تصنيع وتشغيل إدخال الأوكسجين للثقافات الخلوية منتسب

يحتوي جهاز الإدخال الناقص للأكسجين على ستة أعمدة تعشش في آبار ستة. يتدفق غاز لوحة البئر عبر شبكة الموائع الدقيقة عند قاعدة العمود ويمكن أن ينتشر عبر غشاء PDMS المنفذ للغاز ، مما يفصل بين شبكة الغاز ووسائط الاستزراع. يقلل هذا الجهاز من طول مسار الانتشار بين مصدر الأكسجين ، وشبكة الموائع الدقيقة في قاعدة العمود ، والخلايا التي تسمح بتركيز أكسجين أكثر سرعة. التوازن.

الجهاز أيضا بتحكم أكبر بكثير في النمط المكاني للأكسجين المعرض للخلايا ، والذي يتم تحديده من خلال تصميم شبكة الغاز الموائع الدقيقة الذي تم إجراؤه بواسطة الطباعة الحجرية الضوئية القياسية باستخدام أقنعة الصور. مرحبا ، أنا شون أرد من مختبر الدكتور ديفيد إدينجتون في قسم الهندسة الحيوية بجامعة إلينوي في شيكاغو. مرحبا ، أنا إيلي أيضا من مختبر إدينغتون.

سنوضح لك اليوم كيفية تصنيع جهاز مخصص والتحقق من صحته واستخدامه لتعريض مزارع الخلايا في المختبر في صفيحة من ستة أضعاف لتركيزات مختلفة من الأكسجين. لقد استخدمنا هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثير الأكسجين على التئام الجروح وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية وهجرتها. لذلك دعونا نبدأ.

لبدء تصنيع الإدخال المؤكسج ، قم بإعداد Polymethyl Sloane أو PDMS بنسبة 10 إلى واحد بين البوليمر المسبق وعامل المعالجة. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، يضاف خليط PDMS إلى قالب تشغيل Dell تم تشكيله مسبقا منقوش لتقليد شكل لوحة ثقافة قياسية مكونة من ستة آبار. بمجرد معالجتها عند 75 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، ستشكل مجموعة الأعمدة المصبوبة المتماثلة الناتجة أول المكونات الثلاثة التي تشتمل على إدراج الأكسجين من أجل تصنيع المكون الرئيسي الثاني لإدراج الأكسجين.

يتم إعداد سيد SU ثمانية عن طريق الغزل الأول SU 8 21 50. على رقاقة السيليكون ، يتم تطبيق قناع صور على الرقاقة ويتعرض SU eight للأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع الصورة لإنشاء قالب رئيسي بسمك قناة صغيرة يبلغ 300 ميكرومتر. صب PDMS فوق SU eight Master ومعالجته لمدة ساعتين عند 75 درجة مئوية لإنتاج قالب إيجابي سيشكل في النهاية القنوات الدقيقة في الجزء السفلي من كل عمود.

يتم تصنيع المكون الثالث للجهاز عن طريق تدوير PDMS على رقاقة من السيليكون عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان ، متبوعا ب 900 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لتحقيق دماغ غشائي بسمك 100 ميكرومتر. نظرا لأن PDMs منفذة للغاز ، يمكن توصيل الأكسجين إلى القنوات الدقيقة مباشرة من خلال هذا الغشاء. بمجرد تحضير جميع المكونات ، يخضع كل سطح ربط لمعالجة بلازما الأكسجين لمدة دقيقة واحدة.

باستخدام جهاز بلازما محمول باليد ، قم أولا بربط مكونات القنوات الدقيقة الستة بمجموعة الأعمدة ، ثم قم بثقب فتحتين في كل عمود لتكون بمثابة مداخل ومخارج الغاز. أخيرا ، اربط الغشاء بأسفل القناة الدقيقة لتسهيل الترابط وطرد أي فقاعات. يتم ضغط الأسطح المعالجة بالبلازما معا لمدة دقيقة تقريبا باستخدام المزيج ، ونهاية زوج من الملقط ، وانتظر ساعة واحدة بين كل ربط للتأكد من أن الجهاز مرتبط تماما ويمكن معايرته.

بمجرد تصنيع جهاز كامل ، يجب معايرة مستوى الأكسجين الذي تتلقاه الخلايا عند استخدام ملحق الأكسجين في التجارب الفعلية. للمعايرة ، استخدم مستشعر الأكسجين الفلوري أو شريحة الثعلب ، والتي تحتوي على طلاء صبغة الروثينيوم الفلوري الذي يتم إخماده بالأكسجين. يتم قطع شرائح Foxy مسبقا لتناسب الجزء السفلي من ستة ألواح آبار.

يجب قطع الشريحة الثعلب لتغطية أكبر قدر ممكن من سطح البئر. نظرا لأن الشريحة الثعلب يبلغ سمكها حوالي ملليمتر واحد ، فقم بتعديل الجهاز للحفاظ على المسافة المطلوبة للحصول على غشاء مناسب. انتشار الشرائح.

تعتمد هذه المسافة على التجربة ، ولكن في معظم الحالات يجب أن تكون أقل من ملليمتر واحد باستخدام جهاز البلازما المحمول بأربعة مجهر زجاجي بسمك ملليمتر واحد. قم بتمرير أعمدة بطول ستة ملليمترات تقريبا وعرضها أربعة ملليمترات إلى أسفل الجهاز. سيستقر الجهاز على أعمدة أعلى قص الشريحة.

يمكن أيضا استخدام زلات الغطاء الزجاجي لفجوة انتشار تبلغ 0.17 ملم للتحقق من صحة استخدام الأكسجين. عند ثلاثة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة في آبار صفيحة الآبار الستة حيث سيتم قياس الأكسجين. ضع الجهاز في اللوحة وباستخدام برنامج التحول ، حدد عدد وموقع المواضع المطلوبة على مستشعر الثعلب

مرر لفحص تركيزات الأكسجين. قم بتوصيل أنبوب مسدس تاي بين خزان غاز الأكسجين وجهاز إدخال نقص الأكسجين. يتم استخدام منظم تدفق دقيق تم ضبطه على معدل تدفق يتراوح من 50 إلى 100 مل في الدقيقة للتحكم الدقيق في الغاز الذي يتم تسليمه.

التأكد من إغلاق منظم التدفق الدقيق. افتح منظم الجزء العلوي من الخزان أولا ، متبوعا بالمنظم الدقيق. قلل معدل التدفق إلى ما بين 10 إلى 20 في الدقيقة بعد 15 دقيقة.

لتجنب تكوين فقاعات في الماء ، راقب قيمة معدل التدفق عن كثب خلال الساعة التالية وقم بإجراء التعديلات حسب الحاجة لأن انخفاض الضغط سيتغير بينما يوازن النظام لتغيير معدل التدفق لالتقاط صور للوحة وأجهزة استشعار الثعلب يتم استخدام مجهر أوليمبوس التاسع 71 المجهز بالفلورة وكاميرا جهاز مزدوج الشحن من برنامج الحصول على الصور Q Imaging Tiga و SRV و Metamorpho. تم تجهيز المجهر ب Olympus 3 1 0 2 0 ، وهو مرشح فلوري متوافق مع الثعلب بطول موجة إثارة يبلغ 475 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 600 نانومتر.

لاختبار وقت التوازن ومدى الأكسجين للجهاز ، اختر ثلاث نقاط على الشريحة الثعلب لقياس تركيز الأكسجين. التقط صورة للشريحة مباشرة قبل بدء تدفق الغاز. التقط صورا وفواصل زمنية مدتها 10 ثوان على مدار 30 دقيقة أثناء تدفق الغاز عبر الجهاز لاختبار عدم التجانس وتوصيل الأكسجين.

قم بإنشاء نقاط متعددة على فترات ملليمتر واحد تمتد على عرض القناة وقياس تركيز الأكسجين على سطح البئر باستخدام التحول. قم بتصدير متوسط شدة الصورة لكل موضع وارسم تركيز الأكسجين حسب شدة التألق. قم بإنشاء منحنى معايرة عن طريق تركيب منحنيات خطية على خط صفر إلى 10٪ وخط 10 إلى 21٪ يتعلق بكثافة التألق بتركيز الأكسجين لكل موضع يمكن تصدير بيانات الكثافة الخام المقاسة من التحول وتحليلها بشكل أكبر باستخدام Microsoft Excel أو برامج إحصائية أخرى.

بمجرد معايرة الجهاز ، يمكن أن تبدأ التجارب مثل فحوصات التئام الجروح في الأوتوكلاف في الملحق المعاير عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في غضون 24 ساعة قبل التجربة والعمل معه في غطاء مزرعة التدفق الصفحي لمنع التلوث اللاحق. انقع حشوة PDMS المعقمة في وسط خال من المصل لمدة 24 ساعة لتثبيط فقاعات الغاز عند إدخالها في ثقافة الآبار الصفيحية أو خلايا MDCK أو الخلايا الملتصقة الأخرى إلى الطلاقة المشتركة بنسبة 100٪ في صفيحة من ستة آبار تخلق خدوشا مستقيمة في الطبقات الأحادية بطرف ماصة P 200. تحاكي الخدوش الجروح في الطبقة الأحادية الملتصقة.

استنشق وسائط الخلية دون إزعاج الطبقة الأحادية واشطفها بخمسة ملليلتر من الوسائط. استنشق مرة أخرى وأعد ملء الآبار بثلاثة ملليلتر من المصل الخالي. أدخل الجهاز برفق في اللوحة ، مع التأكد من تجنب الفقاعات.

تحريك الجهاز بزاوية أثناء الإدخال على طرد الفقاعات من جانب واحد. احرص على تجنب الضغط الزائد على الجهاز ، مما قد يؤدي إلى تشويه PDMS بدرجة كافية لسحق الخلايا الأساسية. ضع اللوحة والجهاز على مرحلة مجهر ساخن بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بتوصيل الأنبوب من خزان الغاز المصدر بمنافذ مدخل ومخرج الجهاز.

يجب أن تحتوي حاضنة الاستزراع على فتحة للسماح بدخول الأنبوب ويجب توصيل الأنبوب بعد وضع الجهاز في الحاضنة ، اتبع نفس الإجراء لبدء تدفق الغاز كما هو موضح سابقا لتقييم التئام الجروح التقاط صور بفاصل زمني للخلايا كل 20 دقيقة لمدة 15 إلى 18 ساعة باستخدام المعدات وبرامج التصوير كما هو موضح سابقا ، يمكن استخدام خوارزمية قياس الجرح لتحليل مساحة السطح غير الملتئمة بعد المدة التجريبية المرغوبة. أوقف تدفق الغاز ، وقم بإزالة اللوحة وانتقل إلى مزيد من معالجة الخلايا إذا رغبت في ذلك. يتطلب جهاز إدخال نقص الأكسجين أقل من دقيقتين ليستقر إلى 0.5٪ أكسجين كما هو موضح هنا.

كان حجم الفجوة السفلية لغشاء الجهاز عاملا حاسما في تحديد كفاءة التوازن مع أحجام الفجوات الأكبر التي تتطلب مزيدا من الوقت للوصول إلى قيم تركيز الأكسجين في الحالة المستقرة. يسمح الجهاز أيضا بقدر كبير من التحكم في الأكسجين المكاني في بئر واحد ، مما يسمح بتكوين ظروف متعددة وحتى توليد ملف تعريف أكسجين دوري عبر سطح البئر. تعرضت الطبقات الأحادية لخلية MDCK للأكسجين بنسبة 10٪ أو 21٪ وتم تحليل مساحة سطح الجرح بمرور الوقت باستخدام خوارزمية مخلفات الجرح الخدش MATLAB Ts.

بعد 11 ساعة من إجمالي 17 ساعة ، بقي 6.87٪ من الجرح الأصلي عند تعرضه ل 10٪ أكسجين بينما ظل 64.4٪ من الجرح أقل من 21٪ كما هو موضح هنا ، ترتبط تركيزات الأكسجين سلبا بمنطقة الجرح المفتوحة لكل من تركيزات الأكسجين. طوال مدة التجربة ، أوضحنا لك للتو كيفية تصنيع جهاز إدخال نقص الأكسجين والتحقق من صحته واستخدامه لمقايسة التئام الجروح الخدش. يوفر الجهاز عددا من المزايا مقارنة بأنظمة الأكسجين الأخرى مثل بصمة المختبر الأصغر والتحكم الأكبر بكثير في الأكسجين المكاني والزماني على سطح الخلية.

يمكن استخدام الجهاز من قبل أي مختبر تقريبا يدرس تأثير الأكسجين أو الغازات الأخرى مثل ثاني أكسيد الكربون على مزارع الخلايا في المختبر. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم نقع الجهاز المعقم ووسائط الثقافة طوال الليل ، وتقليل تكوين الفقاعة أثناء التجربة. بالإضافة إلى ذلك ، اسمح للنظام بالتساوي قبل بدء التجربة.

وذلك لأن معدل التدفق يتغير مع مساواة الضغط في النظام. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.