دراسة تجمعات الحويصلة متشابك من الأصباغ باستخدام Photoconversion Styryl

يوضح هذا الفيديو إجراء التحويل الضوئي لصبغة Styro Dye FM 1 43. لدراسة مخازن الحويصلات التشابكية في ذبابة drosophila melanogaster، يتم أولاً تشريح يرقات drosophila للكشف عن العضلات البطنية التي تشكل تحضير الوصلة العصبية العضلية أو NMJ. يتم تحضين العينات في محلول منظم يحتوي على FM D الموضح هنا باللون الرمادي والذي يعمل على وسم الغشاء الخلوي.

يتم بعد ذلك تحفيزها كهربائياً أو كيميائياً لتحريض الاندماج الفيزيائي، حيث يتم استيعاب غشاء الحويصلة داخلياً بعد ذلك. وسيتم تلوين عملية الإفراز الخلوي المحفزة باستخدام صبغة FM D. ثم تُغسل صبغة FM خارج الخلوية، مما يزيلها من الغشاء البلازمي، ويتم تثبيت النسيج تحت إضاءة عالية الكثافة ومستمرة. يتم تبييض الصبغة تماماً، ويظهر اللون الأسود نتيجة ترسب di amino Ben.

يمكن بعد ذلك رؤية هذه الرواسب باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (transmission em). مرحباً، أنا فيليب أو باسو من مختبر سيلفيا أولي في المعهد الأوروبي لعلوم الأعصاب في غاون، ألمانيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتحويل الضوئي لـ FM في الوصلة العضلية العصبية.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة إعادة تدوير الحويصلات المشبكية. حسناً، لنبدأ العمل تحت مجهر تشريحي. ابدأ بتثبيت يرقة drosophila بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى في طبق مطلي بمادة so guard.

قم بتغطيتها بمحلول الدروزوفيلا الملحي باستخدام إبرة حقنة، واستخدم مقص التشريح لعمل شق طولي في الجانب الظهري. بعد ذلك، قم بإزالة الأعضاء الداخلية. ثم قم بمد العينة وتثبيتها مجدداً بالدبابيس في طبق بيتري.

يمكن بعد ذلك استخدام العديد من العضلات البطنية لحماية صبغات FM المستخدمة في هذا الإجراء من البهتان. يجب تنفيذ هذا الإجراء في ظروف إضاءة منخفضة. قم بتغطية تحضيرة ذبابة الدrosophila المثبتة بمحلول ملحي لـ drosophila يحتوي على 90 millimolar من كلوريد البوتاسيوم، و 10 micromolar من FM.1 43 لتحفيز الأعصاب كيميائياً.

تُحضن العينة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد التحفيز. يتم إزالة محلول التحفيز وغمر الطبق الذي يحتوي على ذبابة drosophila المثبتة -المجهزة في دورق يحتوي على 100 milliliters من محلول drosophila saline- مرتين لإزالة صبغة FM 1 43 خارج الخلوية، مع العمل تحت غطاء السلامة الكيميائية.

ثبّت تحضير الوصلة العصبية العضلية في 2.5% glutaraldehyde في محلول الفوسفات المنظم أو PBS لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل التحضير مرة واحدة باستخدام PBS، ثم أخرجه من طبق السيجار واغمسه في 100 millimolar من كلوريد الأمونيوم لمدة 15 دقيقة، وذلك لإخماد مجموعات الألدهيد الحرة للمثبت glutaraldehyde المتبقي.

اغسل محلول كلوريد الأمونيوم باستخدام محلول PBS عادي، ثم ضع تحضير الوصلة العصبية العضلية في طبق سيجار جديد واغمره في محلول 1.5 milligram per milliliter من الديامين بنزيدين أو DAB المرشح في محلول PBS، وحضنه لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. ضع العينة تحت مجهر فلوري مجهز بمصدر ضوء من مصباح زئبقي مع غلاف للمصباح يحتوي على مرآة خلفية، باستخدام عدسة شيئية جافة ذات تكبير منخفض نسبياً.

حدد موقع العينة. ثم باستخدام مكعب مرشحات الإثارة الزرقاء العادية والفلورة الخضراء، قم بضبط تركيز الإشارة الفلورية. ستظهر الوصلات العصبية العضلية كنقاط مضيئة على العضلات.

بعد ذلك، وباستخدام نفس مجموعة مرشحات الفلورة، قم بإضاءة العينة بأقصى شدة حتى يتلاشى صبغ FM D تمامًا. وباستخدام عدسة شيئية بقوة 20x، ستكون مدة 30 إلى 45 دقيقة كافية. ومع ذلك، فإن وقت التحويل الضوئي يختلف اعتمادًا على شدة الإضاءة، ومدى نفاذ DAB في التحضيرة، والعدسة الشيئية المستخدمة.

بعد الإضاءة، افحص العينة تحت الضوء النافذ. في حال حدوث التحول الضوئي، يجب أن يظهر راسب بني داكن. عُد إلى مجهر التشريح، ثم استخدم المقص لقص البقعة التي حدث فيها التحول الضوئي من اليرقة.

عد إلى مجهر التشريح. ثم استخدم المقص لقص البقعة التي تم تحويلها ضوئياً من اليرقات. الآن، ضع العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على PBS أثناء العمل تحت غطاء سلامة كيميائية وارتداء معدات السلامة المناسبة، بما في ذلك القفازات وواقي العينين.

قم بتحضير 300 µL من رباعي أكسيد الأوزميوم بتركيز 1% لكل عينة. الآن ضع العينة في دورق زجاجي بغطاء بلاستيكي وأضف محلول رباعي أكسيد الأوزميوم المُحضّر لتثبيت العينة. وأثناء فترة حضانة العينة، قم بتحضير محاليل منفصلة تحتوي على إيثانول بتركيزات 30% و50% و70% و90% و95% و100%.

اغسل العينة من أربع إلى خمس مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. وبعد كل غسلة، استخدم طرف ماصة بلاستيكياً لنقل العينة إلى دورق جديد. وبعد الغسلة الأخيرة، انقل العينة إلى دورق زجاجي نظيف.

بعد ذلك، قم بتجفيف العينة عن طريق وضعها في سلسلة من محاليل الإيثانول. ابدأ بالتحضين في 1 mL من الإيثانول بتركيز 30%. ثم بعد خمس دقائق، قم بإزالة الإيثانول باستخدام ماصة باستور واستبدله بـ 1 mL من الإيثانول بتركيز 50%.

استمر في عملية التجفيف، مع تحضين تحضيرة الوصلة العصبية العضلية في محاليل بتركيزات 70% و90% ثم 95%. بعد ذلك، يتم تحضين العينة في محلول إيثانول بتركيز 95% لمرات أكثر مما يتم تحضينها في الإيثانول بتركيز 100%، وذلك ثلاث مرات بعد التجفيف. أضف 2 mL من راتنج EIN بنسبة واحد إلى واحد إلى الإيثانول، ثم ضع العينة في حاضنة دوارة.

يُترك لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة بعد التدوير بنسبة 100%ein، وتوضع العينة في دورق مفتوح للسماح بتبخر الإيثانول المتبقي لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات. يُصب EIN جديد في قالب، ثم تُضاف التحضيرات وتُحضن عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 36 ساعة.

عندما تصبح تحضيرات الـ EIN المدمجة جاهزة، استخدم المقطاع الفائق (ultra microtome) لتحضير مقاطع رقيقة تتراوح سماكتها بين 50 إلى 80 nanometer باستخدام سكين ماسية. يتم قطع العينات إلى مقاطع رقيقة، حيث تطفو هذه المقاطع على الحمام المائي للسكين، ويمكن بعد ذلك التقاطها على شبكات EM العادية.

أصبحت التحضيرات الآن جاهزة للتصوير باستخدام إجراءات المجهر الإلكتروني التقليدية. تم تحفيز الوصلات العصبية العضلية المعزولة من Drosophila Melan gaster باستخدام البوتاسيوم عالي التركيز، وصُبغت الأغشية المستبطنة باستخدام FM 1 43 كما هو موضح هنا.

يمكن ملاحظة الفلورة في النهاية العصبية باستخدام مجهر فلورة فوقي (epi fluorescence microscope) تقليدي. وتحت الإضاءة المستمرة، يتم تبييض الصبغة تماماً، وعندما تستمر الإضاءة، يظهر لون أسود نتيجة ترسب الدينو بنزين (dino benzine). تحتوي هذه النهاية العصبية على حويصلات مشبكية، ولكن لا يتم تحويل أي منها ضوئياً.

قد يكون السبب في ذلك هو عدم كفاية الإضاءة أو ضعف نفاذ DIA amino benzine في النسيج. وفي المقابل، تؤدي الإضاءة المفرطة إلى ظهور طرف داكن بشكل عام حيث لا يمكن تمييز الحويصلات أو العضيات، بينما يمكن رؤية التحويل الضوئي عند توفر القدر المناسب من الإضاءة. تظهر هذه الصورة المجهرية زرًا مشبكيًا يظهر فيه تجمع من الحويصلات الداكنة، مما يشير إلى حدوث تحويل ضوئي لـ FM.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية التحويل الضوئي للحويصلات المشبكية المميّزة بصبغة fem. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة معايرة أوقات الإضاءة لخطوة التحويل بدقة دائمًا. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة. بالتوفيق في تجاربكم.