Name: تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: تعلم تقنية تسجيل استجابات الفلاش من الخلايا المخروطية الفردية للفأر باستخدام قطب الشفط. يوضح الفيديو تشريح الشبكية وعزل الخلايا الضوئية لدراسة وظائف المستقبلات الضوئية في علم الأعصاب البصري.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بدعم من جائزة التطوير المهني من البحوث للوقاية من العمى ، المعاهد الوطنية للصحة منح EY 019312 ، ومنح غير مقيدة من البحوث للوقاية من العمى وEY 02687 (قسم علوم طب وجراحة العيون والبصرية في جامعة واشنطن).

صنع الأقطاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل أقطاب تسجيل باستخدام مجتذب micropipette وتلميع كهربائي مع خيوط التسخين تحت المجهر. لتسجيل الماوس مخروط الشفط وحيدة الخلية ، وقطرها الداخلي على الطرف الكهربائي حوالي ميكرومتر 6-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أقطاب المرجعية. آغار تزن 1 ٪ في الماء المقطر. تذوب الحل أجار في حمام ماء ساخن. ملء ماصات زجاجية (L = 100 مم ، OD / ID = 1/0.75 ملم) مع آغار 1 ٪ باستخدام المحاقن. يصلب أجار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ماصات إلى نصفين باستخدام سكين الماس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع الأقطاب المرجعية في حل مرجع ما لا يقل عن 24 ساعة في 4 درجات مئوية. </li></ol> إعداد تجربة <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكيف مع الظلام ماوس في قفص الأسود بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 مل حل مرجع و 1 حل نضح L (أنظر أدناه) ، وتصفية الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل جيش صرب البوسنة 0،1 ٪ والجلوكوز 10 ملم في 20 مل حل المرجع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة كثافة ضوء مشجعا البصرية باستخدام مضواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل غرفة تسجيل على مرحلة من مراحل المجهر المقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقاعة الحل نضح مع 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2 ، واحتضان في حمام مائي 40 ° C لزيادة ذوبان ثاني أكسيد الكربون 2. الحل ينبع من الزجاجة إلى غرفة تسجيل يمر السيراميك المقاوم الاحترار إلى 36-38 درجة مئوية. يجب أن يكون موجودا المدفأة أقرب إلى غرفة تسجيل وقت ممكن ، ويفضل في هذه المرحلة من المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط منظم التدفق لمعدل تدفق حوالي 1-1،5 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء القطب تسجيل مع حل المرجع. إدراج القطب في القطب حامل. تأكد من عدم وجود فقاعات في القطب. تركيب على حامل headstage من مكبر للصوت. توصيل حامل بجهاز شفط ، والتي بنيت من خلال ربط أنابيب مملوءة جزئيا مع الزيوت المعدنية إلى جانب منفذ لصاحب القطب. يتم توصيل الطرف الآخر من الأنبوب إلى خزان صغير من الزيوت المعدنية ، والتي يمكن تطبيقها على الضغط عن طريق الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الكهربائي إشارة إلى القطب الآخر من headstage. ربط الزوجين الحرارية (TC) إلى القطب المرجع. تأكد من وجود قطب ونصائح TC هي قريبة من بعضها البعض بحيث يتم أخذ القراءة درجة حرارة قريبة من الخلية ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الأشعة تحت الحمراء لإنارة تصور القطب. ويعتبر القطب بواسطة كاميرا الأشعة تحت الحمراء إلى جهاز اتصال. مركز الصورة في الحقل الكهربائي البصرية وجهاز العرض باستخدام تتلاعب الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف من وثيقة مرجعية غيض الكهربائي (2-4 ملم) إلى تسجيل غيض الكهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الجهد العاصمة للتدفئة ذلك أن درجة حرارة الحل هو حوالي 36-38 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل اختبار للتحقق من ختم مقاومة القطب التسجيل ، عادة حوالي 900 أوم. </li></ol> عزل الشبكية الماوس <ol start="18" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت ضوء أحمر خافت ، الموت ببطء الماوس داكنة تكييفها مع ثاني أكسيد الكربون (2) وخلع عنق الرحم. بمناسبة مقل العيون باستخدام غيض من الشعلة المعدن الساخن قبل كيها النقطة الأكثر الظهرية للالصلبة قليلا. استأصل في مقل العيون باستخدام المقص. يتم تنفيذ كافة الإجراءات اللاحقة تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect مقل العيون تحت المجهر مع إضاءة الأشعة تحت الحمراء والمحولات الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القرنية والعدسة. إزالة أكبر قدر من زجاجي ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسجيل ردود M - المخروط ، وإزالة جزء من بطني فنجان العين 4 بشفرة حلاقة الحكم من علامة الكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر الشبكية من طبقة الظهارة الصبغية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتسطح في الشبكية ووضعها على الجزء السفلي من طبق بيتري مليئة 1-2 حل مرجع مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة الشبكية إلى قطع صغيرة رقيقة باستخدام شفرة حلاقة واحتضان إعداد في مربع الضوء محكم مشبع بالأكسجين النقي. </li></ol> تسجيلات <ol start="25" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف المدفأة مؤقتا. التبديل تدفق نضح إلى الأنابيب الالتفافية لمنع الغرفة من التجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نزوح أكثر من الحل في الغرفة باستخدام قطعة من النسيج Kimwipe. نقل تعليق الشبكية إلى غرفة تسجيل باستخدام ماصة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حوالي 2 دقيقة حتى تستقر شرائح شبكية العين. تبديل نضح مرة أخرى. تشغيل جهاز التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على إضاءة الأشعة تحت الحمراء لإعداد تصور. بحث عن قطعة من شبكية العين ملقاة على غرفة مع شرائح مبصرة تخرج الخارجي (انظر الشكل سبيل المثال). رسم قطاعات الداخلية برفق في القطب بواسطة الشفط. في هذا التكوين ، ينبغي لفت نوى عدة وقطاعات الداخلية في القطب. سجل photoresponse إلى ومضة مشرقة لاختبار ما إذا كان الجزء المخروطي الداخلية في القطب ، وما إذا كانت الخلية شفاءخاصتك ، استنادا الى الاستجابة الحركية والسعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض الخزان المعدنية لتطبيق ضغط سلبي طفيف على غيض من القطب للمساعدة في عقد الجزء الداخلي في القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل للتجارب فلاش الاستجابات من قاتمة لشدة مشرق بمجرد العثور على خلية جيدة. وتقدم ومضات من منشط اختبار بصري معايرة 5. يتم التحكم في كثافة الفلاش والطول الموجي من خلال مجموعة من مرشحات الكثافة محايدة ، وتضييق نطاق التدخل المرشحات ، على التوالي. يتم التحكم اختبار فلاش مدة (20 مللي) عن طريق الكمبيوتر يحركها مصاريع. </li></ol> الحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماوس حل نضح : 112.5 ملي كلوريد الصوديوم ، و 3.6 ملي بوكل ، 2.4 ملي MgCl 2 و 1.2 ملي CaCl 2 ، 10 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة) ، و 20 ملي NaHCO 3 ، 3 مم نا سكسينات ، 0.5 ملي نا الغلوتامات ، 0.02 مم EDTA ، و 10 ملي الجلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الماوس الكهربائي التسجيل : كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 3.6 ملم بوكل ، 2.4 ملي MgCl 2 و 1.2 ملي CaCl 2 ، 3 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة) ، 0.02 مم EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

وقد وضعت وحيدة الخلية تسجيل الشفط من خلايا مستقبلة للضوء 3 عقود مضت. انها تمكننا من تسجيل عبر غشاء تغيير الحالي الناجم عن ضوء التحفيز دون اختراق غشاء الخلية. بسبب التصاق الخلية خلية عالية ، وأنه من الصعب عزل قضيب واحد صحي والمخروط من شبكية العين شبكية العين مثل الماوس البرمائيات وانه من الصعب العثور على المخاريط الفردية نظرا لانخفاض نسبة (3 ٪) وحجم صغير. الجزء الداخلي ، في (IS - في) طريقة تسجيل يتغلب على هذه الصعوبة من خلال تسجيل الحالي من شرائح الداخلية للمبصرات عدة ، من بينها يم...

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

وقضيب مبصرات مخروط في شبكية العين هي المسؤولة عن الكشف عن الضوء. في الظلام ، ودوري النوكليوتيدات بوابات (CNG) القنوات في الجزء الخارجي مفتوحة وتسمح باستمرار تدفق الكاتيونات إلى الداخل عبر الغشاء ، depolarizing الخلية. التعرض للضوء مشغلات إغلاق قنوات الغاز الطبيعي المضغوط ، وكتل التدفق الداخل الموجبة الحالية ، وبالتالي يؤدي إلى فرط الاستقطاب الخلية. استنادا إلى قطبية مبصرات ، تم تطوير طريقة تسجيل الشفط في 1970s أنه ، خلافا للأسلوب الكلاسيكي التصحيح ، المشبك ، لا يتطلب اختراق غشاء البلازما<sup&gt; 1</sup&gt;. الرسم الجزء الخارجي إلى ماصة الزجاج بإحكام تركيب مليئة حل خارج الخلية يسمح بتسجيل التغيرات الحالية في الخلايا الفردية عند التعرض للتجارب فلاش. ومع ذلك ، هذا الراسخة &quot;، الجزء الخارجي في (OS في)&quot; تسجيل الشفط ليست مناسبة لتسجيلات مخروط الماوس ، وذلك بسبب انخفاض النسبة المئوية للالمخاريط في شبكية العين الماوس (3 ٪) ، والصعوبات في تحديد مخروط شرائح الخارجي. مؤخرا ، تم تطويره على قطعة داخلية ، في (IS - في) تسجيل التكوين أن يوجه الجزء الداخلي / المنطقة النووية لمبصرة في تسجيل ماصة<sup&gt; 2،3</sup&gt;. في هذا الفيديو ، وسوف نعرض كيفية تسجيل من الفردية photoresponses المخروط باستخدام الماوس وحيدة الخلية الكهربائي الشفط.

وسوف نظهر كيف يمكن تسجيل ردود فلاش من المخاريط ماوس واحدة باستخدام القطب الشفط.

تعد المستقبلات الضوئية من العصي والمخاريط في الشبكية مسؤولة عن اكتشاف الضوء. وفي الظلام، تكون القنوات البوابية ذات النوكليوتيدات الحلقية (CNG) في القطعة الخارجية...

يوضح هذا الفيديو عملية تشريح شبكية فأر، ومن ثم الحصول على تسجيلات بالشفط من خلية واحدة للمخاريط. يتم كي مقلتي عين فأر تم قتله رحيمًا وكان متكيفًا مع الظلام عند الجزء الظهري، ثم تُنزع النواة تحت ضوء أحمر خافت. بعد ذلك، يتم تقسيم مقلتي العين إلى نصفين.على طول خط الاستواء، يتم بعد ذلك إزالة القرنية والأجزاء البطنية من مقلتي العين. تُعزل الشبكية الظهرية عن طبقة الظهارة الصبغية، وتُقطع إلى قطع صغيرة ورقيقة باستخدام شفرة حلاقة. ثم تُوضع شرائح الشبكية في غرفة التسجيل التي تتناسب مع منصة المجهر.يتم سحب عدة أجسام من الخلايا المستقبلة للضوء إلى قطب التسجيل. وعندما يتم سحب مستقبل ضوئي مخروطي إلى القطب، فإن ومضة اختبار ساطعة ستؤدي إلى استجابة ضوئية بسعة تتجاوز أربعة picoamps. مرحبًا، أنا جين من مختبر الدكتور مير كوبس في قسم طب العيون والحواس البصرية بجامعة واشنطن في سانت لويس.سنعرض لكم اليوم إجراءً لتسجيل الاستجابات الضوئية من مستقبلات ضوئية مخروطية واحدة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة خصائص التكيف في المخاريط الثديية، وهي المستقبلات الضوئية التي تتوسط الرؤية النهارية لدينا. لذا، دعونا نبدأ.قبل يوم واحد من التسجيل، يتم إجراء التجربة في الظلام. يتم تكييف الفأر بوضعه في قفص محكم الإغلاق ضد الضوء طوال الليل. استخدم جهاز سحب الماصات الدقيقة لتصنيع أقطاب التسجيل من أنابيب زجاج البوروسيليكات تحت مجهر مركب.استخدم سلك تسخين لإجراء عملية الحرق. قم بصقل طرف كل قطب كهربائي لتنعيمه وتقليل فتحته إلى القطر المطلوب. في حالة شفط خلية واحدة باستخدام القمع في الفئران، يجب أن يكون القطر الداخلي عند طرف القطب حوالي ستة إلى سبعة µm.قم بتحضير محلول agar بتركيز 1% في ماء مقطر. ضع المحلول في ماء مغلي لإذابة الـ agar. وبمجرد ذوبان الـ agar، انقله إلى حقنة واملأ الماصات الزجاجية بالمحلول.لتحضير الأقطاب المرجعية، اتركها لتتصلب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد تصلب الآجار، استخدم سكيناً ماسياً لقطع كل ماصة إلى نصفين لصنع قطبين مرجعيين. ضع الأقطاب المرجعية في قارورة وميض مليئة بالمحلول المرجعي وانقعها لمدة 24 ساعة على الأقل عند درجة حرارة 4 °C للسماح للمحلول بالتغلغل في هلام الآجار.يمكن استخدام الأقطاب المرجعية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر من تاريخ التحضير. يتم التخلص من الأقطاب المستخدمة بعد انتهاء التجربة. يتكون نظام التسجيل من مجهر مقلوب مثبت على طاولة تعليق هوائية لتقليل ضوضاء الاهتزاز، ومحاط بـ verity cage لتقليل الضوضاء الكهرومغناطيسية.يُستخدم ميكرو-معالج آلي (motorized micro manipulator) لتحديد موضع قطب التسجيل. ويتكون المحفز البصري من فتيلة تنجستن، ومغالقات يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر، وفلاتر بصرية للتحكم في الطول الموجي وشدة الضوء. كما يُستخدم مضخم تثبيت الرقعة (patch clamp amplifier) للكشف عن التيارات الغشائية من خلايا مستقبلات الضوء الفردية.سيتم تروية الأنسجة طوال فترة التسجيلات. ضع لترًا واحدًا من محلول التروية المُحضّر في حمام مائي بدرجة حرارة 40 degree Celsius بالقرب من نظام التسجيل. ثم باستخدام الأنابيب، قم بتوصيل محلول التروية بـ 95% oxygen و 5% carbon dioxide بحيث يتدفق الغاز فيه على شكل فقاعات باستمرار.باستخدام مقياس الضوء، قم بقياس القدرة الضوئية غير الموهنة المنبعثة من المحفز البصري، بحيث يوضع كاشف مقياس الضوء على منصة المجهر في المستوى الذي سيتم فيه وضع العينة. بعد ذلك، قم بتحويل القراءة المعطاة بالميكروواط إلى عدد الفوتونات لكل ميكرومتر مربع في الثانية لتقدير عدد الفوتونات لكل ومضة اختبار، مع مراعاة توهين الضوء بواسطة مرشحات الكثافة المحايدة.بعد قياس قدرة الضوء غير الموهنة، قم بإزالة المقياس الضوئي من المنصة وقم بتركيب غرفة التسجيل التي ستُستخدم في التجارب على منصة المجهر المقلوب. وباستخدام الأنابيب، قم بتوصيل زجاجة محلول التروية عبر صمام تنظيم إلى غرفة التسجيل، مع تمرير الأنابيب عبر مقاومة تسخين.تأكد من وضع المقاوم الساخن مباشرة قبل غرفة التسجيل. بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب التجاوز من صمام المنظم إلى غرفة التسجيل. ابدأ عملية التروية عن طريق فتح صمام منظم التدفق وضبطه على معدل تدفق يتراوح من 1 إلى 1.5 milliliters per minute.يتصرف محلول التروية من غرفة التسجيل إلى قارورة تجميع عن طريق الجاذبية. استخدم محقنة ذات إبرة غير حادة لملء حاملات الأقطاب الكهربائية بالمحلول المرجعي. وباستخدام إبرة محقنة دقيقة، املأ واغسل قطب التسجيل بالمحلول المرجعي، مع التأكد من عدم وجود فقاعات داخل القطب.أدخل القطب المرجعي في حامل الأقطاب وقم بتوصيله بالقطب المرجعي لمرحلة رأس المضخم. استخدم حلقة مطاطية لربط المزدوجة الحرارية بالقطب المرجعي. تأكد من وضع طرفي القطب والمزدوجة الحرارية بالقرب من بعضهما البعض لضمان أخذ قراءة درجة الحرارة في أقرب نقطة ممكنة من الخلية.ثم أدخل قطب التسجيل في حامل الأقطاب وثبّت الحامل بمرحلة الرأس الخاصة بالمضخم. وباستخدام أنابيب، قم بتوصيل خزان صغير من الزيت المعدني بالمنفذ الجانبي لحامل الأقطاب. سيؤدي الشفط الخفيف عن طريق الفم عبر الأنابيب المتصلة بالخزان إلى سحب الخلية إلى داخل القطب.باستخدام برنامج الكمبيوتر، افتح أحد غوالق المحفز البصري. ولتحديد منطقة حزمة الوميض التجريبي على منصة المجهر، قم بضبط تركيز المجهر على قاع غرفة التسجيل. وباستخدام الملاعب الدقيق، حرك القطب الكهربائي إلى مركز منطقة حزمة الوميض التجريبي.ضع القطب المرجعي بالقرب من طرف قطب التسجيل. اضبط جهد السخان بحيث تكون درجة حرارة المحلول في غرفة التسجيل حوالي 36 إلى 38 درجة مئوية. عند إجراء اختبار الختم، الذي يقيس الجهد عند سعة تيار محددة مسبقاً لحساب المقاومة، تحقق من مقاومة قطب التسجيل والتي تكون عادةً حوالي 900 kilo ohms.يتيح اختبار السد (seal test) الكشف عن وجود فقاعات في أقطاب التسجيل أو المرجعية، أو التحقق من عدم ملاءمة حجم طرف قطب التسجيل. يتم التحكم في اختبار السد برمجياً بواسطة برنامج الاستحواذ clamp X. وتظهر قراءة المقاومة على شاشة الكمبيوتر؛ فإذا كانت المقاومة منخفضة جداً، أي أقل من 500 kilo ohms، فمن المحتمل أن يكون طرف القطب كبيراً جداً، مما يتطلب تركيب قطب جديد.إذا كانت المقاومة أعلى من 1 milli ohm، فقد تكون هناك فقاعة موجودة في القطب الكهربائي أو أن طرفه ضيق للغاية، وسيتطلب القطب حينئذٍ عملية غسيل أو استبدال. وبمجرد أن يصبح جهاز التسجيل جاهزاً للعمل، قم بتحضير شرائح الشبكية للتجربة تحت ضوء أحمر خافت، واستخدم طرف إبرة التشريح الساخنة لكيّ الصلبة في أعلى نقطة ظهرية من كل مقلة عين لفأر تم القضاء عليه رحيماً وكان متكيفاً مع الظلام. ثم قم بإزالة النواة من مقل العين باستخدام المقص.استخدم ملاقط غير مدببة لنقل مقل العيون إلى مجهر تشريحي مجهز بإضاءة بالأشعة تحت الحمراء ومحولات صور بالأشعة تحت الحمراء. تُجرى جميع عمليات التشريح اللاحقة تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء. بعد ذلك، وباستخدام مقصات دقيقة، اقطع مقلة العين طولياً على طول خط الاستواء باستثناء نقطة الكي.استخدم ملاقط حادة لإزالة العدسة. بعد ذلك، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الجسم الزجاجي باستخدام رأس الكي كمرجع. استخدم شفرة حلاقة لإزالة الجزء البطني من تجويف العين.بعد ذلك، قم بإزالة القرنية. ثم استخدم الملقط لفصل الشبكية الظهرية عن طبقة الظهارة الصبغية. بعد ذلك، ضع الشبكية بحيث يكون جانب المستقبلات للأعلى في قاع طبق بتري جديد مملوء بـ 1 إلى 2 ملليلتر من محلول جلوكوز مرجعي بتركيز 10 millimolar مع 0.1%BSA، واضغط برفق على الشبكية باستخدام شفرة حلاقة لتسويتها.قطّع الشبكية إلى قطع صغيرة ورقيقة. بعد ذلك، قم بتحضين العينة في صندوق من النوع المضيء مشبع باستمرار بالأكسجين النقي قبل وضع شرائح الشبكية في غرفة التسجيل. أوقف تشغيل السخان مؤقتًا.قم بتحويل تدفق التروية إلى أنابيب التجاوز. ثم استخدم منديل كيم (KimWipe) لتصريف معظم المحلول من الغرفة. قم بتشغيل الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء.أخرج معلق الشبكية من الحاضنة وانقل الشرائح إلى غرفة التسجيل. وباستخدام ماصة نقل ذات فتحة واسعة، اترك الشرائح تستقر لمدة دقيقتين. وبعد استقرار شرائح الشبكية، أعد تشغيل التروية المباشرة والسخان.حدد جزءاً من الشبكية تبرز منه القطع الخارجية للمستقبلات الضوئية. ضع طرف قطب التسجيل فوق الطبقة النووية الخارجية للشبكية باستخدام الشفط الفموي. اسحب عدة أجسام من الخلايا المستقبلة للضوء برفق داخل القطب حتى تستقر الخلايا بداخله.قم بإعطاء ومضة اختبار مدتها 20 millisecond وطولها الموجي 500 nanometer. ويمثل التغير في التيار المتدفق عبر المستقبل الضوئي والمحفز بالضوء استجابة ومضة الاختبار. وتنتج المخروطية السليمة سعة استجابة قصوى تتراوح بين أربعة إلى سبعة pA.عند التحفيز بومضة اختبار غير مخففة، وبمجرد العثور على خلية جيدة، قم بخفض خزان الزيت المعدني برفق يدويًا لتطبيق ضغط سلبي طفيف على طرف القطب الكهربائي للمساعدة في تثبيت الجزء الداخلي من الخلية داخل القطب. إذا كانت الخلية مستجيبة، قم بتسجيل سلسلة من الاستجابات لومضات الاختبار بكثافة تتراوح من حد العتبة إلى مستوى التشبع.باستخدام هذه التقنية، يمكننا الحصول على الاستجابات الضوئية للمخاريط من شرائح شبكية الفأر بمساعدة قطب امتصاص. يظهر هنا تراكب لعدة تسجيلات من الخلية نفسها. تم تحفيز الاستجابات الضوئية لمخروط واحد عن طريق ومضات اختبار ذات شدة متزايدة، بدءاً من الشدة الخافتة التي تولد استجابة عتبية تبلغ حوالي 1 pico am هنا، وصولاً إلى الشدة الساطعة التي تولد استجابة مشبعة تبلغ حوالي 5.5 pico amper.مع زيادة شدة الوميض، تزداد سعة الاستجابة الضوئية حتى تصل إلى حالة التشبع. يتم إعطاء الومضات في الزمن الذي يساوي صفراً. سنوضح لكم كيفية تسجيل الاستجابات الضوئية من مستقبلات ضوئية فردية في ذبابة moscon باستخدام قطب الامتصاص.عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحصول على الجزء المناسب من الشبكية، وتقطيع الشبكية إلى شرائح رقيقة، والحفاظ على نظافة القطب الكهربائي من الفقاعات، وتقليل الضوضاء الميكانيكية والكهرومغناطيسية على حد سواء. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا وصف الإجراء لتوليد داكنة تكييفها شرائح من شبكية العين الماوس للتسجيلات الكهربية.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

ونحن تصف طريقة بسيطة نسبيا من transretinal التسجيلات (ERG) مخطط كهربية الشبكية للحصول على قضيب والمخروط photoresponses من شبكية العين الماوس سليمة. هذا النهج يستفيد من كتلة من انتقال متشابك من المستقبلات الضوئية لعزل ردودهم الخفيفة وتسجيلها باستخدام أقطاب الحقل وضعت في جميع أنحاء شبكية العين المسطحة التي شنت معزولة.

Transretinal تسجيلات ERG من شبكية العين الفأر: ورود Photoresponses المخروط

المصدر: Laboissonniere, et. al. تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لمجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية. J. Vis. Exp. (2017).   يوضح هذا الفيديو تقنية تتبع الفلورسنت لتحديد الأنواع الفرعية للخلايا العقدية الشبكية (RGC) في شبكية الفأر المعدلة وراثيا. تتضمن العملية تأمين شبكية العين المعزولة في غرفة التسجيل ، والحفاظ على صلاحية الخلية من خلال التروية المؤكسجة ، واستهداف RGCs المسمى بالفلورسنت باستخدام ماصة مع متتبع. من خلال تحليل التشكل الشجيري والتقسيم الطبقي ، تتيح الطريقة تصنيف...

تحديد الأنواع الفرعية لخلايا العقدة الشبكية للفأر من خلال تتبع الفلورسنت

المصدر:  Kulkarni, M.  et al. Imaging Ca2+ ديناميكيات في محطات المحطات المحورية المستقبلة للضوء المخروطية لشبكية الفأر. J. Vis. Exp.  (2015) يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم في المستقبلات الضوئية المخروطية لشبكية الفأر المعدلة وراثيا. يحدد خطوات تحضير شرائح الشبكية ، وتصوير أجهزة الاستشعار الحيوية للكالسيوم القائمة على FRET ، وتحليل التغيرات الفلورية لتحديد مستويات الكالسيوم تحت إضاءة الخلفية وتحفيز الضوء.

الفحص المجهري ثنائي الفوتون لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم في المستقبلات الضوئية المخروطية لشبكية العين

نحن تصف إعداد شرائح رقيقة من الشبكية المائية نمر السلمندر...

في وقت واحد تسجيلات خلية كاملة من المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الدرجة الثانية في البرمائيات إعداد شريحة الشبكية

الشبكية العصبية على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي على رأس 4٪ كتلة الجيلاتين. بعد عزل طبقة مبصرة (200 ميكرون) من خلال vibratome، هي المصنفة مبصرات بعد التفكك الميكانيكية والأنزيمية للثقافة. طبقة مستقبلة للضوء يمكن استخدامها لالجزيئية، التحاليل البيوكيميائية أو الزرع.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

سنوضح كيفية تحضير شرائح الشبكية من عين الفأر وتسجيل استجابات الضوء في الخلايا العصبية في الشبكية. يتم إجراء الإجراء بأكمله في ظروف مظلمة.

تسجيل الخفيفة أثار-الردود بعد المشبكي في الخلايا العصبية في الظلام تكييفها، الاستعدادات ماوس الشبكية شريحة عن طريق تقنيات المشبك التصحيح

وصفنا بروتوكول لمراقبة كا 2+ ديناميكية في محطات محوار مبصرات مخروط باستخدام إعداد شريحة فيفو السابقين في شبكية العين الماوس. هذا البروتوكول يسمح دراسات شاملة للمخروط الكالسيوم 2+ الإشارات في نظام المهم نموذج الثدييات، والفأر.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الكبار الثدييات مع الطائرة من باجتزاء موازية لسطح الشبكية. لم اقتطاع الحقول الجذعية من الخلايا العصبية للشبكية موجهة nonradially، والسماح للدراسة معالجة الإشارات مع تقنيات التصحيح، المشبك والتصوير.

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

هنا، نقدم نهج كومبيناتوريال لتصنيف أنواع الخلايا العصبية قبل العزلة ولتوصيف لاحقة من ترانسكريبتومس أحادية الخلية. هذا البروتوكول يحسن إعداد عينات لنجاح تسلسل الحمض النووي الريبي (رنا-سيق) ويصف منهجية مصممة خصيصا لتعزيز فهم التنوع الخلوي.

خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

نحن نصف طريقة للحصول على الثقافات الأولية من مستقبلات ضوئية مخروطية من شبكية العين من أجنة الدجاج واستخدامها لفحص محتوى عال.

مخروط المخصب الثقافات من شبكية العين من أجنة الدجاج لدراسة رود إلى مخروط التفاعلات الخلوية

تعلم تقنية تسجيل استجابات الفلاش من الخلايا المخروطية الفردية للفأر باستخدام قطب الشفط. يوضح الفيديو تشريح الشبكية وعزل الخلايا الضوئية لدراسة وظائف المستقبلات الضوئية في علم الأعصاب البصري.

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات