Name: تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: اكتشف تصور نقل الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية باستخدام بيوض Xenopus المحقونة بصبغات فلورية. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة ديناميكيات الحمض النووي الريبي بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويدعم عملنا على توطين RNA عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM071049) لKLM.

الجزء 1 : النسخ من مرنا fluorescently المسمى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصبح خطي DNA البلازميد التي تحتوي على عنصر أو تسلسل الحمض النووي الريبي التعريب الأخرى ذات الصلة وresuspend في 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع DEPC المعاملة O. 2 H يجب أن يكون القالب الحمض النووي لديها مواقع المروج المنبع للنسخ التي T7 ، SP6 ، أو T3 بوليميريز الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الكواشف التالية لأنبوب 1.5mL العقيمة : <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> أ. 10X تكساس العازلة (انظر M &amp; M) </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ب. 20X قبعة / مزيج NTP (انظر M &amp; M) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ج. 1 ملم اليكسا فلور 546-14 - UTP (Invitrogen) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> د. UTP ، [α P - 32] (1 μCi / ميكرولتر) (بيركن إلمر) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ه. DEPC - H 2 O </td><td> 11 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ف. 0.2 M DTT </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ز RNasin (Promega) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ح. الخطي قالب الحمض النووي </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ط رنا بوليميريز (Promega) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف والكواشف الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثانية. في microcentrifuge). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2-4 ساعات في 37 درجة مئوية ، وتغطي الأنبوب برقائق الألومنيوم لمنع photobleaching من fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر 1 ملغ / مل ريبونوكلياز خالية الدناز (Promega) للحط من الحمض النووي القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 79 ميكرولتر 20 ملي EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) لوقف التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ميكرولتر لإزالة أنبوب منفصل ، وصفت بانها "المدخلات" وانقاذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد الفعل من خلال زيادة ونقصان عمود G50 1 مل (انظر المواد والطرق) ، والتي سوف تشمل النيوكليوتيدات الفردية مع استبعاد كامل مرنا طول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز الحمض النووي الريبي قبل هطول الأمطار الايثانول : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، و 10 ميكرولتر 7M COONH CH 3 4 ، 1 ميكرولتر RNA الناقل (الحمض الريبي النووي النقال الخميرة ، و 10 ميكروغرام / ميكرولتر) أو 1 الجليكوجين ميكرولتر (20 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتخلط جيدا حتى تجميد الصلبة في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة&gt; أو على الجليد الجاف لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أقصى سرعة في microcentrifuge لمدة 15 دقيقة ، وطاف صب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع 150 ميكرولتر من الايثانول 75 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 3 دقائق على السرعة القصوى في طاف ، microcentrifuge صب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف بيليه في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، وضمان أن جميع الايثانول قد تبخرت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في 11 ميكرولتر DEPC O 2 - H وإزالة 1 ميكرولتر لأنبوب منفصل ، وصفت بانها "دمج". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد التأسيس في المئة وتخفيف الحمض النووي الريبي إلى 50 نانومتر (انظر المواد وطرق الحساب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي تجميد الحمض النووي الريبي في 5 aliquots ميكرولتر ، لاستخدام مرة واحدة لتجنب تجميد / الذوبان الدورات ويمكن تخزينها لعدة أسابيع في -80 درجة مئوية. </li></ol> الجزء 2 : التحضير لMicroinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA التحضير : أذاب an قسامة من الحمض النووي الريبي (50 نانومتر) ، وتفسد الحمض النووي الريبي في 70 دقيقة لمدة 3-5 درجة مئوية. تدور لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة microcentrifuge بأقصى سرعة ممكنة لإزالة أي الجسيمات ، والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضة التحضير : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المبيض جراحيا من الإناث المورق القيطم (ناسكو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم قطعة من المبيض المورق القيطم في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 25 مل من محلول كولاجيناز (انظر المواد والطرق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف عند 18 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، أو حتى يتم فصل واضح البويضات من المبيض. بسبب دفعي لتباين الدفعي ، قد كولاجيناز وقت المعالجة تختلف ، وينبغي رصدها بعناية من خلال الفحص البصري لضمان defoliculation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتسوية البويضات في أنبوب ، وإزالة حل ويغسل البويضات مع العازلة MBSH (انظر المواد والطرق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مرتين أكثر من أجل ما مجموعه ثلاثة يغسل. هذا البروتوكول العزلة البويضة هي مماثلة لتلك المفصلة في كوهين وآخرون ، 2009. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفرز يدويا في المرحلة الثالثة / البويضات الرابع (دومون ، 1972) في MBSH العازلة تحت المجهر القياسية تشريح. المرحلة الثالثة هي البويضات مبهمة تماما لكنها بيضاء ، في حين أن المرحلة الرابعة البويضات هي أكبر قليلا ، وتتخللها الصباغ. البويضات تكون شفافة قليلا جدا من الشباب والبويضات التي المصطبغة كليا أو توزيع يحمل صبغة الاستقطاب قديمة جدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة التحضير : سحب وشطبة الإبر إلى القطر الخارجي من 0.05 ملم ~. (ونحن نستخدم العلم دروموند 3.5 بوصة الشعيرات الدموية (ترتيب # 3 - 000 - 203 - G / X) ، وهو الصك سوتر micropipette مجتذب شركة وشركة beveller WPI). </li></ol> الجزء 3 : Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة الإبرة مع O 2 DEPC - H 2 لتسليم NL في الحقن. نحن لدينا تحميل الجبهة باستخدام إبرة microinjector الغاز يحركها (انظر المواد والطرق) ، وانخفاض حجم معايرة باستخدام ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل RNA في الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان فرز البويضات في طبق يحتوي على حقن MBSH العازلة. نحن microinject على طبق مع طبقة من المطاط الرغوي السوداء. والبويضات شاحب تبرز بشكل جيد على backgrou الأبيضالثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن البويضة مع كل بعناية NL 2 من الحمض النووي الريبي في 50 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد الجيش الملكي النيبالي ، وشطف مع إبرة DEPC O 2 - H ، وتحميل RNA المقبل للحقن. </li></ol> الجزء 4 : ثقافة سيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضات مكان في بئر من 24 لوحة معقمة جيدا (سيغما الدريتش). نحن ثقافة ما يصل الى ألف البويضات لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة واستبدالها مع 400 ميكرولتر O ocyte C M ulture edium (OCM ، انظر المواد و المناهج) لكل بئر. مكان لوحة الثقافة داخل حاوية بلاستيكية محكمة الغلق مع منشفة ورقية مبللة للحفاظ على بيئة رطبة خلال الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البويضات عند 18 درجة مئوية لمدة تتراوح من النقاط الزمنية ما بين 8 و 48 ساعات. </li></ol> الجزء 5 : التثبيت والجفاف وتخزين البويضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز البويضات أي ميت على قيد الحياة ومكان البويضات في قوارير زجاجية. نلاحظ بشكل روتيني&gt; البقاء على قيد الحياة 90 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضات في مكان مثبت MEMFA (انظر المواد والطرق) والصخور لمدة 20 دقيقة. حماية البويضات من الضوء من خلال تغطية بورق الألمنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البويضات عن طريق إزالة تثبيتي ، والاستعاضة عن حجم مساو من MBSH العازلة. كرر هذا مرة أخرى ليغسل ما مجموعه اثنين من يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البويضات في الميثانول اللامائية : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة نصف الحجم ، مع استبدال الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة "أ" مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع من الحل ، مع استبدال الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل الميثانول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين البويضات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للصورة. </li></ol> الجزء 6 : التصوير RNA التعريب بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير ، إضافة ليالي غرفة متوسطة موراي (2:1 بنزيل بنزوات البنزيل الكحول -) إلى أسفل الزجاج FluoroDish (WPI شركة) لتغطية السطح التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية البويضات من الميثانول إلى FluoroDish ، والتقليل من حجم نقل الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة على المجهر an مبائر المقلوب (ونحن قد استخدمت بنجاح LSM510 زايس وTCS SP2 لايكا). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 :.. يقتصر في البداية تصور التعريب بواسطة الحمض النووي الريبي التحت خلوية Microinjection النصوص صفتها Fluorescently ألف microinjection التالية ، RNA المسمى مع فلور اليكسا 546 إلى النواة باء بعد ثماني ساعات من الثقافة ، ويمكن أن ينظر إلى fluorescently المسمى RNA السيطرة بشكل موحد وزعت في سيتوبلازم البويضة. جيم ومع ذلك ، يمكن أن ينظر إلى RNA fluorescently المسمى تحتوي على تسلسل التي تجند أجهزة النقل في عملية توطين التحت خلوية إلى القطب نباتية من البويضة (نحو الأسفل). مقياس بار = 50 ميكرومتر.

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

وقد أجريت التجارب باستخدام الحيوانات المخبرية وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة براون.

هنا قدمنا ​​مشروع بروتوكول لتصور التعريب مرنا في القيطم البويضات. هذا الأسلوب ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي fluorescently المسمى النصوص وأعلى إشارة إلى نسبة الضوضاء من الحصول مسبقا مع digoxigenin المسمى النصوص وأبسط وأسرع من الوضع الطبيعي في النهج القائمة (موري وميلتون ، 1992 ، Gautreau وآخرون ، 1997). باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا مهندس تسلسل الحمض النووي الريبي واختبار الطفرات بسرعة على وظيفة في الجسم الحي. كذلك ، باستخدام إضافية اليكسا - UTP fluorophores...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X تكساس العازلة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 ملم MgCl 2 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 ملم تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 ملي سبيرمدين - حمض الهيدروكلوريك </li></ul> 20X قبعة / NTP مزيج <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ملي CTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ملي ATP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 ملم UTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 مم GTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 ملي G (PPP) G رسملة تماثلي (نيو إنجلاند Biolabs) </li></ul> G - 50 عمود <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> منزوع الأيونات هيدرات 5 ز Sephadex G - 50 حبات (سيغما الدريتش) في 100 مل من H 2 O. لمدة 30 دقيقة DEPC علاج. والأوتوكلاف. تخزين الأوراق المالية غير مكتملة في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام ، إضافة التالية ريبونوكلياز خالية من الحلول : </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مل 0.2 M EDTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مل 1 تريس M الرقم الهيدروجيني 8.0 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مل SDS 20 ٪ </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن كاملة G - 50 درجة مئوية في حل 4 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتجاهل المكبس من المحاقن مل 3 دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، ومكان للبرميل من الحقنة في أنبوب 15 مل المخروطية (كورنينج). سد المحاقن مع كمية صغيرة من الصوف الزجاجي (قابس حول حجم نصف بنس واحد). </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة كاملة G - 50 حل لresuspend الخرز. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل G - 50 حل للعمود فارغ. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 1 دقيقة في ز س 1000 جهاز طرد مركزي في الفوق. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 DEPC المعاملة منزوع الأيونات ميكرولتر H 2 O إلى كل عمود. زيادة ونقصان. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مرتين أكثر من أجل ما مجموعه ثلاثة يغسل. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة لإزالة برميل أنبوب جديد 15 مل المخروطية. </li></ul> كولاجيناز الحل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 75 ملغ من نسج كلوستريديوم كولاجيناز (سيغما الدريتش) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 مل 0.1 م 3 + KPO (الرقم الهيدروجيني 7.4) </li></ul> MBSH العازلة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 88 مم كلوريد الصوديوم </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملم بوكل </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.4 ملي NaHCO 3 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.82 ملي MgSO 4 X 7H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 ملي كا (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.41 ملي CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 HEPES ملم (7.6 درجة الحموضة) </li></ul> البويضة مستنبت <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ٪ L15 المتوسطة </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 HEPES ملم (7.6 درجة الحموضة) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملغ / مل الأنسولين </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 ملغ / مل جنتاميسين </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / مل النيستاتين </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / مل البنسلين </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ملغ / مل الستربتوميسين </li></ul> MEMFA الحل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 اجتماعات الأطراف M (الرقم الهيدروجيني 7.4) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 مم EGTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملم MgSO 4 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.7 ٪ الفورمالدهيد </li></ul> الحوسبة RNA العائد <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> الاجتماع التحضيري للمؤتمر في تحديد &quot;الإدخال&quot; و &quot;دمج&quot; العينات باستخدام عداد التلألؤ القياسية. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> التأسيس = (&quot;دمج&quot;) / (10 س &quot;الإدخال&quot;) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> إدماج القيم النموذجية تتراوح ما بين 0.03 و 0.10 ~. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> نظرية الحد الأقصى للغلة polymerases مختلفة : T7 ، T3 ، SP6 -- 2.64 ميكروغرام </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> رد الفعل في ميكروغرام العائد = (الغلة القصوى من بوليميريز المستخدمة) X (التأسيس) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع RNA إلى 50 نانومتر = (RNA ميكروغرام) / 320 / (طول الحمض النووي الريبي في قواعد) / (5X10 -8) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> رد الفعل عادة غلات ~ 5-10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي في 50 نانومتر. </li></ul>

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA الترجمة هي آلية الحفظ إنشاء خلية قطبية. Vg1 مرنا يموضع إلى القطب نباتية من البويضات القيطم المورق ويعمل على تقييد مكانيا التعبير الجيني للVg1 البروتين. مطلوب رقابة مشددة من Vg1 التوزيع بهذه الطريقة المناسبة لمواصفات طبقة الجرثومية في الجنين النامية. تسلسل الحمض النووي الريبي العناصر في UTR 3 &#39;من مرنا ، وتوطين عنصر Vg1 (VLE) هي المطلوبة والكافية لنقل المباشر. لدراسة الاعتراف ونقل Vg1 مرنا في الجسم الحي ، قمنا بتطوير تقنية التصوير التي تسمح للتحليل واسعة من العوامل عبر آليات النقل الموجهة عبر قراءات بصرية بسيطة. الحمض النووي الريبي لتصور التعريب ، ونحن توليف fluorescently المسمى VLE RNA وهذا نص في microinject البويضات الفردية. ثقافة البويضة بعد للسماح بنقل الحمض النووي الريبي حقن ، البويضات يتم إصلاحها والمجففة قبل التصوير بواسطة المجهر مبائر. تصور أنماط توطين مرنا يتيح قراءة لرصد المسار الكامل لنقل الحمض النووي الريبي وتحديد الأدوار في توجيه نقل الحمض النووي الريبي لرابطة الدول المستقلة المفعول عناصر داخل النص ، والعوامل التي تعمل عبر ربط VLE (لويس وآخرون ، 2008 ، Messitt وآخرون ، 2008). لقد قدمنا ​​من خلال هذه التقنية بالتعاون مع التعريب الرناوات إضافية والبروتينات (غانيون وموري ، 2009 ، Messitt وآخرون ، 2008) ، وبالاشتراك مع تعطل المحرك والهيكل الخلوي البروتينات و(Messitt وآخرون ، 2008) إلى التحقيق الآليات الكامنة وراء توطين مرنا.

تصور<em&gt; في الجسم الحي</emويتم إنجاز&gt; RNA النقل microinjection النصوص الحمض النووي الريبي في fluorescently المسمى<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات ، تليها المجهري متحد البؤر.

يعد تموضع الحمض الريبي النووي (RNA localization) آلية محفوظة لإنشاء القطبية الخلوية. يتموضع الحمض الريبي النووي المرسال (mRNA) الخاص بـ Vg1 في القطب الخضري لبويضات Xenopus laevis، ويعمل على...

في هذا الإجراء، يتم حقن نسخ من RNA المسمى بفلوروفورات في بويضات Xenopus laevis ومراقبة تموضعها. أولاً، يتم وسم RNA بنيوكليوتيدات فلورية.في تفاعل نسخ في المختبر، يتم بعد ذلك تحميل الـ RNA في جهاز حقن مجهري. توضع البويضات في طبق حقن ويتم حقنها مجهرياً بعناية. وأخيراً، يتم استزراع البويضات للسماح بحدوث تموضع الـ RNA قبل التصوير باستخدام المجهر البؤري.مرحباً، أنا جيمس غانيان من مختبر الدكتورة كيمبرلي مالوري في قسم البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية في جامعة براون. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصوير التموضع تحت الخلوي لـ RNA في بويضات *Xenopus*. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة بنية RNA وعوامل البروتين المطلوبة لتموضع RNA خلال المراحل المبكرة من تطور الفقاريات.فلنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بنسخ mRNA، بحيث يكون مُعلمًا إشعاعيًا وفلوروسنتياً كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. أضف DNase لتحليل DNA القالب، ثم أوقف التفاعل بإضافة EDTA.قم بإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة والجزيئات الصغيرة الأخرى عن طريق الطرد المركزي عبر عمود G 50. بعد ذلك، يتم تركيز الـ RNA عن طريق الترسيب بالإيثانول، ثم غسله وإعادة تعليقه. بعد تحديد التركيز بواسطة العد الومضي، خفف الـ RNA إلى 50 nano molar وخزنه في حصص مقدار كل منها 5 µL عند درجة حرارة -80 °C.عند الاستعداد لإجراء الحقن المجهري، يتم إذابة كمية من الـ RNA الموُسم وتسخينها لفك الارتباط عند 70 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي دقيق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الجسيمات، ثم تُحفظ على الثلج. بعد ذلك، يتم عزل الخلايا عن طريق تقطيع أجزاء من مبيض *Xenopus laevis* في أنبوب مخروطي سعة 50 mL يحتوي على 25 mL من محلول بتركيز 3 mg/mL.كولاجيناز (Collagenase) في محلول فوسفات البوتاسيوم المنظم بتركيز 0.1 مولار عند pH 7.4. يُرج بلطف عند 18 درجة مئوية نظرًا للاختلافات بين الدفعات. قد تختلف مدة المعالجة بالكولاجيناز ويجب مراقبتها بعناية من خلال الفحص البصري.لضمان إزالة الأغشية المحيطة، استمر في الرج لمدة 15 دقيقة أو حتى تنفصل البويضات بشكل مرئي عن المبيض، ثم اترك البويضات تترسب في قاع الأنبوب المخروطي. تخلص من المحلول واستبدله بمحلول MBSH المنظم. كرر هذه الخطوة، واغسل مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات.بعد ذلك، قم بفرز الخلايا الجرثومية (CYTES) في المرحلتين الثالثة والرابعة يدويًا في محلول MBSH المنظم باستخدام مجهر ضوئي قياسي. تكون الخلايا في المرحلة الثالثة معتمة تمامًا ولكنها بيضاء، بينما تكون الخلايا في المرحلة الرابعة أكبر قليلاً ومنقطة بالصبغة.تكون الخلايا التي تتسم بشفافية طفيفة صغيرة جداً في السن، بينما تكون الخلايا ذات التصبغ الكامل أو التي تظهر توزيعاً مستقطباً للصبغة مسنة جداً. وأخيراً، قم بتجهيز الإبر المستخدمة في الحقن المجهري باستخدام شعيرات شعرية بطول ثلاثة ونصف بوصة، مع السحب والصقل لصنع إبر بقطر خارجي يبلغ 0.05 millimeters تقريباً. والآن بعد أن أصبحت الخلايا البيضية وmRNA والإبر جاهزة، انتقل إلى عملية الحقن المجهري.ابدأ بمعايرة الإبرة باستخدام ماء منزوع الأيونات لضخ 2 nanometers في كل عملية حقن. قم بتعبئة الإبرة باستخدام حقن مجهري يتم التحكم فيه بالغاز، وعاير حجم القطرة باستخدام الميكرومتر؛ وبعد المعايرة، قم بتعبئة الـ RNA المراد حقنه في الإبرة. بعد ذلك، ضع البويضات المفروزة في طبق حقن يحتوي على محلول MBSH المنظم، مع العلم أن الطبق يحتوي على طبقة من المطاط الرغوي الأسود.تظهر البويضات البيضاء بوضوح مقابل خلفية سوداء. بعد ذلك، قم بحقن كل بويضة بعناية بـ 2 µL من الـ RNA بتركيز 50 nM. تأكد من حقن كل بويضة مرة واحدة فقط، وافحص الإبرة بانتظام للتأكد من عدم انسدادها عند اكتمال عملية الحقن.تخلص من الحمض النووي الريبي (RNA) المتبقي، واشطف الإبرة بماء منزوع الأيونات ثم قم بتحميل الـ RNA التالي للحقن. بعد الحقن، انقل الخلايا المحقونة إلى بئر في طبق معقم يحتوي على 24 بئراً، حيث يمكن زراعة ما يصل إلى ألف خلية في البئر الواحد.قم بإزالة المحلول المنظم واستبداله بـ 400 µL من وسط زراعة الخلايا (cyte culture medium) لكل بئر. بعد ذلك، ضع طبق الزراعة داخل حاوية بلاستيكية تحتوي على منشفة ورقية مبللة للحفاظ على بيئة رطبة أثناء الزراعة، واحضن البويضات عند 18 °C لفترات زمنية تتراوح بين 8 و48 ساعة بعد فترة الحضن المطلوبة. يمكن تجهيز البويضات للفحص المجهري بعد حضن البويضات المحقونة.استبعد أي بويضات ميتة وضع البويضات الناجية في قوارير زجاجية. ويُلاحظ روتينيًا بقاء أكثر من 90% من البويضات على قيد الحياة. استبدل المحلول المنظم بمثبت M-E-M-F-A وقم بهز الخلايا لمدة 20 دقيقة.احمِ البويضات من ضوء الشمس أثناء عملية التثبيت بعد اكتمال فترة التثبيت. اغسل البويضات عن طريق إزالة المثبت واستبداله بحجم مساوٍ من محلول MBSH المنظم. كرر عملية الغسل هذه مرة أخرى ليصبح المجموع غسلتين.بعد ذلك، اغسل البويضات في ميثانول لامائي. أولاً، قم بإزالة نصف الحجم واستبدله بالميثانول. كرر هذه العملية مرتين إضافيتين.بعد عمليات الغسل هذه، قم بإزالة المحلول بالكامل واستبدله بالميثانول. كرر عملية الغسل بالميثانول هذه مرة أخرى. يمكن تخزين البويضات المثبتة والمجففة عند درجة حرارة -20 °C حتى يحين وقت التصوير.قبل التصوير، أضف وسط ماري للتصفية (Marie's clearing medium) إلى طبق WPI fluoro ذو قاعدة زجاجية لتغطية سطح التصوير. انقل البويضات بعناية من الميثانول إلى طبق fluoro، مع تقليل حجم الميثانول المنقول إلى أدنى حد، ثم قم بتصوير البويضات باستخدام مجهر كونفوكالي مقلوب؛ حيث يعطي كل من Zeiss LSM 510 و aica TCS SP نتائج جيدة. سنعرض الآن بعض الصور التمثيلية لتمركز الحمض الريبوزي النووي (RNA) تحت الخلوي مباشرة بعد الحقن المجهري؛ حيث يمكن رؤية الـ RNA الفلوري في النواة بعد ثماني ساعات من زراعة العينة الضابطة الموُسمة فلورياً.يمكن رؤية الـ RNA موزَّعاً بشكل منتظم في سيتوبلازم البويضة. ومع ذلك، يمكن رؤية الـ RNA المسمى بفلوروكروفور، والذي يحتوي على تسلسلات تستقطب آلية النقل، وهو في عملية التموضع تحت الخلوي باتجاه القطب الخضري للبويضة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية الحقن المجهري لـ RNAs مسمى بفلوروكروفور في البويضات ومراقبة تموضع الـ RNA بواسطة المجهر البؤري.عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام محلول معالج بـ DEPC لتجنب تلوث الرنا (RNAs) في المزرعة، وزراعة الخلايا البيضية في وسط OCM يحتوي على مضادات حيوية، وحماية الخلايا البيضية من ضوء الشمس قدر الإمكان لتجنب التبييض الضوئي. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

visualizing-rna-localization-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هنا علينا أن نظهر للحشوية...

Microinjection من البويضات المورق القيطم

أصبح القيطم الجنينية الأديم الظاهر نموذجا جذابا للدراسات القطبية الخلية. وصفت والفحص ، التي يتم فيها توزيع التحت خلوية المقررة من البروتينات الفلورية في خلايا الأديم الظاهر. وسوف يساعد هذا البروتوكول تعالج المسائل المتعلقة بمكافحة المكاني للإشارات.

الاستقطاب إزفاء من البروتينات في نيون القيطم الأدمة في الاستجابة لاشارة Wnt

إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

بروتوكول للتصوير حي للبروتينات GFP الموسومة أو هياكل autofluorescent في...

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

إنتاج<em&gt; القيطم مداري</em&gt; البيض مقتطفات من التعرف على الرنا أنيبيب المرتبطة بها

هنا، نقدم بروتوكول للتصور، والكشف، وتحليل وتتبع الاتجار بالحمض النووي الريبي في غرفة البيض الحية Drosophila melanogaster باستخدام منارات الجزيئية، وقرص الغزل المجهرية البؤرية، وتحليل مفتوح المصدر البرمجيات.

تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض

لعد تكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، صف واحد جزيء الحمض النووي الريبي في الموقع الأمثل التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) للخلايا غير ملتصقة. بويضات جمعت وتهجين مع تحقيقات محددة نسخة، وكمياً باستخدام برنامج تقدير حجم صورة.

استخدام "واحد جزيء فلوري في الموقع التهجين" (SM-الأسماك) إلى مرناس Quantify و Localize في "بويضات مورين"

يهدف هذا البروتوكول إلى توضيح كيفية حقن خليط الحمض النووي/DOTAP بالميكروين في عيون الأجنة القديمة من Xenopus laevis في يوم من الأيام، وكيفية تصوير وإعادة بناء البروتين الفلورسنت الأخضر الفردي (GFP) الذي يعبر عن الأربور اللافسونية البصرية في العقول المتوسطة التكتال سليمة ، والذين يعيشون Xenopus الضفادع.

الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles

وصفنا طريقة لإعداد والتصوير الحي للمقتطفات السيتوبلازمية غير المخففة من بيض Xenopus laevis .

زينوبوس لايفيس تحضير مستخلص البيض وطرق التصوير الحية لتصور التنظيم السيتوبلازمي الديناميكي

يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق التأثير المادي للهيكل الخلوي على الشكل النووي والعضيات الداخلية الخالية من الغشاء في نظام بويضات الفأر. يمكن تكييف الإطار للاستخدام في أنواع الخلايا والسياقات الأخرى.

التقاط التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة بويضة الفأر عبر المقاييس المكانية

نحن نصف طرقا لتصور النسخ الناشئ أثناء تنشيط الجينوم الزوجوي في الخلايا الفردية خلال التطور الجنيني المبكر.

تصور تنشيط الجينوم الزيجوي في الخلايا المفردة للأجنة المبكرة

اكتشف تصور نقل الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية باستخدام بيوض Xenopus المحقونة بصبغات فلورية. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة ديناميكيات الحمض النووي الريبي بدقة عالية.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

استكشف المزيد من الفيديوهات