الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

تُعرض في هذا المقال المرئي تقنية PCR في الوقت الحقيقي باستخدام فحوصات Solaris QPCR. وتعد فحوصات Solaris QPCR عبارة عن مجسات وبادئات متخصصة في الجينات ومصممة للكشف عن جميع متغيرات الربط المعروفة لجين معين. وفي ظل ظروف الدورة الحرارية العامة، يحتوي مسبار Solaris على جزء رابط للأخدود الصغير ومراسل FA عند الطرف 5' ومخمد داكن محجوب عند الطرف 3'.

خلال خطوة المسخ في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR)، يظل المسبار في المحلول ويتم إخماد وميض مراسل FAM. وخلال مرحلتي الارتباط والاستطالة، ترتبط البادئات والمسبار بالتسلسل المستهدف، وينفصل المخمِد عن FAM. عندها يعطي FAM إشارة وميضية قوية، وعندما يتفكك المسبار يتم إخماد الوميض مرة أخرى.

يتم الحصول على نتائج PCR في الوقت الحقيقي تُظهر حساسية وخصوصية وقابلية تكرار هذا الفحص الفعال. مرحباً، أنا جيمس كوفينو من فريق البحث والتطوير في شركة Thermo Fisher Scientific في لافاييت، كولورادو. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإعداد تفاعل QPCR قياسي باستخدام كواشف Lars QPCR للتعبير الجيني.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تثبيط الجينات المستهدفة باستخدام تقنيات تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference). لذا، دعونا نبدأ. يتميز تحليل Solaris QPCR assay STEM بخوارزمية فريدة تستخدم تقنيات MGB والقواعد الفائقة (super base) لتوفير تحليل واحد مريح لـ 98% من الجينات المصنفة لدى البشر والفئران.

عادةً ما يكون تصميم مسبار الحمض النووي (DNA probe) والبادئ (primer) مقيداً بدرجة حرارة انصهار المسبار، والتي تحددها عدد القواعد ونوعها. وتتميز التسلسلات الأطول والتسلسلات الغنية بـ GC بدرجات حرارة انصهار أعلى. أما جزء الارتباط بالأخدود الصغير المستخدم في مسابير Solaris فيستقر داخل الأخدود الصغير للولب الحمض النووي DNA ويعزز من استقرار التفاعل بين المسبار والتسلسل المستهدف.

يؤدي ذلك إلى زيادة درجة حرارة الانصهار، مما يسمح باستخدام مجسات أقصر. كما تدمج خوارزمية Solaris بشكل انتقائي نيوكليوتيدات معدلة تسمى القواعد الفائقة (super bases) لتحسين استقرار روابط AT والقضاء على التجميع الذاتي لـ GG في التسلسلات الغنية بالجوانين. وهذا يسمح باستخدام تسلسلات مستهدفة كان سيتم تجنبها لولا ذلك.

تتيح مرونة التسلسل المتزايدة التي توفرها هذه التقنيات تصميم مجموعات من البادئات والمجسات (primer probe sets) التي تتعرف على جميع متغيرات الربط (splice variants) المعروفة لجين واحد. يرجى ملاحظة أنه تم دمج المناطق التي تمتد عبر الوصلات الإكسونية (exon junction spanning regions) في الموقع المستهدف كلما أمكن ذلك لزيادة النوعية من خلال تجنب تضخيم الحمض النووي الجينومي الملوث؛ وقد تم تحليل مجموعات البادئات والمجسات الناتجة باستخدام blast عبر ثلاث قواعد بيانات مختلفة: الجينومية، والنسخية، والجينات الكاذبة لضمان النوعية. علاوة على ذلك، تم تحسين مجموعات بادئات ومجسات Solaris بالكامل بحيث تكون ظروف الدورات لجميع فحوصات QPCR متطابقة، مما يسمح بتقييم تعبير نسخ مختلفة في عمليات PCR واحدة.

لبدء التخطيط لتجربة qPCR R، حدد الكواشف اللازمة لإجراء qPCR للجين المستهدف باستخدام ميزة البحث الذكي عن المنتجات المتاحة على thermo.com/solaris. انقر في مربع استعلام البحث واختر الكائن الحي المستهدف المناسب. يمكن لميزة البحث الذكي عن المنتجات معالجة العديد من معرفات الجينات المختلفة هنا.

أدخل أحد مصطلحات البحث المقترحة للجين المستهدف، ثم انقر على بحث، وحدد الجين المستهدف وانقر على اختيار في الجانب الأيسر. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة تعرض الكواشف المختلفة المتاحة للجين المستهدف. انقر فوق علامة تبويب الكشف بتقنية QPCR ضمن مقايسة Solaris للتعبير الجيني.

يظهر هنا اختبار بادئ مسبار Solaris المصمم بشكل مثالي. سيكشف هذا الاختبار الواحد عن جميع المتغيرات الوصلية المعروفة للجين المستهدف. بمجرد تحديد العامل المناسب للبادئ، ابحث عن جهاز qPCR cycler الذي سيتم استخدامه في القائمة وحدد المزيج الرئيسي المتوافق، سواء كان المزيج الرئيسي مع قارورة صبغة مرجعية خاملة منفصلة من ROX، أو مزيج ROX، أو مزيج ROX المنخفض.

سنستخدم هنا جهاز Roche light cycler 480، لذا سيتم استخدام master mix plus rock vial. ومن المهم أيضاً التأكد من تضمين جين مرجعي مناسب في هذه الدراسة، حيث سيتم استخدام B2M بمجرد استلام جميع كواشف Solaris QP CR.

يجب تخزينها في درجة حرارة -20 °C حتى وقت الاستخدام. وتظل الكواشف مستقرة لمدة 12 شهراً على الأقل. كما ينبغي تجنب تكرار عملية التجميد والإذابة.

قم بتحضير الـ CDNA من أجل الـ QPCR عن طريق إجراء تفاعلات النسخ العكسي على عينات الـ RNA. وبمجرد تحضير الـ CDNA، قم بإذابة مقايسة Solaris والمزيج الرئيسي (master mix) على الثلج. يحتوي المزيج الرئيسي على جميع مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستثناء المقايسة الخاصة بالجين، وتشمل مكونات القالب الثرموستات، والـ DNA polymerase dn، وTPS rocks.

إذا كان جهاز QPCR يتطلب استخدام أقراص موازنة ومحلول درئة تفاعل خاص يحتوي على صبغة زرقاء داخلية، فيجب توفير ماء بدرجة نقاء PCR وأطباق QPCR أيضاً. بمجرد إذابة المحاليل، اخلطها عن طريق النقر الخفيف، ثم قم بتدوير المحاليل لفترة وجيزة باستخدام جهاز الطرد المركزي لمنع فقدان الكواشف. بعد ذلك، قم بتحضير مقايسة Solaris QPCR بتركيز 1x والمزيج الرئيسي (master mix) في أنبوب سعة 15 milliliter.

من خلال الجمع لعدد العينات المطلوب تشغيلها على لوحة بها 384 بئراً، امزج 5 µL من 2x master mix، و0.5 µL من 20X Solaris assay، وماء بدرجة نقاء PCR بحيث يكون الحجم النهائي في كل بئر 10 µL. بعد إضافة cDNA، تأكد من تحضير كمية كافية لثلاث مكررات لكل عينة، بما في ذلك ضابط خالي من القالب NTC وضابط خالي من إنزيم النسخ العكسي no RT للتحقق من وجود كواشف ملوثة أو DNA جينومي ملوث على التوالي. بعد ذلك، انقل الخليط إلى خزان معقم.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل الحجم المناسب من المزيج الرئيسي (master mix) بتركيز 1x إلى الآبار المناسبة في لوح PCR. وفي حالة استخدام الألواح البيضاء، ستساعد الصبغة الزرقاء الداخلية المضافة إلى المزيج الرئيسي في تتبع تقدم عملية السحب والوضع. ويمكن تحليل العديد من مكتبات cDNA والجينات المرجعية في اللوح نفسه، نظرًا لأن جميع ظروف الدورات متطابقة.

بمجرد إضافة المزيج الرئيسي (master mix) بتركيز 1x إلى الآبار المناسبة، أضف قالب CD NA المخفف إلى كل بئر بحيث يكون الحجم النهائي 10 µL، مع السحب والضخ بالممصّة للمزج. قم بإغلاق اللوحة إما باستخدام سدادة لاصقة أو سدادة حرارية كما هو موضح هنا.

ضع الصفيحة في جهاز طرد مركزي وقم بتدويرها لترسيب الكواشف في قاع الفتحات وإزالة أي فقاعات قد تتداخل مع برنامج قراءات الفلورة. في جهاز التدوير الحراري، يجب تنشيط إنزيم البوليميراز ذو البدء الساخن في المزيج الرئيسي Solaris QPCR عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، لدورة واحدة، ثم 40 دورة من مسخ الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، تليها مرحلة التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. هذا البروتوكول موحد لجميع فحوصات Soliris QPCR، بغض النظر عن الجين الذي يتم تضخيمه.

أخيراً، ضع الصفيحة في جهاز QPCR وابدأ البرنامج. يوضح هذا الشكل الأداء العالي لمقايسات Solaris هنا، حيث تم تضخيم 10 تخفيفات بمقدار عشرة أضعاف من DNA الاصطناعي أو CDNA باستخدام مقايسات Solaris QPCR للتعبير الجيني لـ CDC 20 و F two RL one، وتظهر منحنيات التضخيم بمقياس لوغاريتمي والمنحنيات القياسية لـ 10 تخفيفات Log 10 الأداء العالي للمقايسة حتى في تركيزات الإدخال المنخفضة.

يتم قياس أداء كل مقايسة من خلال كفاءة قيمة المربع، والنطاق الديناميكي من 10، وتخفيفات log 10، والحد الأدنى للكشف. وتوضح البيانات المعروضة هنا قابلية تكرار مقايسات Solaris. وفي هذه التجربة، تم تضخيم حصص من CD NA في مختبرين متباعدين جغرافياً باستخدام مقايسات Solaris QPCR للتعبير الجيني والمزيج الرئيسي (master mix).

تم حساب مستويات التعبير ذاتها لهدفين جينيين في كلا المختبرين. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إعداد تفاعل QPCR قياسي باستخدام كواشف Solaris QPCR للتعبير الجيني. عند إجراء هذه التجربة، من المهم تذكر تحضير المزيج الرئيسي (master mixes) بالتركيز النهائي الصحيح للكواشف، وتضمين مكررات بيولوجية و/أو تقنية مناسبة.

بالإضافة إلى ذلك، من الضروري إعداد جهاز QPCR بظروف التدوير الحراري الصحيحة لـ Solaris. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.