May 3rd, 2010
ويمكن استخدام أجهزة ميكروفلويديك لتصور العمليات الطبيعية المعقدة في الوقت الحقيقي ، وعلى المستويات المادية المناسبة. قمنا بتطوير جهاز بسيط ميكروفلويديك الذي يحاكي السمات الرئيسية من وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها لدراسة النمو الطبيعي ونقل البكتيريا الموجودة في باطن الأرض.
نوضح أنه من خلال استخدام أجهزة الرقائق البيئية ، يمكن الحفاظ على الهياكل المادية ورؤوس الضغط ثابتة أو متنوعة. بينما يتم التحقيق في تأثير خصائص السوائل الكيمياء السطحية أو خصائص الجسيمات أو الميكروبات بشكل منهجي من خلال تجارب النقل باستخدام بروتين فلورسنت أخضر غير ممرض يعبر عن سلالة بكتيرية VIO ، فإننا نوضح أهمية بنية الموائل وظروف التدفق وحجم اللقاح على ظواهر النقل الأساسية. برنامج Microfluidic منظر مقنع لعالم مخفي.
مرحبا ، علامة ديميتري الخاصة بنا من معهد فاندربيلت لتعليم استعادة النظام الحيوي التكاملي في جامعة فاندربيلت. وأنا ديفيد شيفر، مهندس بحث وتطوير هنا في مختبرات فيرو. مرحبا ، أنا ليزلي شو من قسم المواد الكيميائية والهندسة الجزيئية الحيوية في مركز العلوم والهندسة البيئية بجامعة كونيتيكت ، وأضفت ديكوت أيضا من الحمار الوحشي.
سنعرض لك اليوم إجراء لإنشاء مصفوفات موائل ميكروسويدية معيارية للعلوم البيئية الأساسية والبحوث الهندسية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للتحقيق في تأثيرات هياكل مقياس الميكرومتر على تفاعلات النقل الميكروبي في وسائط الغابات. لذلك دعونا نبدأ.
تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء جهاز ميكروفلويديك في رسم تخطيط ثنائي الأبعاد للجهاز في رسم بمساعدة الكمبيوتر أو برنامج CAD. لقد استخدمنا AutoCAD ، ولكن تتوفر أيضا برامج رسم أخرى ، مثل الدليل أو الرسم المرجاني. يمكن البرنامج المصمم من تكرار الهياكل المادية بأمانة في جميع أنحاء المجال العياني ، بينما يتم تحديد الميزات الفردية بدقة أقل من خمسة ميكرون.
من رسم CAD ، يتم إنشاء قناع فوتوغرافي. نحن نستخدم قناع الكروم الذي تصنعه شركة Advanced Reproductions Corporation ، الطرف الشمالي من ماساتشوستس. تتم الخطوات العديدة التالية لإنتاج أجهزة الموائع الدقيقة في غرفة نظيفة لإنشاء سيد.
رقاقة السيليكون النظيفة مطلية بمقاومة للضوء في مبرمج دوراني. أولا ، يتم توصيل الرقاقة بمنصة مبرمج الدوران ويتم سكب بضعة جرامات من مقاومة الضوء SU 8 20 25 على مركز الرقاقة. ثم يتم تدوير الرقاقة لدورة انتشار أولية مدتها 15 ثانية عند 500 دورة في الدقيقة ، تليها دورة طلاء رقيقة 4 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 35 ثانية.
بعد الغزل ، توضع الرقاقة على طبق ساخن لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية لتطاير المذيبات الزائدة. الخطوة الأخيرة في تحضير الرقاقة هي إزالة حبة الحافة. يتم ذلك عن طريق إعادة الرقاقة إلى مبرمج الدوران وتطبيق تيار ثابت من مزيل سرعة حافة SUA على الحافة الخارجية للرقاقة المطلية.
الخطوة التالية هي تصميم مقاومة الضوء عن طريق التعرض الانتقائي للأشعة فوق البنفسجية. أولا ، يتم وضع الرقاقة المطلية على سطح مستو ويتم وضع قناع الكروم مباشرة في الأعلى. يمنع فيلم الإخفاء الأحمر الياقوتي نقل الأنماط خارج المنطقة المرغوبة.
بعد ذلك ، يتم توصيل جرعة 300 مللي جول لكل سنتيمتر مربع من ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى الرقاقة المطلية من خلال القناع باستخدام نظام حمل البقعة. أخيرا ، تخبز الرقاقة لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية لربط المناطق المعرضة للضوء في مقاومة الضوء مما يجعلها غير قابلة للذوبان. تتمثل الخطوة الأخيرة في إنشاء السيد في إزالة المناطق غير المتشابكة من مقاومة الضوء تاركة وراءها هياكل إغاثة مرتفعة.
أولا ، يتم إرجاع الرقاقة مرة أخرى إلى مبرمج الدوران ويتم تغطيتها بحل المطور. يتم ترك المطور على الرقاقة المطلية لمدة خمس دقائق تقريبا ثم يتم نسجها ، مما ينتج عنه نمط واضح على الرقاقة. يتم غسل أي بقايا متبقية عن طريق رش كحول الأيزوبروبيل على رقاقة الغزل.
نستخدم سرعة دوران تبلغ 2200 دورة في الدقيقة لهذه الخطوة لمدة خمس إلى 10 ثوان. أخيرا ، يتم تجفيف السيد النهائي باستخدام تيار غاز النيتروجين وتخزينه في طبق حتى تصبح هناك حاجة إليه لصب الجهاز. نقوم بتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة باستخدام مطاط السيليكون بولي ميثيل آلين.
أولا ، يتم تسليم المواد الأساسية وعامل المعالجة بنسبة وزن 10 إلى واحد في كوب بلاستيكي. بعد ذلك ، يتم خلط الخليط. فجر آندي باستخدام خلاط تكييف AR 100.
بمجرد اكتمال الدورة ، يتم سكب PDMS السائل بالتساوي على السيد. ثم يتم وضع الطبق الذي يحتوي على السيد و PDMS غير المعالج في غرفة مفرغة للتخلص من الغاز. تظهر فقاعات البوليمر على الفور تقريبا.
يستمر التفريغ حتى تختفي جميع الفقاعات. يوضع الطبق في فرن مستو عند 65 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل للسماح تماما بالربط المتقاطع للبوليمر. ثم تتم إزالة PDMS المعالج بعناية من السيد القابل لإعادة الاستخدام.
يتم قطع الحواف الأربعة الأولى جيدا خارج المنطقة المزخرفة باستخدام مشرط ، ويتم تقشير الجهاز بعيدا عن الرقاقة المزخرفة باستخدام الملقط. يمكن قص حواف الجهاز باستخدام المقصات إذا رغبت في ذلك. يمكن فصل قسم فرعي من الجهاز عن بقية جهاز PDMS المصبوب.
بعد ذلك ، يتم ثقب ثقوب الوصول من خلال PDMS. نستخدم لكمات الخزعة المتوفرة تجاريا بعدة أحجام مختلفة مثبتة على شجرة صغيرة. تتم إزالة نوى PDMS للضغط باستخدام الملقط.
أخيرا ، يتم تنظيف الجهاز المشذب والمثقوب باستخدام كحول الأيزوبروبيل ومسحة البولي بروبيلين ذات الرؤوس الرغوية. يتم تجفيف الجهاز باستخدام النيتروجين ثم وضعه في الفرن لإزالة جميع آثار المذيبات. تتمثل الخطوة الأخيرة في صنع جهاز الموائع الدقيقة في ربط PDMS بركيزة منزلقة زجاجية ، ثم ملؤها بالسوائل أولا.
يتم وضع جهاز PDMS والشريحة الزجاجية مع تباعد سطح الترابط في منظف البلازما. في هذه التجربة ، نستخدم منظف البلازما PDC 32 G herrick. بمجرد إنشاء الفراغ وظهور البلازما البنفسجية الزرقاء ، يتم ضبط المؤقت لمدة 30 ثانية.
يتم إيقاف تشغيل مولد البلازما. يتم إعادة ضغط الغرفة ، ويتم وضع الجهاز وشريط التمرير المأخوذين من الغرفة وأسطح الترابط في الاتصال. عند إزالة المكونات المنشطة من الغرفة ، من المهم التحرك بسرعة حتى تظل الأسطح نشطة.
يساعد الضغط اللطيف على ضمان رابطة جيدة. يتم التحقق من جودة الرابطة عن طريق سحب الزاوية بالملقط. يمكن بعد ذلك ملء الجزء الداخلي المحب للماء بسهولة بمحلول مائي مثل الوسائط العازلة أو منزوع الأيونات.
يتم إعطاء سائل الماء في كل مصدر من خلال خلية التدفق الصغيرة التي يسهل اختراقها المقابلة. بمجرد امتلاء جميع الغرف ، يتم وضع طبقة رقيقة من PDMS المعالجة فوق الجهاز بأكمله للمساعدة في تأخير التبخر والحفاظ على العقم. لمعايرة التدفق المدفوع بالضغط في الجهاز ، قم بتحميل خلايا التدفق الدقيقة بالماء منزوع الأيونات مسبقا ، ضع وحدة تدفق ، والتي تعمل كواجهة توصيل السوائل وختم معقم أعلى الجهاز.
يمكن استخدام وحدة التدفق هذه من تلقاء نفسها أو توصيلها بسائل خارجي يحتوي على خزان ، مثل حقنة بلاستيكية. قم بتوصيل خزان يحتوي على سائل مثل حقنة بلاستيكية أو وحدة التدفق بمدخل المنبع. حافظ جيدا على ارتفاع السائل في الخزان فوق ارتفاع المصب.
حسنا ، يحدد الاختلاف في الارتفاع بين خزان المنبع وكل مخرج مصب بئر القوة الدافعة للتدفق المدفوع بالضغط لتحديد معدلات التدفق عبر الأجهزة. يتم استخدام إبرة قياس 25 ذات نهاية حادة لجمع العينات من آبار المصب على فترات منتظمة. على سبيل المثال ، نقوم بجمع العينات كل 15 إلى 20 دقيقة مع ملاحظة الوقت الفعلي المنقضي بعناية بين العينات.
يتم تسجيل وزن المحقنة قبل وبعد أخذ العينات على ميزان تحليلي. يتم رسم الحجم الإجمالي مقابل الوقت الإجمالي مع الميل الذي يساوي متوسط معدل التدفق الكتلي. يساعد المقطع العرضي الكبير لخزان المدخل مقابل آبار المخرج على منع معدلات التدفق من التغير بشكل كبير حيث يتحرك السائل عبر الأجهزة ويرسم الحجم الذي تم أخذ عينات منه على المحور Y مقابل وقت العينة على المحور x.
في برنامج رسم بياني بسيط مثل Excel للحصول على ميل الخط ، يتم استخدام المنحدر لمتوسط معدل التدفق الحجمي. يتم استخدام محلول مخفف من ثلاثة حبات لاتكس فلورية ميكرومولار مع أسطح كربوكسي و YG و YG عادية لتصور التدفق ودراسة تفاعلات السطح. أولا ، يتم تحضير محلول من الخرز في ماء منزوع الأيونات بتركيز 0.01٪ من المواد الصلبة.
يضاف الحل إلى آبار المنبع ويعاد توصيل وحدة التدفق ب zu. يتم تصور تدفق حبة التدفق على مدار ساعة واحدة ويتم تسجيله كل 10 دقائق تقريبا على مجهر الفلورسنت Zeiss AIOt 25 ، المجهز بكاميرا أحادية اللون MITx BCEB 0 1 3 U. يتم التقاط الإطارات الفردية في تتابع سريع وتجميعها في أفلام باستخدام برنامج مثل Image J مع إضاءة مضان وإضاءة ضوئية مرسلة.
الخرزات والهياكل كلاهما مرئية. عندما يتم حظر الضوء المنقول ، تكون حبات الفلورسنت الساطعة مرئية فقط. تظهر الخرزات الثابتة المودعة على طول السطح السفلي أو المتصلة بالمجمعات في جميع أنحاء الجهاز.
بالنسبة للتجارب باستخدام البكتيريا الحية ، يتم تحضير مزرعة مثل أنواع Vibrio ، وهو بروتين فلوري أخضر غير ممرض يعبر عن البكتيريا. أولا ، تتم إزالة ثقافة المخزون من التخزين المجاني العميق. يتم تلقيح قارورة ذات وسائط نمو LB معقمة بثقافة الأسهم.
باستخدام حلقة تلقيح يمكن التخلص منها ، يتم تحضين القارورة طوال الليل مع الاهتزاز لينتج عنه ثقافة طور ثابتة بتركيز حوالي 10 إلى الخلايا التاسعة لكل مليلتر. اعتمادا على التطبيق ، يمكن قياس التركيز الأولي للبكتيريا بشكل أكثر دقة. يتم تحضير جهاز ميكروفلويديك مملوء بمخزن مؤقت معقم.
ثم يتم إفراغ السائل المعقم في آبار المنبع واستبداله ب 20 ميكرولترا من مزرعة البكتيريا. باستخدام ماصة ، يتم زرع البكتيريا في الجهاز باستخدام شفط لطيف مع حقنة على آبار الإخراج بعد الحضانة ، يمكن تحديد كمية البكتيريا في الآبار عن طريق تحديد شدة التألق لكل بئر بعد الاستعمار. يتم إفراغ بئر مدخل المنبع كما كان من قبل واستبداله بمخزن مؤقت مغسول ب 25 جزءا لكل ألف أملاح.
يتم تطبيق ضغط لطيف لمياه البحر الاصطناعية على آبار المنبع باستخدام حقنة تغسل خلايا التدفق الفردية ب 20 إلى 40 ميكرولترا من المحلول العازل. هذا ما يقرب من 100 إلى 200 ضعف الحجم الضعيف لجزء التربة الموائع الدقيقة من خلية التدفق بعد التدفق الأولي. يتم تحقيق نضح البكتيريا على المدى الطويل من خلال الوسائط المسامية باستخدام وحدة التدفق تماما كما هو موضح من قبل.
يمكن قياس صور الضوء الفلوري والأبيض لنمو البكتيريا ونقلها بمرور الوقت. في هذه التجربة ، يتم التقاط الصور كل 15 إلى 20 ساعة لمدة سبعة أيام باستخدام كاميرا CCD ملونة بخمسة مبردة من حبر التصوير Q. يمكن أيضا استخدام أجهزتنا للتحقيق في تأثيرات بنية الموائل المادية على توفير ملجأ للبكتيريا من الافتراس بواسطة الأوليات. رايت.
فيما يلي بكتيريا في خلية تدفق صغيرة يسهل اختراقها مع الأوليات المهدبة الأكبر حجما المرئية في الجهاز الذي يرعى البكتيريا. في تحليل تدفق السوائل في جهاز الموائع الدقيقة ، نجد أن متوسط معدل التدفق يساوي 0.71 ميكرولتر في الدقيقة لرأس ضغط 40 ملم. عن طريق زيادة رأس الضغط إلى 60 ملم ، زاد معدل التدفق بشكل متناسب إلى 1.04 ميكرولتر في الدقيقة.
عند استخدام الخرزات ذات الكيمياء السطحية المختلفة في الجهاز ، نلاحظ تراكما أكبر للخرز غير الكربوكسيل على أسطح الجهاز. في حين أن الخرزات التي يتراوح قطرها من ستة إلى 10 ملليمترات كانت أكثر عرضة للانغلاق في فتحات المسام الأصغر. أدت معدلات التدفق الأسرع الناتجة عن زيادة الضغط الهيدروستاتيكي إلى انخفاض احتباس الخرزة وتثبيتها ، كما هو متوقع لتحليل نمو البكتيريا في جهاز الموائع الدقيقة eco chipp.
نلاحظ الاختلافات النوعية في كثافة الصورة في قطاعات مختلفة من الجهاز. يمكن قياس شدة التألق كبديل للكتلة الحيوية الميكروبية في القناة. في التجارب الجارية ، نلاحظ أن قوى القص المستمرة لظروف التدفق المنخفض يبدو أنها تسبب تراكم البكتيريا وتكوين القطيع كما هو واضح في هذه الصور ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية إنشاء واستخدام أجهزة ميكروسويديك بسيطة لقياس مقياس الجسيمات ، أو تصادم النقل عبر الوسائط المسامية ، أو للتحقيق في التفاعلات الميكروبية في الموائل ذات البنية الدقيقة.
عند إجراء الدراسات باستخدام خلايا التدفق ، من المهم مراعاة طفو الخرز والكيمياء السطحية للغرويات والمجمعات. عند تقليص نظام الموائع الدقيقة ، يمكن أن تهيمن التأثيرات السطحية على الظواهر المرصودة. عمليا يمكن دمج أي هيكل فيزيائي في تصميم خلايا تدفق الموائع الدقيقة.
هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
تقوم هذه الدراسة بعرض جهاز ميكروفلويدي مصمم لتقليد الوسط المسامي الطبيعي، مما يتيح التصوير الفوري لنمو البكتيريا وعمليات النقل. يسمح الجهاز بالتحقيق المنهجي في العوامل المختلفة التي تؤثر على ظواهر النقل في البيئات الجوفية.
Understanding microbial transport in complex environments is critical for assessing biopharmaceutical contamination risks in water systems and for developing predictive models of pathogen spread. Microfluidic platforms enable systematic de-risking of biological hypotheses by isolating variables such as habitat structure, flow dynamics, and inoculum size. This supports early-stage target validation and assay development by providing reproducible, scalable systems for mechanistic screening under controlled conditions.
The microfluidic habitat array integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven screening of microbial transport under variable conditions, informing lead identification through predictive modeling of subsurface behavior.