الحصول على Hemocytes من الحبار قصير الذيل هاواي Euprymna scolopes مراقبة وتمسكهم البكتيريا التكافلية وغير التكافلية ،

بعد إخراج الحبارات ذات الذيل القصير البالغة من أحواضها وتخديرها بمحلول مياه بحر مفلترة تحتوي على 2% ethanol، يتم سحب الدم من الوعاء الدموي الرأسي. وباستخدام سرنجة عيار 26.5، يظهر الدم اللمفاوي المستخلص باللون الأزرق.

نظراً لوجود الهيموسيانين، يتم تخفيف الخلايا الدموية (he cytes) إلى التركيز المطلوب وتوزيعها في شرائح غطاء مكونة من ثماني حجرات. وبمجرد التصاق الخلايا الدموية بشريحة الغطاء، يتم صبغها بصبغة Cell Tracker Orange، وهي صبغة فلورية، ثم تعريضها لبكتيريا موسومة ببروتين GFP، والتي يمكن رؤيتها باستخدام المجهر الفلوري. مرحباً، أنا سبنسر أولم من قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية في جامعة كونيتيكت.

وأنا أندرو كولينز من مختبر نيويورك المنزلي. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستخلاص اللمف الدموي أو الدم من الحبار البوبتايل الهاوائي. يتم تحضير هذا الجهاز.

تُعد الحبارات قصيرة الذيل حيوانات ليلية توجد قبالة سواحل هاواي بالقرب من الشعاب المرجانية، وهي تستخدم الضوء الذي تنتجه البكتيريا المتعايشة معها للتمويه ليلاً أثناء خروجها للصيد بحثاً عن غذائها المفضل وهو الروبيان. ونحن نستخدم هذا الارتباط في المختبر لدراسة كيفية استعمار البكتيريا النافعة للأنسجة الحيوانية. كما نطبق هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعلات بين مكونات الجهاز المناعي الفطري للمضيف وشريكه البكتيري المضيء حيوياً VIO ide.

لنبدأ الآن. قبل استخلاص Hemolymph، قم بتخدير حبار بالغ واحد في دورق سعة لتر واحد يحتوي على محلول تم تحضيره حديثاً من 2% ethanol في 500 milliliters من مياه البحر الاصطناعية المعقمة بالترشيح. بعد 10 دقائق، سيتوقف الحبار عن السباحة ولن يستجيب بنشاط للمس.

ومع ذلك، يجب أن تظل عملية التنفس مستمرة، كما يتضح من حركة العباءة ونشاط الخلايا الصبغية الذي يشير إلى فعالية هذه الخلايا. صب بعضاً من محلول مياه البحر المعقمة مع الإيثانول من الكأس في صينية تشريح شمعية قياسية، ثم اغمر الحبار في الصينية بحيث يكون الجانب البطني للأعلى. باستخدام طرف ماصة قياسي سعة 200 microliter، اسحب القمع والعباءة للخلف للكشف عن الوعاء الدموي الرأسي الرئيسي الموجود بين العينين.

استخدم حقنة معقمة مع إبرة قياس 26.5 gauge لثقب الوعاء الدموي الرأسي وسحب ما بين 50 إلى 100 µL من الدم اللمفاوي (hemolymph) أو من 10 إلى 20 µL. إذا كان الحيوان سيُستخدم كمتبرع لعدة مرات، فضع الدم اللمفاوي في أنبوب معقم سعة 1.5 mL فوق الثلج. لاحظ أنه إذا تم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح، يجب أن يظهر دم الحبار باللون الأزرق الداكن.

ضع الحيوان في خزان مياه بحر طبيعية لإنعاشه، ثم قم بمركزة الدم اللمفاوي في جهاز طرد مركزي دقيق في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا الدموية وسحب السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا الدموية في 500 µL من محلول رينجر الخاص بالحبار للغسيل. ثم قم بالمركزة مرة أخرى لترسيب الخلايا وإزالة السائل الطافي.

أخيرًا، أعد تعليق الخلايا الدموية في محلول رينجر للحبار. حدد تركيز الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). بعد ذلك، أضف ما يقرب من 2000 خلية إلى كل حجرة من حجرات شريحة غطاء زجاجية.

اترك الخلايا لتلتصق بالزجاج لمدة 10 دقائق تقريبًا. عند هذه الكثافة، يجب أن تشكل خلايا الـ hemos طبقة أحادية منتظمة على سطح الزجاج. احتفظ بخلايا الـ hemos على الثلج أثناء تحضير البكتيريا في هزاز مداري عند درجة حرارة 28 °C.

قم بتنمية سلالة واحدة أو أكثر من بكتيريا Vireo التي تحتوي على جين مراسل فلوري أخضر حتى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط في وسط مياه البحر مع التريتون. وباستخدام مقياس الطيف الضوئي، قم بقياس الكثافة الضوئية للمستنبت عند 600 نانومتر لتحديد كثافة الخلايا، ثم قم بترسيب البكتيريا في جهاز الطرد المركزي، وتخلص من السائل العلوي وأعد تعليق الراسب. في واحد ملليلتر من محلول رينجر للحبار، أضف البكتيريا إلى الخلايا الدموية.

في الشرائح الزجاجية ذات الغرف التي تحتوي على 100, 000 بكتيريا لكل غرفة، تُحضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ولتحقيق أقصى قدر من الارتباط، يُضاف cell tracker orange بتركيز نهائي قدره 0.005% لصبغ السيتوبلازم.

يتم التحضين لمدة 30 دقيقة، ثم تُغسل الخلايا باستخدام 150 µL من محلول رينجر الطازج الخاص بالحبار. وباستخدام المجهر البؤري (confocal microscope)، يتم فحص الخلايا الدموية (hemocytes) المصبوغة والبكتيريا المرتبطة بها، ثم تُعد البكتيريا الموجودة على كامل سطح الخلية الدموية. سنعرض لكم الآن بعض الصور التمثيلية للخلايا الدموية التي تعرضت لبكتيريا غير تكافلية موسومة بـ GFP وهي *Vibrio harveyi*، والبكتيريا التكافلية الطبيعية للحبار *Vibrio fischeri*.

إليك صورة لموقع دموي لم يتم تعريضه لأي بكتيريا. تظهر الخلية باللون الأحمر وقد أصبحت نشطة، لذا يمكنك رؤية تمدداتها الشبيهة بالأقدام الكاذبة.

عندما تتعرض الخلية للبكتيريا التكافلية filio fii، يلاحظ ارتباط عدد قليل من البكتيريا بسطح الخلية. ومع ذلك، عند تعريض البكتيريا غير التكافلية filio Harvey Harveyi إلى الخلايا الدموية (hemos)، يرتبط عدد أكبر بكثير من البكتيريا. لقد شرحنا لكم للتو كيفية استخلاص الليمف الدموي (hemo lymphs) من الحبار ذو الذيل القصير، وعزل الخلايا الدموية (hemos) واستخدامها في تجارب لتوصيف الالتصاق البكتيري بهذه الخلايا الخاصة بالحبار.

يمكن تعديل هذا البروتوكول ليتناسب مع الكيمياء النسيجية المناعية عن طريق تثبيت الخلايا الدموية بعد التصاقها بسطح غطاء الشريحة. كما يمكن استخلاص R-N-A-D-N-A والبروتينات بمجرد الحصول على الخلايا الدموية من الحيوان. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.