المحقنة بلطف يدويًا حتى يتدفق محلول one XPBS من المدخل الثاني.

ثم قم فوراً بغلق المدخل الثاني باستخدام مشبك ورق مكتبي. استمر في دفع المحقنة حتى يصل محلول XPBS إلى منفذ المخرج في الجهاز الموائع الدقيقة. وبمجرد تدفق المحلول من المخرج، قم بغلق أنبوب المخرج باستخدام مشبك ورق آخر.

استمر في دفع محقنة الـ 1 mL بشكل إضافي حتى يتدفق XPBS من المدخل الثالث، ثم قم بتثبيت فتحة المدخل الثالث باستخدام مشبك مكتب ثالث. وبذلك يكون الجهاز الموائع الدقيقة قد تم تحضيره بالكامل. ابدأ في معايرة مضخات المحاقن باستخدام مضخة محاقن Harvard الكبيرة، مع ضبط تكوين القطر على 22.5 mm ومعدل التدفق على 600 µL/min.

بالنسبة لمضخة حقنة هارفارد الصغيرة، اضبط تكوين القطر على 4.61 millimeters ومعدل التدفق على 20 µL في الدقيقة. بعد ذلك، املأ حقنة سعة 30 milliliter بالماء منزوع الأيونات عن طريق سحب المحلول مباشرة من أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

تذكر وضع ملصق تعريف على المحقنة، ثم املأ محقنة أخرى سعة 30 milliliter بمحلول XPBS 2%paraform aldehyde. مرة أخرى، اسحب السائل مباشرة من أنبوب مخروطي وضع ملصق تعريف على المحقنة. الآن قم بتوصيل المحقنة التي تحتوي على الماء بالمدخل الثاني، ومحقنة XPBS 2%para formaldehyde بالمدخل الثالث، مع التأكد من عدم وجود فقاعات محبوسة في الأنابيب أو في الجهاز الموائع دقيق القنوات.

بعد ذلك، قم بإزالة المشابك من المدخل الثاني، والمدخل الثالث، وأنبوب المخرج مع توصيل المحاقن الثلاث جميعاً. انتقل إلى وضع المحقنتين الكبيرتين معاً على مضخة محاقن هارفارد الكبيرة، وضع محقنة الواحد مللي لتر على مضخة محاقن هارفارد الصغيرة. ضع أنبوب المخرج في أنبوب جمع نفايات مخروطي سعة 50 مللي لتر.

قم الآن بتشغيل مضخة حقن هارفارد الكبيرة التي تحتوي على محاقن سعة 30 milliliter واتركها تعمل لمدة دقيقة واحدة. تحقق من عدم وجود فقاعات أو تسريب في الجهاز أو في الأنابيب. بعد ذلك، قم بتشغيل مضخة حقن هارفارد الصغيرة واتركها تعمل لمدة دقيقة إضافية هنا أيضاً.

التحقق من وجود فقاعات وتسرب. أوقف المضخات بعد دقيقتين. وبما أن الجهاز الموائع الدقيقة أصبح الآن جاهزاً للاستخدام مع عينات الدم، فقد جُمعت عينات الدم المراد تحليلها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق، وتُستخدم في غضون ساعة واحدة من وقت الجمع.

يتم التخلص من أنبوب الدم الأول الذي تم جمعه لتجنب النتائج الإيجابية الكاذبة. قم بإزالة سرنجة سعة 1 mL من مضخة سرنجات Harvard الصغيرة، ثم احقن 1 XPBS من السرنجة سعة 1 mL لملء إبرة السرنجة. ولتجنب إدخال الفقاعات، املأ سرنجة سعة 1 mL بـ 50 µL من 1 XPBS دون حبس أي فقاعات.

بعد ذلك، املأ المحقنة بـ 0.5 milliliters من الدم. حافظ على وضع المحقنة بشكل رأسي أثناء الملء لتجنب اختلاط PBS مع الدم. ثم، أعد توصيل المحقنة التي تحتوي على الدم بالمدخل الأول.

امسح أي سائل زائد وثبّت المحقنة رأسيًا على مضخة محاقن Harvard الصغيرة. كن حذرًا حتى لا تدفع الدم عبر الأنابيب إلى الجهاز. انزع أنبوب المخرج من أنبوب النفايات وضعه في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 milliliter موضوع في دلو ثلج.

ابدأ الآن التشغيل بتشغيل مضخة هارفارد المحقنية الكبيرة أولاً واتركها تعمل لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بتشغيل مضخة هارفارد المحقنية الصغيرة. ستبدأ العينة في التجمع من أنبوب المخرج في أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter.

اترك عينة الدم الموجودة في سرنجة سعة 1 مل تمر بالكامل عبر الجهاز، وهو أمر يستغرق 20 دقيقة تقريباً. ثم أوقف كلتا المضختين. والآن بعد اكتمال التشغيل، قم بطرد العينة التي تم جمعها مركزياً لمدة خمس دقائق عند 350 ×g في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل المكبح.

قم بإزالة الطافي عن طريق وضع طرف الماصة في الجانب المقابل للراسب الأبيض. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الطافي، وخاصة حطام الخلايا الحمراء، دون تعكير الراسب الأبيض. أعد تعليق العينة في 1 mL من محلول تدفق منظم يحتوي على 1% BSA و 2% para formaldehyde في 1 XPBS عن طريق الماصة.

قم بنقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، ثم قم بطرد العينة المجموعة لمدة خمس دقائق عند 4×g. في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة الطافي بعناية كما في خطوة الطرد المركزي السابقة. أخيرًا، أضف 1 milliliter من محلول التدفق المنظم (flow buffer) مع الرج باستخدام جهاز vortext لإعادة تعليق العينة، ثم ابدأ في تحليل العينة عن طريق قياس التدفق الخلوي (flow cytometry).

سنعرض الآن بعض النتائج التمثيلية في شكل مخططات تدفق خلوي (fax plots) لعينة دم تم إثراؤها بواسطة الجهاز الموائع دقيقة التحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي. تظهر أهمية الإثراء عن طريق التحلل في مخطط تدفق خلوي حيث تظهر سحابة من خلايا الدم الحمراء. أما المخطط المبعثر الناتج عن بروتوكول الإثراء بالموائع الدقيقة فهو مخطط مبعثر نقي يحتوي على مجموعات محددة من الخلايا المنواة الموجودة في الدورة الدموية.

تمثل المنطقة الحمراء الخلايا اللمفاوية، وتمثل الخضراء الخلايا الوحيدة، وتمثل الزرقاء الخلايا المحببة، بينما لم يتم توصيف المنطقة الأرجوانية بعد. يؤدي الفشل في إزالة بقايا الخلايا الحمراء في البروتوكول إلى ظهور تجمع من الأحداث في مخطط fax الظاهر في المنطقة السماوية. ويمكن تصور مجموعات الخلايا في مخططات fax منفصلة.

يتم تحديد الخلايا اللمفاوية باستخدام CD three و CD four، والخلايا الوحيدة باستخدام CD 14، والخلايا المحببة باستخدام CD 66 P. لقد عرضنا للتو كيفية تحضير وتشغيل عينة دم باستخدام جهاز تحلل الدم ميكروفلويديك. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تشغيل عينة الدم فوراً لضمان عدم اختلاط PBS بالدم قبل دخوله إلى الجهاز، ولتجنب دخول فقاعات الهواء إلى قنوات الجهاز.

هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.