تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي

يوضح هذا الفيديو إجراء لتحفيز وتلطيخ خلايا الدم المحيطية أحادية النواة أو pbmc. لتحليل قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان ، يتم وضع Alec Watts من pbmc المعزول من الدم الكامل في ألواح زراعة الأنسجة. يتم تحفيز الخلايا كيميائيا أو بيولوجيا لإنتاج استجابة مناعية.

بعد التحفيز ، تتم إضافة مزيج من الأجسام المضادة لتحديد أنواع الخلايا بناء على علامات السطح المعبر عنها. ثم تتخلل الخلايا ويضاف مزيج مختلف من الأجسام المضادة للكشف عن التعبير عن السيتوكينات داخل الخلايا ، ثم يتم تحليل الخلايا بالحقائق لتحديد ملامح السيتوكين لمجموعات فرعية محددة من pbmc. مرحبا ، أنا إيمي كورتني من مختبر الدكتور جاغان ساس في قسم المناعة في مركز إم بي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس.

مرحبا ، أنا هونغ هير أيضا من المختبر. سنعرض لك اليوم تحليلا متعدد القياس الخلوي لاستجابات الخلايا التائية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الاستجابات المناعية الخلوية في Reus Maca.

لذلك دعونا نبدأ. ابدأ هذا البروتوكول باستخدام مقياس الخلوي الدموي لتحديد عدد الخلايا القابلة للحياة ل pbmc من Reuss Maca بطريقة استبعاد Trian Blue Dye. العمل في غطاء التدفق الصفحي ريوس.

قم بتعليق الخلايا في وسط كامل بتركيز 10 ملايين خلية لكل مليلتر للتحفيز غير المحدد عند 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة زراعة أنسجة 96 جيدا. ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على PMA و CIN ليصل الحجم الإجمالي إلى 0.2 ملليلتر بتركيز نهائي قدره 50 نانوجرام لكل مليلتر PMA و 500 نانوجرام لكل مليلتر CIN لآبار التحكم السلبية ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط الكامل وحده إلى كل منهما. احتضان الخلايا جيدا عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي المرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون بعد 1.5 ساعة.

أ فيلدن A للثقافة بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل مليلتر واحتضانه لمدة 4.5 ساعة إضافية. يضاف الفيلدين A إلى السيتوكينات trapp في جهاز G الذهبي لزيادة الرؤية مع التلوين المناعي ، بعد جهاز الطرد المركزي التحفيزي لإزالة الوسط ثم غسله بإضافة 200 ميكرولتر من الغسيل بالتدفق البارد والمخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي بسرعة منخفضة. كرر هذا الغسيل ، ثم أعد إرساله في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المتدفق.

الخلايا جاهزة الآن للتلطيخ للتعبير عن علامات السطح لكل بئر من الخلايا المعلقة. أضف ميكرولتر واحد من الصبغة التفاعلية المائية الميتة الحية القابلة للإصلاح المحضرة وفقا للمصنعين وتعليمات S. احتضن عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة أثناء احتضان الخلايا.

قم بإعداد محاليل التلوين التي سيتم استخدامها للحقائق في الأنابيب الدقيقة. أولا ، قم بإعداد كوكتيل قائم ليشمل ما يلي بشكل مناسب. مضان معاير المسمى الأجسام المضادة أحادية النسيلة ، مضاد للقرص المضغوط ثلاثة PE SCI سبعة ، مضاد للقرص المضغوط ثمانية Alexa 700 مضاد للقرص المضغوط 28 لكل CCP SCI 5.5 ، مضاد للقرص المضغوط 95 A PC ومضاد للقرص المضغوط أربعة Pacific Blue Inflow Wash Buffer.

بعد ذلك ، قم بإعداد عناصر التحكم في التعويض ، والتي سيتم استخدامها لتحديد معاملات الامتداد لكل بقعة فردية في أجهزة الكشف الأخرى عن طريق إعداد أنبوب من كل جسم مضاد مترافق فلورسنت بشكل فردي كبقعة لون واحد. أخيرا ، قم بإعداد التألق ناقص واحد أو بقع FMO من خلال الجمع بين جميع الكواشف باستثناء الكواشف ذات الأهمية. سيتم استخدام هذا لتحديد الحدود بين السكان الإيجابيين والسلبيين عن طريق تكرار مستويات التألق الذاتي والبيانات الموجودة في العينات الملطخة بالكامل.

بعد أن تحتضن الخلايا في البقعة الميتة الحية ، اغسلها مرة واحدة باستخدام محلول غسيل التدفق البارد لإزالة الصبغة الزائدة ، واستنشق مخزن الغسيل. ثم أضف محاليل التلوين المعدة. احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.

اغسل الخلايا الملطخة بمحلول غسيل التدفق البارد لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول نفاذية تثبيت BD لمدة 10 دقائق على الأقل. قم بتخزين الخلايا عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 24 ساعة حتى يتم استخدامها أو استمر في تسمية السيتوكينات داخل الخلايا لتسمية السيتوكينات داخل الخلايا.

أولا ، قم بتجذر الخلايا في 100 ميكرولتر من تجعيد X واحد. احتضان المخزن المؤقت لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية في الظلام أثناء احتضان الخلايا. قم بإعداد الأجسام المضادة للتلطيخ وعناصر التحكم في التعويض وضوابط FMO في مخزن غسيل واحد × تجعيد كما كان من قبل.

بعد تحضين الخلايا لمدة 10 دقائق ، قم بالدوران وإزالة المخزن المؤقت للغسيل x perm. أضف الأجسام المضادة المناسبة للتلوين. ثم احتضان الخلايا والأجسام المضادة لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام بعد الحضانة.

اغسل الخلايا مرتين بمحلول النفاذ. بعد الغسيل النهائي ، يعلق النسخ الخلايا في 1٪ ألدهيد Paraform في DPBS لإصلاح الخلايا. قم بتخزين الخلايا عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى يتم استخدامها لمدة تصل إلى 24 ساعة.

بمجرد تلطيخ الخلايا ، استخدم مقياس التدفق الخلوي LSR أو مقياس التدفق الخلوي DP السماوي لأداء الحقائق. ثم قم بتحليل البيانات باستخدام FlowJo أو برامج مماثلة. تم تحديد تكوين PBMC في reuss Maca باستخدام تحليل الفاكس.

يوضح هذا الشكل مخطط البوابات المستخدم لتحليل المجموعات الفرعية المختلفة للخلايا التائية من تمثيلي. تم تسور الخلايا الليمفاوية أولا عبر FSC المشتت الأمامي مقابل SSC المبعثر الجانبي ثم تم تحديد الخلايا الليمفاوية الحية بناء على SSC و AQUA السلبية للمجموعة. ثم تم تحديد الخلايا التائية بواسطة القرص المضغوط ثلاثة تعبيرات CD أربعة إيجابية ، و CD ثمانية سلبية ، و CD أربعة سلبية CD ثمانية مجموعات إيجابية داخل CD ، كما تم تحديد ثلاثة مجموعات إيجابية من الخلايا التائية الإيجابية.

تم تمييز الخلايا التائية الأربعة الموجبة والمضغوطة الثماني موجبة إلى مجموعات فرعية مختلفة على أساس تعبير CD 28 و CD 95 كذاكرة مركزية ساذجة وخلايا ذاكرة مستجيبة. يوضح هذا الشكل إنتاج إنترفيرون جاما و IL اثنين في غير محفز و pma. حفز CIN القرص المضغوط أربع خلايا تائية موجبة ومجموعات فرعية.

لاحظ ملامح السيتوكين المميزة الناتجة عن التحفيز. في كل مجموعة فرعية. علينا أن نوضح لك كيفية إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي متعدد pbmc.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعداد كل من عناصر التحكم في تعويض اللون الفردي وعناصر التحكم الفلورية ناقص واحدا. كلا هذين الضابطين ضروريان للتحليل السليم لبيانات قياس التدفق الخلوي. يرجى الرجوع إلى بروتوكولنا المكتوب لمزيد من المعلومات حول اختيار ضوابط التعويض.

أيضا ، يرجى تذكر أنه عند استخدام الأجسام المضادة المسمى بالفلورسنت ، من المهم تغطية العينات للحماية من التعرض للضوء. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.