تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

في هذا الإجراء ، الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت. يتم حقن النصوص في XUS Cytes ومراقبة توطينها. أولا ، يتم تصنيف الحمض النووي الريبي بالنيوكليوتيدات الفلورية.

في تفاعل النسخ في المختبر ، يتم بعد ذلك تحميل الحمض النووي الريبي في جهاز الحقن المجهري. توضع البويضات على طبق الحقن ويتم حقنها بعناية. أخيرا ، يتم زراعة البويضات للسماح بتوطين الحمض النووي الريبي قبل التصوير على المجهر متحد البؤر.

مرحبا ، أنا جيمس غانان من مختبر الدكتورة كيمبرلي مالوري في قسم البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية في جامعة براون. سنعرض لك اليوم إجراء لتصور توطين الحمض النووي الريبي تحت الخلوي في بويضات Xap. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة بنية الحمض النووي الريبي وعوامل البروتين المطلوبة لتوطين الحمض النووي الريبي أثناء التطور المبكر للفقاريات.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، قم بنسخ mRNA ، والذي تم تصنيفه إشعاعيا وفلوريا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب. أضف DS لتحلل الحمض النووي للقالب ، ثم أوقف التفاعل عن طريق إضافة EDTA.

قم بإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة والجزيئات الصغيرة الأخرى عن طريق الدوران عبر عمود G 50. ثم يتركز الحمض النووي الريبي عن طريق ترسيب الإيثانول ، ويتم غسله وإعادة تعليقه. بعد تحديد التركيز عن طريق عد التلألؤ ، قم بتخفيف الحمض النووي الريبي إلى 50 نانو مولار وتخزينه في خمسة ميكرولتر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

عندما تكون جاهزا لإجراء الحقن المجهري ، قم بإذابة Eloqua من الحمض النووي الريبي المسمى بتغيير طبيعة عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم قم بالدوران لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي صغير في درجة حرارة الغرفة لإزالة الجسيمات والحفاظ على الجليد. بعد ذلك ، قم بعزل قطع xap post lavu إلى مخروطية الشكل سعة 50 ملليلتر تحتوي على 25 مل من ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر.

الكولاجيناز في مخزن مؤقت لفوسفات البوتاسيوم 0.1 مولار عند درجة الحموضة 7.4. رج العبوة برفق عند 18 درجة مئوية بسبب اختلاف الدفعة إلى الدفعة. قد يختلف وقت علاج الكولاجيناز ويجب مراقبته بعناية من خلال الفحص البصري.

لضمان تساقط الأوراق ، استمر في الاهتزاز لمدة 15 دقيقة أو حتى تنفصل البويضات بشكل واضح عن المبيض ، اترك البويضات تستقر في قاع الأنبوب المخروطي. قم بإزالة المحلول واستبدله بمخزن MBSH. كرر هذا ، اغسل مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات.

بعد ذلك ، قم بفرز المرحلة الثالثة إلى الرابعة CYTES و MBSH يدويا تحت مجهر ضوئي قياسي. الخلايا في المرحلة الثالثة معتمة تماما ، لكنها بيضاء. في حين أن المرحلة الرابعة ، تكون الخلايا أكبر قليلا ومرقطة بالصباغ.

الصيول الشفافة قليلا صغيرة جدا والخلايا المصطبغة بالكامل أو التي تظهر توزيعا للصبغة المستقطبة قديمة جدا. أخيرا ، قم بإعداد الإبر للحقن المجهري باستخدام الشعيرات الدموية بطول ثلاثة بوصات ونصف السحب والشطف لصنع إبر بقطر خارجي يبلغ حوالي 0.05 ملم. الآن بعد أن أصبحت بويضات وإبر mRNA جاهزة ، انتقل إلى الحقن المجهري.

ابدأ بمعايرة الإبرة بماء ديزي لتوصيل نانومترين لكل حقن حقن. أمام. قم بتحميل الإبرة باستخدام حاقن صغير يتم التحكم فيه بالغاز ومعايرة حجم القطرة باستخدام ميكرومتر بعد المعايرة ، قم بالتحميل الأمامي للحمض النووي الريبي المراد حقنه في الإبرة. بعد ذلك ، ضع البويضات المصنفة على طبق الحقن في MBSH buffer ، يحتوي الطبق على طبقة من المطاط الرغوي الأسود.

تبرز السترية البيضاء بشكل جيد على خلفية سوداء. ثم قم بحقن كل بويضة بعناية ب لترين من الحمض النووي الريبي عند 50 نانو مولار. تأكد من حقن كل بويضة مرة واحدة فقط وفحص الإبرة بانتظام بحثا عن الانسداد عند اكتمال الحقن.

طرد الحمض النووي الريبي المتبقي ، واشطف الإبرة بماء ديسي وقم بتحميل الحمض النووي الريبي التالي للحقن. بعد الحقن ، انقل الخلايا المحقونة إلى بئر معقمة 24 صفيحة بئر تصل إلى ألف. يمكن استزراع CYTES لكل بئر.

قم بإزالة المخزن المؤقت واستبدله ب 400 ميكرولتر من وسط ثقافة الخلايا لكل بئر. ثم ضع صفيحة الثقافة داخل وعاء بلاستيكي بمنشفة ورقية مبللة للحفاظ على بيئة رطبة أثناء الاستزراع ، واحتضان البويضات عند 18 درجة مئوية لنقاط زمنية تتراوح بين ثماني و 48 ساعة بعد فترة الحضانة المطلوبة. يمكن تحضير البويضات للفحص المجهري بعد حضانة البويضات المحقونة.

قم بفرز أي بويضات ميتة وضع البويضات الباقية في قوارير زجاجية. ويلاحظ بشكل روتيني بقاء أكبر من 90٪ من البويضات. استبدل المخزن المؤقت بمثبت M-E-M-F-A وهز الصخورات لمدة 20 دقيقة.

حماية البويضات من أشعة الشمس أثناء التثبيت بعد اكتمال فترة التثبيت. اغسل البويضات عن طريق إزالة المثبت واستبداله بحجم متساو من المخزن المؤقت MBSH. كرر هذا الغسيل مرة أخرى لمدة غسلتين.

بعد ذلك ، اغسل البويضات في الميثانول اللامائي أولا ، قم بإزالة نصف الحجم واستبدله بالميثانول. كرر هذا مرتين أخريين.

بعد هذه الغسلات ، قم بإزالة كل المحلول واستبدله بالميثانول. كرر غسل الميثانول هذا مرة أخرى. يمكن تخزين البويضات الثابتة والمجففة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتصوير.

قبل التصوير ، أضف وسيط إزالة ماري إلى طبق فلورو WPI ذو قاع زجاجي لتغطية سطح التصوير. انقل البويضات بعناية من الميثانول إلى طبق الفلورو ، مما يقلل من حجم صورة الميثانول المنقولة للبويضات على مجهر متحد البؤر المقلوب ، ويعطي كل من Zeiss LSM five 10 و aica TCSs P نتائج جيدة. سنعرض الآن بعض الصور التمثيلية لتوطين الحمض النووي الريبي تحت الخلوي مباشرة بعد الحقن المجهري يمكن رؤية الحمض النووي الريبي الفلوري في النواة بعد ثماني ساعات من زراعة التحكم المسمى بالفلورسنت.

يمكن رؤية الحمض النووي الريبي موزعا بشكل موحد في سيتوبلازم البويضة. ومع ذلك ، يمكن رؤية الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت الذي يحتوي على تسلسلات تجند آلية النقل في عملية التوطين تحت الخلوي إلى القطب النباتي للبويضة. لقد أوضحنا لك للتو كيفية الحقن الدقيق للحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت في الخلايا الانطلاق ومراقبة توطين الحمض النووي الريبي عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم استخدام المحاليل المعالجة بدسمة لتجنب تلوث الحمض النووي الريبي للثقافة ، والخلايا الموجودة في OCM التي تحتوي على مضادات حيوية ، ولحماية الخلايا من أشعة الشمس كلما أمكن ذلك لتجنب تبييض الصور. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.