على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

الهدف العام من مقالة الفيديو هذه هو تقديم إجابات للسؤالين التاليين. أولا ، هل يمكن إجراء دراسات تفاعلات البروتين بشكل أكثر موثوقية عن طريق قياس جزء عينة البروتين القادر بالفعل على الارتباط ببروتين آخر؟ ثانيا ، كيف يمكن للتحليل الحركي أن يمنحنا فهما أفضل للبنية والعلاقات الوظيفية؟

سيتم تناول هذين السؤالين في تجربة تتضمن Corp X 100 ، وهي أداة تكتشف تفاعلات البروتين في الوقت الفعلي دون استخدام الملصقات. ستدرس هذه التجربة تفاعل السيستاتين البقري B مع غراء السيستين البروتياز ، التركيب البلوري للبروتينين في النقاط المعقدة إلى العديد من المخلفات المشاركة في الارتباط بالبروتياز لتحديد كيفية تأثير كل من المخلفات المتفاعلة على تفاعل السيستاتين ب بابين. يتم إنتاج العديد من متغيرات السيستاتين B عن طريق الطفرات الموجهة للموقع.

في مثل هذه التجارب ، هناك دائما احتمال ألا تنثني البروتينات المؤتلفة بشكل صحيح أو تتجمع أو تتدهور مما يؤدي إلى نتائج غير صحيحة وغير قابلة للتكرار. يتمتع VIACORE X 100 بالقدرة على تحديد جزء البروتين المتاح للربط عن طريق تحليل التركيز الحر للمعايرة المختصر CFCA. يسمح هذا النهج بتحديد تركيز البروتين مع نشاط الربط المحتفظ به حتى في حالة عدم توفر معايير المعايرة.

سيتم استخدام CFCA هنا لتحديد تركيز متغيرات السيستاتين B. سيتم بعد ذلك استخدام هذه البيانات كمدخلات في تحديد حركية الارتباط لمتغيرات السيستاتين B ب ب ، والتي يتم تقييمها أيضا باستخدام BOR X 100. مرحبا ، أنا CLA gram من GE Healthcare في السويد.

ستوضح لك زميلتي إيفا بول اليوم كيفية إجراء تحليل علاقة وظيفة الهيكل باستخدام BOR X 100 قد تظهر البروتينات المؤتلفة نشاطا غير لائق للطي أو الصندوق السائب بمرور الوقت ، ولا يمكن اكتشاف هذا السلوك بالطرق التي تعتمد على قياس التركيز الكلي. قد يؤدي هذا في الواقع إلى بيانات حركية غير صحيحة بعد قياسات التركيز عن طريق تحليل التركيز الخالي من المعايرة. يستخدم B.A core X 100 لتحليل حركية وتقارب تفاعل متغيرات السيستاتين B مع البيبان.

ستعطي هذه المعلمات نظرة ثاقبة لآلية الربط. نبدأ بشرح موجز للتصميم التجريبي ، لذلك دعونا نبدأ. يهيمن على التفاعل بين السيستين والبروتياز والبابين والمثبط سيستاتين ب من خلال الاتصالات الكارهة للماء كما يتضح من التركيب البلوري للبروتينين في المجمع.

من جانب المثبط ، تكون مناطق التلامس هي N و C الطرفية Ns وحلقتين من دبوس الشعر. في هذه الدراسة ، تم فحص أربعة طفرات ، كل منها يحتوي على سيستين ثلاثة إلى طفرة سورية تم إدخالها من أجل منع ثنائي التركيب سيستاتين B. بناء على السياق الذي تم الكشف عنه في التركيب البلوري ، تم تحور الليوسين 73 إلى الجلايسين الهيستامين 75 إلى الجلايسين وتم تغيير التيروزين 97 إلى ألانين. تم إدخال طفرتي الجلايسين لفحص أهمية السلاسل الجانبية للهيستيدين 75 والليوسين 73 للارتباط ببيبين ، وتم تحور بقايا التيروزين إلى ألانين للتحقيق في التفاعل بين الطرف C للسيستاتين B و Pepin.

يتم اختبار الطفرات المزدوجة الثلاثة بالإضافة إلى INE ثلاثة إلى متحولة سورية مفردة لتفاعلها مع متغير غير نشط تحفيزي من Papain S methyl popin. يحتوي هذا الشكل غير النشط التحفيزي من Proteus على مجموعة ميثيل متصلة ب CYS 25 في الشق النشط. من أجل البساطة ، سنسمي هذا المتغير بروبان في جميع أنحاء البروتوكول.

تعتمد CFCA على قياس معدل الارتباط في ظل الظروف التي يكون فيها المعدل محدودا بانتشار جزيئات التحليل على السطح. يفضل هذا من خلال مستويات الشلل العالية للترابط. قبل البدء في إجراء الشلل ، ضع المخزن المؤقت HEPs المستخدم في التجارب على الدرج الأيسر وأدخل كلا الأنبوبين.

ضع أيضا زجاجة نفايات فارغة على الدرج الأيمن. ثم أدخل مستشعر جديد من جبس خمسة في تهيئة الأداة عبر برنامج core X 100 ، وفي شاشة البدء ، انقر فوق عنصر أداة رقاقة الإرساء. انقر فوق بدء المستند في البرنامج.

بعد ذلك ، استخدم معالج الشلل لإعداد التثبيت والتثبيت من خلال استهداف اقتران للرقابة على CM five من شاشة البدء ، والنقر فوق زر الخيارات الأخرى ، ثم حدد المعالجات. يعرض هذا نافذة بها المعالجات المتوفرة. حدد الشلل ثم انقر فوق الزر الجديد في أسفل اليمين ، تظهر الشاشة الأولى لمعالج الشلل التي تهدف إلى اقتران المستشعر بالجبس الخامس هو الافتراضي.

حدد المربع الموجود أسفل خلية التدفق الثانية لتثبيت الحركة في خلية التدفق الثانية. يتم ترك خلية التدفق الأولى دون تعديل لاستخدامها كسطح مرجعي من الخيارات الثلاثة المتاحة أدناه. حدد مربع تحديد وقت جهة الاتصال على مستوى الهدف الأيمن الذي يتغير إلى وقت الاتصال ، وحدد وقت الاتصال 900 ثانية.

بعد ذلك ، أدخل معلمات الشلل تحت محلول الترابط المائل للجزيء. أدخل غراء. ثم انقر فوق التالي.

الشاشة التالية تخطيط حامل العينة. الموضع الأول سوف يحتفظ et الإيثانول أمين يستخدم لتعطيل النشط المتبقي بعد اقتران صوب غراء الترابط على سطح الرقاقة. أدخل محلول الإيثانول أمين في الموضع الأول في الموضع الثاني.

ضع غراء الترابط يتم تخزينه في فائض من كبريتات الميثيل ويلمح إلى 50 ميكروغرام لكل ملليلتر في 10 ملليمولار أسيتات الصوديوم. يعيد الرقم الهيدروجيني 4.5 تكوين كواشف اقتران EDC و NHS من مجموعة اقتران الأمين بماصة الماء المقطر المزدوجة 85 ميكرولتر من EDC في قارورة. قم بتغطيته وضعه في الموضع الثالث.

استخدم نفس الحجم ل NHS في الموضع الرابع. لاحظ أن الملف الخامس يجب أن يكون مغطى وفارغا حتى تتمكن الأداة من مزج ED و C و NHS في هذا الملف. تذكر أيضا أن تملأ ملف الغسيل في الموضع H2O بالماء العذب منزوع الأيونات.

عندما يتم ملء الحامل وفقا للمخطط التفصيلي على الشاشة ، انقر فوق عينات التحميل وقم بتحميل الحامل في الأداة. عند تحميل الحامل ، انقر فوق التالي. قبل بدء التشغيل، يتم عرض قائمة اختيار.

تأكد من استيفاء جميع النقاط عندما تكون كذلك. يبدأ التشغيل بالضغط على زر البدء. يبدأ التشغيل أثناء إجراء الشلل.

يتم جمع البيانات في الوقت الفعلي. أولا ، يتم حقن كواشف التوصيل. يقترن البابي التالي بسطح الرقاقة وينتهي الإجراء بتعطيل الاسترات النشطة المتبقية.

بعد التشغيل، تلخص نافذة الحوار نتيجة التشغيل. في هذه النافذة ، يتم عرض مستوى الشلل. يجب أن ينتج عن إجراء الاقتران بأكمله حوالي 3000 غراء مشلولة RU.

بمجرد تثبيت غراء في شريحة المستشعر ، ابدأ تحليل CFCA عن طريق تخفيف عينات السيستاتين B الطافرة إلى تركيز إجمالي يبلغ حوالي 10 نانومولار في 300 ميكرولتر على الأقل. سجل عامل التخفيف حيث سنستخدمه لاحقا في إعداد الفحص. ابدأ بإحضار مربع حوار المعالج كما هو موضح في القسم السابق في قسم التركيز في مجلد الفحص.

اختر المعايرة المجانية، ثم اختر جديد. تعرض الشاشة الأولى للمعالج تسلسل الحقن. يمكن أن تظل الإعدادات دون تغيير منذ استخدام شريحة المستشعر CM five ونهج مقايسة الشلل المباشر هنا.

انقر فوق التالي في الشاشة التالية. اترك خانات الاختيار الأساسية قبل تشغيل دورات بدء التشغيل وتشغيلها. أيضا ، اترك العدد الافتراضي لدورات بدء التشغيل دون تغيير عند ثلاثة.

أدخل المخزن المؤقت لأكوام الذاكرة المؤقتة في اسم حقل الحل. ثم انقر فوق التالي. في الشاشة التالية ، أدخل اسم محلول التجديد ، وهو 20 مللي مولار هيدروكسيد الصوديوم.

اترك المعلمات الأخرى دون تغيير. انقر فوق التالي لعرض نموذج الجدول. قم بإعداد العينات وفقا لجدول العينة.

ينتج عن كل صف في نموذج الجدول دورتين. واحد بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة والآخر بمعدل 100 ميكرولتر في الدقيقة. ابدأ الجري بفارغة.

ثم أدخل اسم معامل انتشار عامل التخفيف عند 20 درجة مئوية والوزن الجزيئي. لكل طفرة ، يمكن حساب معامل الانتشار باستخدام أداة الويب على موقع المنتج. يتم توفير رابط لهذه الأداة في متصفح الدعم للبرنامج.

نظرا لأنه يوصى بتشغيل كل نموذج وتكراره، انسخ الجدول بأكمله من الصف الفارغ إلى آخر نموذج والصقه في أسفل الجدول. انقر فوق التالي للمتابعة. تعرض الشاشة التالية حامل العينة.

ضع العينات والكواشف في الرف وفقا للتخطيط الموضح بواسطة البرنامج. قم بتحميل الحامل في الجهاز بالضغط على زر عينات التحميل. ثم انقر فوق التالي.

بعد تحميل العينات ، يتم عرض شاشة تذكير مع قائمة اختيار. تأكد من التحقق من كل شيء ثم اضغط على ابدأ. يتم جمع البيانات في الوقت الفعلي أثناء التشغيل.

عند اكتمال التشغيل، أغلق النافذة التي تعرض البيانات التي تم جمعها. لاحظ ظهور عنصر نتيجة جديد في النافذة الرئيسية. لحساب التركيزات من البيانات ، حدد عنصر النتيجة الجديد وانقر فوق الزر.

التقييم عبر core X 100. يبدأ برنامج التقييم في عرض جميع البيانات التي تم جمعها من شريط الأدوات ، وتحديد تحليل التركيز ، ثم المعايرة بدون من القائمة. في النافذة الأولى، اختر البيانات المراد تضمينها في التحليل.

قم بالتمرير عبر القائمة وانتقل عبر قائمة العرض لعرض البيانات لجميع العينات. إذا كنت تريد استبعاد أي بيانات، فقم بإزالة علامة الاختيار من القائمة. انقر فوق التالي لبدء الحساب.

يتم تركيب نموذج تفاعل CFCA تلقائيا على البيانات التجريبية عند اكتمال التركيب ، ويتم الإبلاغ عن النتائج لكل عينة في نافذة النتائج. انتقل إلى التركيبات لكل عينة عن طريق تحديد الصف المقابل في الجدول. يوضح العمود المسمى التركيز المقاس التركيز في العينة التي تم تحليلها.

يتم حساب التركيز في العينة الأصلية باستخدام عامل التخفيف الذي تم إدخاله مسبقا والمعروض في عمود التركيز المحسوب عند الانتهاء، انقر فوق إنهاء لحفظ النتيجة. الآن بعد أن عرفنا تركيزات البروتينات من تحليل CFCA ، لدينا أساس ممتاز لقياساتنا الحركية اللاحقة. سيساعدنا التحليل الحركي الآن على فهم أهمية بقايا الأحماض الأمينية الرئيسية لآلية الربط.

لنبدأ بإعداد التحليل الحركي. يبدأ التحليل الحركي بتثبيت شريحة مستشعر جديدة CM five في الجهاز في شاشة البدء. اختر إنشاء سير عمل فحص لتقارب الحركية.

في الزاوية العلوية اليسرى ، تظهر نافذة حوار حيث يتم إدخال معلومات حول الترابط. أدخل اسم غراء في مربع اسم الترابط واختر بروتينا آخر من قائمة أنواع الأنواع. ثم حدد تثبيت الترابط تساهميا باستخدام شريحة المستشعر CM خمسة من نهجي مرفق الترابط البديلين المقدمين ، يتم الآن تحديد سير عمل الفحص الموصى به على الجانب الأيمن من النافذة.

يبدأ بخطوة الشلل متبوعة بخطوة فحص. اضغط على متابعة للمتابعة. احفظ سير عمل الفحص كما هو مطلوب عن طريق إدخال اسم والضغط على حفظ.

يحدد البرنامج الآن سير عمل الفحص باستخدام الأزرار المرتبطة بكل خطوة. الخطوة الأولى تحت إعداد سطح المستشعر هي العثور على درجة حموضة التعبئة. نظرا لأن هذا الرقم الهيدروجيني معروف، اضغط على إدخال قيمة معروفة في مربع الحوار الذي يظهر.

أدخل اسم المخزن المؤقت أسيتات ودرجة الحموضة 4.5 واختر حفظ. يتم الآن تحديث سير عمل الفحص بعلامة اختيار خضراء للإشارة إلى اكتمال هذه الخطوة. حان الوقت الآن لتثبيت الحركة ، اضغط على زر التشغيل في الخطوة المثبتة.

يؤدي هذا إلى إظهار نفس المعالج الذي تم استخدامه للبروبان والتثبيت لتحليل CFCA يتم إعداد تثبيت البابين للتحليل الحركي بنفس الطريقة هنا ، باستثناء أنه يتم حقن محلول أكثر تخفيفا لوقت أقل. هذا من أجل شل حركة أقل من البابين لتجنب المواقف التي تكون فيها معدلات ربط السيستاتين متحولة محدودة بالانتشار بحيث يمكن قياس البيانات الحركية بمعزل عن غيرها. نظرا لأنه تم إدخال اسم الترابط ودرجة الحموضة في الخطوات السابقة في سير عمل الفحص ، فقد تم تعيين كلاهما مسبقا هنا.

التحديث الوحيد المطلوب هو 50 ثانية لوقت الاتصال. ثم يستمر الشلل كما هو موضح سابقا. الارتباط المتوقع بعد مستوى الشلل هو 50 R ru.

تشير علامة الاختيار الخضراء بجوار زر التشغيل إلى اكتمال الشلل. بعد ذلك، أدخل حل الإنشاء في سير العمل في الخطوة. ابحث عن شروط الإنشاء بالنقر فوق إدخال القيم المعروفة في مربع الحوار الذي يظهر.

أدخل حل التجديد ووقت الاتصال. ثم انقر فوق حفظ. الآن بعد أن تم تجميد الترابط وإدخال شروط التجديد ، تم تعيين كل شيء لإنشاء بيانات الحركية في مربع مقايسة التقارب الحركية للتشغيل ، اضغط على زر التشغيل الخطوة الأولى في الحركية.

يحدد معالج التقارب تسلسل الحقن لكل دورة لحركية الدورة الواحدة ، والتي تستخدم هنا ، ليست هناك حاجة لتغيير أي شيء. انقر فوق التالي للمتابعة. في الخطوة التالية ، احتفظ بالإعدادات الافتراضية التي تشير إلى تحضير النظام قبل التشغيل.

اختر تشغيل دورة بدء تشغيل واحدة لموازنة سطح الشريحة. بعد ذلك ، حدد معلمات الحقن للعينة. نظرا لأنه تم تحديد حل التجديد مسبقا وتم تحديد الإعداد مسبقا ، فلا داعي لتغيير أي من المعلمات في الشاشة.

انقر فوق التالي. أخيرا ، حدد العينات. أدخل صفين لكل متغير متحور ، أحدهما فارغ والآخر مع عينة.

يشار إلى دورة فارغة عن طريق ضبط معلمة التركيز الأعلى على الصفر. اثنان. يمكن أن تكون متغيرات Cystatin B مناسبة في كل جولة. لكل طفرة أدخل الوزن الجزيئي ، وأعلى تركيز ، وعامل التخفيف ، اضغط على التالي.

في الشاشة التالية ، يتم تحديد رف العينة. قم بإعداد سلسلة تخفيف من عينات البروتين وضع القوارير ذات الأغطية في الرف كما هو موضح على الشاشة ، يتم وضع قارورة مع عازلة في الموضع 13 ويتم وضع قارورة مع محلول التجديد في الموضع 14. تأكد من ملء موضع الماء بالماء العذب.

ضع الحامل في الجهاز وقم بتحميل العينات بالضغط على زر عينات التحميل وانقر فوق التالي. كما كان من قبل، قم بإجراء فحص نهائي قبل متابعة تشغيل التجربة بالضغط على بدء ظهور بيانات التفاعل في الوقت الفعلي. عند انتهاء التشغيل ، تابع على الفور تشغيل متغيرات السيستاتين B المتبقية وفقا لما هو موضح للتو.

إذا تم تشغيل متغيرات السيستاتين B المتبقية على التوالي، فقم بحذف الخطوة الأولية ودورة بدء التشغيل عن طريق إلغاء تحديد خانات الاختيار المقابلة في الخطوة. عند الانتهاء من كل تشغيل ، يمكن الوصول إلى البيانات من الرابط. جميع النتائج في سير عمل الفحص.

تظهر نافذة حوار تحتوي على كافة النتائج التي تم إنشاؤها داخل سير العمل هذا. من أجل حساب ثوابت المعدل الحركي ، حدد النتيجة لتقييمها واضغط على تقييم كن أساسيا ، تم تشغيل برنامج التقييم X 100 مرة أخرى لعرض جميع البيانات الجماعية. حدد تقارب الحركية من قائمة شريط الأدوات.

في الشاشة الأولى ، يتم اختيار السيستين الثالث إلى المتحولة السورية للتقييم. يتم عرض البيانات من هذا الطفرة جنبا إلى جنب مع التشغيل الفارغ الذي تم إجراؤه لهذا المتابعة المتحولة عن طريق النقر. مقبل. تعرض الشاشة التالية البيانات مع طرح التشغيل الفارغ من التشغيل مع العينة.

اختر تقييم الحركية بالنقر فوق الزر الحركية. اختر الآن ملاءمة البيانات مع نموذج تفاعل فردي. بالنقر فوق الزر المناسب ، يتم عرض الملاءمة على الشاشة كما يتم حسابها.

بمجرد أن يصبح جاهزا ، يتم تطبيق ضوابط الجودة تلقائيا وتمييزها في الأسفل. انظر في عناصر مراقبة الجودة ثم انظر إلى بيانات جرام المستشعر للتأكد من أن جرامات المستشعر تظهر انحناءا كافيا. أيضا ، ألق نظرة على المخطط المتبقي الذي يوضح الاختلافات بين البيانات التي تم جمعها والنموذج المجهز.

انتبه إلى الانحرافات المنهجية وغير العشوائية. هذا الملاءمة مقبول. الآن ألق نظرة على البيانات الحركية في علامة تبويب التقرير.

ثابت معدل الارتباط ، ثابت معدل التفكك وثابت تفكك التوازن. عند الانتهاء ، اضغط على إنهاء كرر نفس الإجراء لجميع المسوخ الأخرى. فيما يلي النتائج التمثيلية لتحليل CFCA لمتغيرات السيستاتين B المختلفة التي تم فحصها.

يتم استخراج بيانات تركيز الربط المحددة من جرامات المستشعر التي تم الحصول عليها بمعدلات تدفق تبلغ 10 و 100 ميكرولتر في الدقيقة. عند مقارنة التركيز الذي يحدده قياس اثنين 80 مع التركيز الذي تحدده CFCA ، من الواضح أنه في حين أن البروتين في معظم الحالات يكون نشطا بالكامل لمتغير الليوسين 73 جلايسين ، فإن جزء البروتين النشط منخفض جدا. يتم تحديد حركية متغيرات السيستاتين B المرتبطة بالبيبين باستخدام حركية الدورة الواحدة.

تظهر جرامات المستشعر بيانات مطروحة فارغة ومرجعية مع حركية لنموذج تفاعل فردي متراكب باللون الأسود. تركيز الارتباط المحدد الذي تم قياسه بواسطة CFCA لمتغير leucine 73 هو حوالي 10٪ فقط من إجمالي تركيز البروتين كما هو محدد من خلال قياس اثنين 80. عند استخدام التركيز الصحيح في حساب المعلمات الحركية ، يصبح من الواضح أن معدل الارتباط ل Lucien 73 مشابه لمعدل المتغيرات الأخرى.

في حين أن معدلات ارتباط الطفرات قابلة للمقارنة مع تلك الخاصة بالبروتين من النوع البري ، فإن ثابت معدل التفكك للطفرات يمكن أن يكون أعلى بما يقرب من أمرين من حيث الحجم مع زيادة مقابلة في ثابت تفكك التوازن. تعتمد الصلات المنخفضة بشكل أساسي على زيادة معدلات التفكك ، مما يشير إلى أن كلا من حلقة الربط الثانية والنهاية الطرفية C للسيستاتين B تساهمان في تقارب الارتباط عن طريق إبقاء المثبط مرتبطا بالإنزيم بمجرد تكوين المركب ، كان استخدام تحليل التركيز الحر للمعايرة ضروريا لهذا الاستنتاج لأن أحد الطفرات تبين أن له نشاط ربط منخفض للغاية ، لقد أوضح لك زميلي بول الآن كيفية استخدام ثنائي النواة X 100 في دراسة دالة منظمة. عند إجراء هذه التجارب ، من المهم أن تتذكر أنه على الرغم من أن كلا من التركيز والتحليل الحركي يعتمدان على نفس إجراء الربط ، إلا أن الظروف التجريبية مختلفة تماما.