Name: الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: تعلم تقنية التفاعل المتسلسل البوليميري الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام اختبارات Solaris لتحليل التعبير الجيني. تُظهر هذه الطريقة حساسية وخصوصية عالية في كشف المتغيرات الرناية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. الفحص العلمي الحرارية qPCR سولاريس تصميم الخوارزميات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخوارزمية المستخدمة في تصميم المسبار أزواج سولاريس / التمهيدي qPCR يضبط تيم كل مكون وبالتالي تمكين الدراجات ظروف عالمية. إدماج MGB ، أو ثانوية ملزمة الأخدود ، شاردة في التحقيق يزيد من تيم ويسمح للأقصر تحقيقات لتكون مصممة لمرونة أكبر وأداء الفحص. كما يوحي الاسم ، MGBs هي فئة من المضادات الحيوية التي يمكن أن تندرج في أخدود صغير من الحمض النووي الحلزون. وترد MGBs إلى نهاية 3 أو 5 من مسبار الحمض النووي. في الحل ، وتطفئ مضان مراسل FAM لجنة التحقيق التي فاكهه تقضي الكسوف المظلمة. عند التحقيق يربط تسلسل الهدف ، مما أدى إلى تغيير التشكل 3 - D التحقيق ق يسمح إشارة قوية الفلورسنت. واستقرت الملزمة لتحقيق الهدف تسلسل الحمض النووي لمن MGB ، والذي يسمح باستخدام المجسات ومحددة للغاية أقصر مع الحفاظ على درجة حرارة مناسبة للذوبان PCR. وهكذا ، كشف إشارة يحدث خلال مرحلة الصلب من التضخيم الهدف. خلال خطوة التمديد ، التحقيق MGB ينأى وتطفئ مرة أخرى مضان. لأن ينأى التحقيق ، فإنه لا يؤثر على كفاءة PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميزة أخرى من الخوارزمية سولاريس هو استخدام Superbases. يتم تعديل Superbases القواعد التي عززت قدرات ملزمة لتحسين الاستقرار والقضاء على السندات AT GG الذاتي الجمعيات في متواليات الغنية جوانين. وعلاوة على ذلك ، فإنها لا يشفي fluorophores المتاخمة المرفقة في نهاية 5. يتم وضع هذه القواعد بشكل انتقائي ، وفقا لخوارزمية ، لتوسيع نطاق توافر سلاسل الهدف. وهذا يجعل من الممكن استخدام متواليات ، مثل المناطق GC الغنية ، التي لولاها يمكن تجنبها في تصميم أجهزة الاشعال وتحقيقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلما كان ذلك ممكنا ، الخوارزمية سولاريس يضم مناطق تقاطع اكسون الممتدة في الموقع المستهدف. هذا يزيد من خصوصية من خلال تجنب التضخيم من الحمض النووي الجينومي الملوثات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأهم من ذلك ، الخوارزمية يحدد أيضا سلسلة الآراء لجميع المتغيرات لصق المعروفة ، بحيث يتم تغطية كل واحدة من قبل المسبار / مجموعة التمهيدي. لذا ، لا بد من فحص واحد فقط لجينة معينة من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا ، فإن الفحص qPCR سولاريس تصميم خوارزمية تستخدم المعلمات صارمة للغاية لاعتبارات التصميم الحرجة بما في ذلك المحتوى GC ، وطولها ، TM ، وتمتد من النيوكليوتيدات متجانسة. تسلسل الناتجة BLAST تحليلها لخصوصية استخدام 3 قواعد بيانات مختلفة : الجينومية ، نص ، وجين كاذب. </li></ol> 2. الحصول على الكواشف سولاريس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على سولاريس الكواشف المناسبة ، يمكنك زيارة <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / سولاريس</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الموقع انقر على "البحث عن منتج GENEius". للذهاب مباشرة إلى البحث GENEius المنتج ، انتقل إلى <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر في مربع البحث والتحري في اختيار الكائن المستهدف المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يمكن للبحث العديد من المنتجات GENEius عملية معرفات الجينات المختلفة. هنا ، تدخل أحد مصطلحات البحث للعثور على واقترح الجينات في المصالح ، بما في ذلك المرجع تسلسل الانضمام ، معرف الجينات ، والرمز الجيني ، ووصف جين ، معرف أو رقم سانجر الانضمام ، أو رقم الكتالوج. ثم انقر على "بحث". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على الجينات في المصالح والضغط على "اختيار" على الجانب الأيسر. وهذا فتح إطار يعرض مختلف المنتجات الحرارية العلمية المتاحة لهذا الجين من الفائدة. تحت عنوان "المنتجات" حدد "الكشف qPCR" الجدولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان "سولاريس الفحص التعبير الجيني" العنوان ، سترى أخرى مصممة بشكل أمثل سولاريس المسبار / الفحص التمهيدي. وهذا الاختبار غطاء واحد من كل المتغيرات لصق الجين المعروف الهدف الخاص بك. اختر الكمية المطلوبة. فهي متوفرة في 100 ، 400 ، 200 ، و 1000 X 25 التفاعلات ميكرولتر (إذا حددت مقايسة والتي هي من صنع النظام إلى أن حجم حزمة 100 لن تكون متاحة). بالنقر على "أضف إلى السلة". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، حدد المزيج المناسب للسيد cycler الحرارية التي سيتم استخدامها. لتحديد أي مزيج رئيسية ستعمل بشكل أفضل مع الجهاز المتاحة ، انقر على "البحث عن سيد ميكس الذي يعمل بشكل أفضل مع Cycler PCR بك!" </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على cycler qPCR التي سيتم استخدامها في القائمة لتحديد أي مزيج للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى البحث GENEius إطار المنتج ، واختيار المزيج المناسب الرئيسية. مزيج الرئيسي يأتي في 100 ، 400 ، 200 ، والأحجام رد فعل 1000. انقر على زر "إضافة إلى السلة". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا الإشارة الجينات اقترح ومستلزمات الصفحة اليسرى التوليف [كدنا] أن يؤمر لتحليل qRT - PCR كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل qPCR الكواشف سولاريس ، وتخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. وينبغي أن تلقى الكواشف التالية : حل 20X تحتوي على اثنين الاشعال المقدمة في 800 نانومتر لكل منهما وتحقيق تقدم في جين معين 200 نانومتر ، sequمعلومات عن التحقيق سينعقد على حد سواء ، وأجهزة الاشعال ، وسولاريس التعبير الجيني qPCR ميكس ماجستير في تركيز 2X. سولاريس التعبير الجيني فحوصات qPCR مستقرة لمدة لا تقل عن 12 شهرا. تجنب تكرار تجميد الذوبان. </li></ol> 3. qPCR الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ مع بروتوكول qPCR [كدنا]. وينبغي استخراج الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام أسلوب عمود الدوران. وأوصت اللجنة العلمية الحرارية عدة فيرسو [كدنا] تجميع لعكس النسخ لتوليد [كدنا]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير للذوبان والتي qPCR الشعائل وتحقيقات ، ومزيج الرئيسي على الجليد. كما تكون في متناولهم PCR المياه الصف ومبهمة لوحات qPCR البيضاء ، التي يمكن أن تحسن من حساسية في الوقت الحقيقي PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج يحتوي على جميع المكونات الرئيسية لPCR الوقت الحقيقي بما في ذلك : 1) بوليميريز الحمض النووي الحرارية ابدأ ، وإصدار الساخنة بداية بوليميريز الحمض النووي Thermoprime. ويستخدم هذا النوع من البلمرة لمنع غير محددة خلال تضخيم رد الفعل إعداد ويتطلب تفعيل الخطوة في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 2) dNTPs في مزيج ماجستير سولاريس ، dTTP يستبدل dUTP لتعظيم الكفاءة التضخيم 3) رد فعل الملكية العازلة ، الأمثل للعمل مع المقايسات التمهيدي / سولاريس التحقيق. هذا رد فعل المخزن يحتوي على صبغة زرقاء لزيادة التباين بين الكاشف والبلاستيك. 4) ROX ، إذا كان الصك الخاص qPCR يتطلب ROX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن تحسنت الحلول ، من خلال مزيج عبها الأنبوب (لا الدوامة). تدور عليهم لمنع فقدان كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وإعداد 15 مل أنبوب فالكون العقيمة لإعداد مزيج رد فعل لهذا الجين من الفائدة ، زائد واحد لهذا الجين المرجعية ، وزيادة اعتمادا على عدد من العينات. اعداد كافية من هذا القبيل يمكن ان ثلاثة مكررات تكون مستعدة لكل عينة ، بما في ذلك السيطرة قالب رقم (NTC) ، وعينات من منحنى القياسية ، إذا كان سيتم استخدام الأسلوب منحنى القياسية للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشغيل كل عينة على طبق من ذهب 96 كذلك ، مزيج ما يلي : 5 ميكرولتر من مزيج سولاريس 2X ماجستير qPCR ، 0.5 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي / دقق سولاريس (20X) ، ومثل PCR المياه الصف أن حجم رد الفعل النهائي مرة واحدة يضاف [كدنا] سيكون 25 ميكرولتر. لكل عينة تعمل على 384 لوحة مزيج جيد ما يلي : 12.5 ميكرولتر من مزيج سولاريس 2X ماجستير qPCR ، 1.25 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي / دقق سولاريس (20X) ، ومثل PCR المياه الصف أن حجم رد الفعل النهائي مرة واحدة [كدنا] وسوف يتم إضافة يكون 10 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor متعددة القنوات ، ونقل المزيج الرئيسي إلى الآبار المناسب للوحة. والصبغة الزرقاء المدرجة في مزيج رئيسية تساعد في تتبع التقدم pipetting على لوحات بيضاء. ثم ، تضاف 1-5 قالب ميكرولتر [كدنا] (لوحة 96 أيضا) أو 1-2 ميكرولتر من قالب [كدنا] (لوحة 384 أيضا). ماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. وضع لوحة في جهاز للطرد المركزي وتدور باستمرار لإزالة أي فقاعات ، وهذه سوف تتداخل مع قراءات مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج cycler الحرارية : يجب تنشيط الانزيم مع 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (1 دورة). ثم 40 دورة من 95 درجة مئوية ، وتمسخ لمدة 15 ثانية ، والصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الصك qPCR. بدء تشغيل البرنامج. </li></ol> ممثل النتائج qPCR باستخدام سولاريس <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. فحوصات الكشف عن إعطاء سولاريس موثوقة حتى بتركيزات منخفضة جدا المدخلات ، والحكم على كفاءة والقيم PCR R2. تم تضخيمها عشرة أضعاف التخفيفات 10 من [كدنا] تسلسل الاصطناعية توليفها من amplicon RNA أو تسلسل الحمض النووي amplicon على صك 7900HT ABI باستخدام سولاريس التعبير الجيني للF2RL1 qPCR الفحص أو CDC20 ، على التوالي. تظهر منحنيات التضخيم سجل النطاق والمنحنيات القياسية مع أداء كل مقايسة بما في ذلك الكفاءة والقيمة R2 ، دينامية مجموعة من التخفيفات LOG10 10 ، والحد الأدنى من الكشف. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. فحوصات سولاريس تعطي نتائج متسقة حتى بين مختلف الباحثين والمختبرات. وtransfected siRNAs استهداف ALDOA وPPIB ، فضلا عن عدم استهداف التحكم (NTC) ، إلى خلايا هيلا في 100 نانومتر و 10 و 1 و 0.1 تركيزات النهائي. وكان حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي مجموع عزل 48 ساعة بعد تلقي العلاج. تم تصنيعه باستخدام [كدنا] الحرارية العلمية كيت فيرسو التجميعي [كدنا]. تم تضخيمها وقسامة من [كدنا] في مختبرين منفصلين جغرافيا باستخدام سولاريس التعبير الجيني qPCR فحوصات للكشف عن ALDOA ، PPIB وGAPDH على LightCycler روش 480 (384 أيضا) منصة. تم احتساب ضربة قاضية باستخدام الأسلوب ΔΔCq (لتطبيع GAPDH إشارة الجينات والخلايا المعالجة NTC). وقد برهنت على نفس مستويات ضربة قاضية للأهداف الجينات سواء بين كل من الباحثين في كلا الموقعين.

كتاب هذه المقالة هي من موظفي العلمية الحرارية.

الحرارية العلمية سولاريس qPCR توفير فحوصات بسيطة ، وطريقة محسنة لأداء تحليل qPCR. باستخدام خوارزمية عالية الصرامة ، وإدماج التكنولوجيا وSuperbases MGB ، هذه المجموعات التمهيدي وتحقيق أقصى قدر من الدقة ومتانة التجارب qPCR. واحد وتعيين التحقيق التمهيدي تعترف جميع الصيغ المعروفة للصق الجين المعطى. الموقع المستهدف ، كلما كان ذلك ممكنا ، وتشمل المناطق الممتدة اكسون ، لضمان عدم تضخيم أن الحمض النووي الجيني. هذه الميزات تجعل من الممكن لتشغيل عينات عديدة في وقت واحد ، مما يقلل كثيرا من مقدار الوقت اللازم لإجراء التجارب المعقدة. منذ الرئيسي هو مزيج الأزرق ، فمن الممكن استخدام لوحات غير شفافة بيضاء ، والتي تحسن من الحساسية للqPCR ، دون أن تفقد مسار pipetting. اتخذت جميع معا ، ملامح تصميم الفحص qPCR سولاريس جعل هذا الاختبار qPCR رواية مقايسة بسيطة ، ولكنها عالية الأداء في آن معا محددة وقوية.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام pcr العلمية الحرارية سولاريس qpcr الفحص

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

الجينات qPCR سولاريس الفحص التعبير هو نوع من الرواية التمهيدي / المسبار مجموعة ، وتهدف إلى تبسيط عملية qPCR مع الحفاظ على حساسية ودقة الفحص. وهذه المجموعات التمهيدي / المسبار مصمم مسبقا على 98 ٪&gt; من الجينوم البشري والفأر والتحسينات ميزة كبيرة من التكنولوجيات المتاحة سابقا. وقد جاءت هذه التحسينات الممكنة بحكم رواية خوارزمية التصميم الذي وضعه خبراء المعلوماتية الحيوية الحرارية العلمية. وأدرجت العديد من المزايا المريحة في الفحص qPCR سولاريس لتبسيط عملية تنفيذ الكمية في الوقت الحقيقي PCR. أولا ، بروتوكول مماثل إلى البدائل استخداما ، لذلك فإن الأساليب المستخدمة خلال qPCR من المحتمل أن تكون مألوفة. الثاني ، هو مزيج الرئيسي الأزرق ، الأمر الذي يجعل تحديد ردود الفعل qPCR أسهل لتعقب. الثالثة ، والظروف الدراجات الحرارية هي نفسها بالنسبة للجميع المقايسات (الجينات) ، مما يجعل من الممكن لتشغيل كثير من العينات في وقت واحد والحد من احتمالات الخطأ. أخيرا ، تقدم لجنة التحقيق التمهيدي وتسلسل المعلومات ، وتبسيط عملية النشر. هنا ، ونحن لشرح كيفية الحصول على الكواشف المناسبة سولاريس البحث باستخدام ميزة المنتج GENEius العثور على موقع على شبكة الإنترنت بسهولة (www.thermo.com / سولاريس) وكيفية استخدام الكواشف سولاريس لأداء qPCR باستخدام أسلوب منحنى القياسية.

فحوصات الجينات qPCR التعبير هي رواية سولاريس مصمم مسبقا qPCR التمهيدي / مسبار تركيبات المصممة لتبسيط عملية qPCR دون التضحية خصوصية ومتانة مقايسة.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

يُعد مقايسة Solaris qPCR للتعبير الجيني نوعاً مبتكراً من مجموعات البادئات والمجسات، وقد صُممت لتبسيط عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) مع الحفاظ على الحساسية و...

تُعرض في هذا المقال المرئي تقنية PCR في الوقت الحقيقي باستخدام فحوصات Solaris QPCR. وتعد فحوصات Solaris QPCR عبارة عن مجسات وبادئات متخصصة في الجينات ومصممة للكشف عن جميع متغيرات الربط المعروفة لجين معين. وفي ظل ظروف الدورة الحرارية العامة، يحتوي مسبار Solaris على جزء رابط للأخدود الصغير ومراسل FA عند الطرف 5' ومخمد داكن محجوب عند الطرف 3'.خلال خطوة المسخ في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR)، يظل المسبار في المحلول ويتم إخماد وميض مراسل FAM. وخلال مرحلتي الارتباط والاستطالة، ترتبط البادئات والمسبار بالتسلسل المستهدف، وينفصل المخمِد عن FAM. عندها يعطي FAM إشارة وميضية قوية، وعندما يتفكك المسبار يتم إخماد الوميض مرة أخرى.يتم الحصول على نتائج PCR في الوقت الحقيقي تُظهر حساسية وخصوصية وقابلية تكرار هذا الفحص الفعال. مرحباً، أنا جيمس كوفينو من فريق البحث والتطوير في شركة Thermo Fisher Scientific في لافاييت، كولورادو. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإعداد تفاعل QPCR قياسي باستخدام كواشف Lars QPCR للتعبير الجيني.نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تثبيط الجينات المستهدفة باستخدام تقنيات تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference). لذا، دعونا نبدأ. يتميز تحليل Solaris QPCR assay STEM بخوارزمية فريدة تستخدم تقنيات MGB والقواعد الفائقة (super base) لتوفير تحليل واحد مريح لـ 98% من الجينات المصنفة لدى البشر والفئران.عادةً ما يكون تصميم مسبار الحمض النووي (DNA probe) والبادئ (primer) مقيداً بدرجة حرارة انصهار المسبار، والتي تحددها عدد القواعد ونوعها. وتتميز التسلسلات الأطول والتسلسلات الغنية بـ GC بدرجات حرارة انصهار أعلى. أما جزء الارتباط بالأخدود الصغير المستخدم في مسابير Solaris فيستقر داخل الأخدود الصغير للولب الحمض النووي DNA ويعزز من استقرار التفاعل بين المسبار والتسلسل المستهدف.يؤدي ذلك إلى زيادة درجة حرارة الانصهار، مما يسمح باستخدام مجسات أقصر. كما تدمج خوارزمية Solaris بشكل انتقائي نيوكليوتيدات معدلة تسمى القواعد الفائقة (super bases) لتحسين استقرار روابط AT والقضاء على التجميع الذاتي لـ GG في التسلسلات الغنية بالجوانين. وهذا يسمح باستخدام تسلسلات مستهدفة كان سيتم تجنبها لولا ذلك.تتيح مرونة التسلسل المتزايدة التي توفرها هذه التقنيات تصميم مجموعات من البادئات والمجسات (primer probe sets) التي تتعرف على جميع متغيرات الربط (splice variants) المعروفة لجين واحد. يرجى ملاحظة أنه تم دمج المناطق التي تمتد عبر الوصلات الإكسونية (exon junction spanning regions) في الموقع المستهدف كلما أمكن ذلك لزيادة النوعية من خلال تجنب تضخيم الحمض النووي الجينومي الملوث؛ وقد تم تحليل مجموعات البادئات والمجسات الناتجة باستخدام blast عبر ثلاث قواعد بيانات مختلفة: الجينومية، والنسخية، والجينات الكاذبة لضمان النوعية. علاوة على ذلك، تم تحسين مجموعات بادئات ومجسات Solaris بالكامل بحيث تكون ظروف الدورات لجميع فحوصات QPCR متطابقة، مما يسمح بتقييم تعبير نسخ مختلفة في عمليات PCR واحدة.لبدء التخطيط لتجربة qPCR R، حدد الكواشف اللازمة لإجراء qPCR للجين المستهدف باستخدام ميزة البحث الذكي عن المنتجات المتاحة على thermo.com/solaris. انقر في مربع استعلام البحث واختر الكائن الحي المستهدف المناسب. يمكن لميزة البحث الذكي عن المنتجات معالجة العديد من معرفات الجينات المختلفة هنا.أدخل أحد مصطلحات البحث المقترحة للجين المستهدف، ثم انقر على بحث، وحدد الجين المستهدف وانقر على اختيار في الجانب الأيسر. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة تعرض الكواشف المختلفة المتاحة للجين المستهدف. انقر فوق علامة تبويب الكشف بتقنية QPCR ضمن مقايسة Solaris للتعبير الجيني.يظهر هنا اختبار بادئ مسبار Solaris المصمم بشكل مثالي. سيكشف هذا الاختبار الواحد عن جميع المتغيرات الوصلية المعروفة للجين المستهدف. بمجرد تحديد العامل المناسب للبادئ، ابحث عن جهاز qPCR cycler الذي سيتم استخدامه في القائمة وحدد المزيج الرئيسي المتوافق، سواء كان المزيج الرئيسي مع قارورة صبغة مرجعية خاملة منفصلة من ROX، أو مزيج ROX، أو مزيج ROX المنخفض.سنستخدم هنا جهاز Roche light cycler 480، لذا سيتم استخدام master mix plus rock vial. ومن المهم أيضاً التأكد من تضمين جين مرجعي مناسب في هذه الدراسة، حيث سيتم استخدام B2M بمجرد استلام جميع كواشف Solaris QP CR.يجب تخزينها في درجة حرارة -20 °C حتى وقت الاستخدام. وتظل الكواشف مستقرة لمدة 12 شهراً على الأقل. كما ينبغي تجنب تكرار عملية التجميد والإذابة.قم بتحضير الـ CDNA من أجل الـ QPCR عن طريق إجراء تفاعلات النسخ العكسي على عينات الـ RNA. وبمجرد تحضير الـ CDNA، قم بإذابة مقايسة Solaris والمزيج الرئيسي (master mix) على الثلج. يحتوي المزيج الرئيسي على جميع مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستثناء المقايسة الخاصة بالجين، وتشمل مكونات القالب الثرموستات، والـ DNA polymerase dn، وTPS rocks.إذا كان جهاز QPCR يتطلب استخدام أقراص موازنة ومحلول درئة تفاعل خاص يحتوي على صبغة زرقاء داخلية، فيجب توفير ماء بدرجة نقاء PCR وأطباق QPCR أيضاً. بمجرد إذابة المحاليل، اخلطها عن طريق النقر الخفيف، ثم قم بتدوير المحاليل لفترة وجيزة باستخدام جهاز الطرد المركزي لمنع فقدان الكواشف. بعد ذلك، قم بتحضير مقايسة Solaris QPCR بتركيز 1x والمزيج الرئيسي (master mix) في أنبوب سعة 15 milliliter.من خلال الجمع لعدد العينات المطلوب تشغيلها على لوحة بها 384 بئراً، امزج 5 µL من 2x master mix، و0.5 µL من 20X Solaris assay، وماء بدرجة نقاء PCR بحيث يكون الحجم النهائي في كل بئر 10 µL. بعد إضافة cDNA، تأكد من تحضير كمية كافية لثلاث مكررات لكل عينة، بما في ذلك ضابط خالي من القالب NTC وضابط خالي من إنزيم النسخ العكسي no RT للتحقق من وجود كواشف ملوثة أو DNA جينومي ملوث على التوالي. بعد ذلك، انقل الخليط إلى خزان معقم.بعد ذلك، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل الحجم المناسب من المزيج الرئيسي (master mix) بتركيز 1x إلى الآبار المناسبة في لوح PCR. وفي حالة استخدام الألواح البيضاء، ستساعد الصبغة الزرقاء الداخلية المضافة إلى المزيج الرئيسي في تتبع تقدم عملية السحب والوضع. ويمكن تحليل العديد من مكتبات cDNA والجينات المرجعية في اللوح نفسه، نظرًا لأن جميع ظروف الدورات متطابقة.بمجرد إضافة المزيج الرئيسي (master mix) بتركيز 1x إلى الآبار المناسبة، أضف قالب CD NA المخفف إلى كل بئر بحيث يكون الحجم النهائي 10 µL، مع السحب والضخ بالممصّة للمزج. قم بإغلاق اللوحة إما باستخدام سدادة لاصقة أو سدادة حرارية كما هو موضح هنا.ضع الصفيحة في جهاز طرد مركزي وقم بتدويرها لترسيب الكواشف في قاع الفتحات وإزالة أي فقاعات قد تتداخل مع برنامج قراءات الفلورة. في جهاز التدوير الحراري، يجب تنشيط إنزيم البوليميراز ذو البدء الساخن في المزيج الرئيسي Solaris QPCR عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، لدورة واحدة، ثم 40 دورة من مسخ الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، تليها مرحلة التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. هذا البروتوكول موحد لجميع فحوصات Soliris QPCR، بغض النظر عن الجين الذي يتم تضخيمه.أخيراً، ضع الصفيحة في جهاز QPCR وابدأ البرنامج. يوضح هذا الشكل الأداء العالي لمقايسات Solaris هنا، حيث تم تضخيم 10 تخفيفات بمقدار عشرة أضعاف من DNA الاصطناعي أو CDNA باستخدام مقايسات Solaris QPCR للتعبير الجيني لـ CDC 20 و F two RL one، وتظهر منحنيات التضخيم بمقياس لوغاريتمي والمنحنيات القياسية لـ 10 تخفيفات Log 10 الأداء العالي للمقايسة حتى في تركيزات الإدخال المنخفضة.يتم قياس أداء كل مقايسة من خلال كفاءة قيمة المربع، والنطاق الديناميكي من 10، وتخفيفات log 10، والحد الأدنى للكشف. وتوضح البيانات المعروضة هنا قابلية تكرار مقايسات Solaris. وفي هذه التجربة، تم تضخيم حصص من CD NA في مختبرين متباعدين جغرافياً باستخدام مقايسات Solaris QPCR للتعبير الجيني والمزيج الرئيسي (master mix).تم حساب مستويات التعبير ذاتها لهدفين جينيين في كلا المختبرين. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إعداد تفاعل QPCR قياسي باستخدام كواشف Solaris QPCR للتعبير الجيني. عند إجراء هذه التجربة، من المهم تذكر تحضير المزيج الرئيسي (master mixes) بالتركيز النهائي الصحيح للكواشف، وتضمين مكررات بيولوجية و/أو تقنية مناسبة.بالإضافة إلى ذلك، من الضروري إعداد جهاز QPCR بظروف التدوير الحراري الصحيحة لـ Solaris. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وسوف نظهر الإعداد وتحليل microRNA - 96 - جيدا قبل صفائف QPCR باستخدام الروبوت وكذلك جنب مع ماصة العلمية الحرارية الأقنية ماتريكس.

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

نحن تصف بروتوكول الوقت الحقيقي PCR لملف microRNAs في السائل النخاعي (CSF). باستثناء بروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي، ويمكن تمديد هذا الإجراء إلى الحمض النووي الريبي المستخرج من مخالطة سوائل جسمه الأخرى، الخلايا المستزرعة، أو عينات الأنسجة.

النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

وقد ظهرت الرنا الميكروية المتداولة مؤخرا في المؤشرات الحيوية واعدة وجديدة لمختلف أنواع السرطان وأمراض أخرى. والهدف من هذه المقالة هو لمناقشة ثلاثة في الوقت الحقيقي PCR منصات مختلفة القائم على التحقيق والأساليب المتوفرة لقياس وتحديد وفرة تعميم الرنا الميكروية.

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Provided هو بروتوكول لتطوير مقايسة تضخيم البوليميراز المعاد تجميعها في الوقت الفعلي لتحديد التركيز الأولي لعينات الحمض النووي باستخدام إما جهاز تدوير حراري أو مجهر وسخان مرحلة. كما تم وصف تطوير التحكم الإيجابي الداخلي. يتم توفير البرامج النصية لمعالجة بيانات التألق الأولية في الوقت الفعلي.

تطوير الكمية Recombinase البلمرة التضخيم الفحص مع الرقابة الداخلية إيجابي

يصف هذا البروتوكول مقايسة qRT-PCR عالية الإنتاجية لتحليل توقيعات تعبير IFN من النوع الأول والثالث. يميز الاختبار اختلافات زوج القاعدة المفردة بين النصوص المتشابهة للغاية لهذه الجينات. من خلال تجميع الدفعات وسحب العينات الروبوتية، تكون المقايسات متسقة وقابلة للتكرار.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

يمكن تمييز الكروموسومات  الكروموسومات المصممة لمشروع جينوم الخميرة الاصطناعية ، Sc2.0 ، عن نظيراتها الأصلية باستخدام مقايسة التنميط الجيني المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل تسمى PCRTagging ، والتي لها نقطة نهاية للوجود / الغياب. نصف هنا طريقة الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي عالية الإنتاجية للتنميط الجيني PCRTag.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

هذا الوقت--وفعالة من حيث التكلفة في المختبر بروتوكول تحقق آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، وحاجة طبية العالية التي لم تلب في إدارة السرطان.

ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

الكشف السريع والدقيق لمسببات الأمراض النباتية في الموقع، ولا سيما المنقولة بالتربة مسببات، أمر حاسم لمنع المزيد من الإنتاج العدوى وانتشار الأمراض النباتية في الحقل. طريقة وضعها هنا باستخدام نظام الكشف عن PCR الوقت الحقيقي محمولة يمكن تشخيص الموقعي الظروف الميدانية.

الكشف الجزيئي في الموقع من فيتوباثوجينس المنقولة بالتربة باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي المحمولة

هنا ، يتم تقديم الكمية في الوقت الحقيقي البلمره سلسله البروتوكول القائم علي رد الفعل لتحديد محتوي الحمض الريبي الصغير الأصلي (المطلق/النسبي) من جزيئات البروتين الدهني. الاضافه إلى ذلك ، يتم إثبات طريقه لزيادة مستوي الحمض الريبي الصغير ، فضلا عن طريقه لتحديد معدل امتصاص جزيئات الخلايا الدهنية.

إثراء جزيئات البروتين الدهني الأصلي مع ميكرورنا والتحديد اللاحق لمحتوياتها المطلقة/النسبية ميكرورنا ومعدل نقلها الخلوي

وكميا عينات Microvolume بواسطة نظام يستخدم معمل الطبيعية التوتر السطحي للاحتفاظ عينات من دون استخدام cuvettes أو الشعيرات الدموية. وزيادة كبيرة في مجموعة ديناميكية من تركيزات البروتين والسرعة التي يمكن قياسها مع هذا الأسلوب.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

تعلم تقنية التفاعل المتسلسل البوليميري الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام اختبارات Solaris لتحليل التعبير الجيني. تُظهر هذه الطريقة حساسية وخصوصية عالية في كشف المتغيرات الرناية.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

استكشف المزيد من الفيديوهات