دراسة تجمعات الحويصلة متشابك من الأصباغ باستخدام Photoconversion Styryl

يوضح هذا الفيديو إجراء تحويل الصور ل Styro Dye FM 1 43. لدراسة أحواض الحويصلة المشبكية في ذبابة الفاكهة السوداء ، يتم تشريح يرقات ذبابة الفاكهة الأولى لكشف العضلات البطنية التي تشكل الوصلة العصبية العضلية أو مستحضر NMJ. يتم تحضين المستحضرات في مخزن مؤقت يحتوي على FM D الموضح هنا في الغشاء الخلوي الرمادي.

ثم يتم تحفيزها كهربائيا أو كيميائيا للحث على غشاء الحويصلة الاندماج الفيزيائي الذي يتبع. سيتم تلطيخ إفراز الخلايا المحفز ب FM D ، ثم يتم غسل صبغة FM خارج الخلية ، وإزالتها من غشاء البلازما ، ويتم تثبيت الأنسجة تحت إضاءة مستمرة عالية الكثافة. يتم تبييض الصبغة تماما ويظهر اللون الأسود بسبب ثنائي الأمينية بن وهطول الأمطار.

يمكن بعد ذلك تصور هذا الراسب عن طريق الإرسال. مرحبا ، أنا فيليب أو باسو من مختبر سيلفيا أولي في المعهد الأوروبي لعلوم الأعصاب في غاون ، ألمانيا. سنعرض لك اليوم إجراء لتحويل صور FM inria التقاطع العصبي العضلي.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة إعادة التدوير المثانية المشبكية. حسنا ، دعونا نبدأ العمل تحت مجهر تشريح. ابدأ بتثبيت الجانب الظهري من يرقات ذبابة الفاكهة لأعلى في طبق مغطى بالحراسة.

قم بتغطيته بمحلول ملحي ذبابة الفاكهة باستخدام إبرة حقنة وابحث عن مقص تشريح قسم الجانب الظهري طوليا. ثم قم بإزالة الأعضاء الداخلية. بعد ذلك ، قم بتمديد المستحضر ومرة أخرى ، قم بتثبيته في طبق السيجار.

يمكن بعد ذلك استخدام العديد من العضلات البطنية لحماية أصباغ FM المستخدمة في هذا الإجراء من التبييض. يجب تنفيذ هذا الإجراء في ظروف الإضاءة المنخفضة. قم بتغطية مستحضر ذبابة الفاكهة المضغوط بمحلول ملحي يحتوي على 90 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم ، و 10 ميكرومولار FM.1 43 يموت لتحفيز الأعصاب كيميائيا.

احتضن لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد التحفيز. قم بإزالة المحلول المحفز واغمر الطبق مع ذبابة الفاكهة المثبتة. التحضير في دورق مملوء ب 100 مل من ذبابة الفاكهة الملحية مرتين لإزالة قالب FM 1 43 خارج الخلية يعمل تحت غطاء أمان كيميائي.

قم بإصلاح مستحضر الوصلة العصبية العضلية في 2.5٪ جلوتارالديهايد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل المستحضر مرة واحدة باستخدام PBS ، ثم أخرجه من طبق السيجار واغمره في 100 مللي مولار كلوريد الأمونيوم لمدة 15 دقيقة. لإخماد مجموعات الألدهيد الحرة من مثبت الألدهيد المتبقي.

باستخدام PBS العادي ، اغسل محلول كلوريد الأمونيوم ، ضع مستحضر الوصلة العصبية العضلية في طبق سيجار جديد واغمره في 1.5 ملليغرام لكل مليلتر مفلتر. ثنائي أمين بنزين أو DAB في PBS ويحتضن لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ضع العينة تحت مجهر فلوري مزود بمصدر ضوء مصباح زئبقي مع مبيت مصباح يحتوي على مرآة خلفية باستخدام هدف جاف منخفض التكبير نسبيا.

ابحث عن العينة. ثم باستخدام مكعب مرشح مضان أخضر أزرق عادي ، اجعل إشارة الفلورسنت في بؤرة التركيز. تظهر الوصلات العصبية العضلية كنقاط مضيئة على العضلات.

بعد ذلك ، باستخدام نفس مجموعة مرشح التألق ، قم بإضاءة العينة بأقصى كثافة حتى يتم تبييض FM D تماما. باستخدام عدسة موضوعية 20 × ، يجب أن تكون 30 إلى 45 دقيقة كافية. ومع ذلك ، يختلف وقت تحويل الصورة اعتمادا على شدة الإضاءة واختراق قوة DAB في التحضير والعدسة الموضوعية المستخدمة.

بعد الإضاءة ، افحص العينة تحت ضوء الإرسال. إذا تم تحويل الصورة ، فيجب رؤية راسب بني غامق. ارجع إلى نطاق التشريح ، ثم استخدم المقص لقص البقعة المحولة للصورة من اليرقة.

ارجع إلى نطاق التشريح. ثم استخدم المقص لقص البقعة المحولة للصورة من اليرقات. الآن ضع العينة في أنبوب فوج صغير يحتوي على PBS يعمل تحت غطاء أمان كيميائي ويرتدي معدات السلامة المناسبة ، بما في ذلك القفازات وحماية العين.

تحضير 300 ميكرولتر من 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم لكل عينة. الآن ضع العينة في قارورة زجاجية بلاستيكية وأضف محلول رابع أكسيد الأوزميوم المحضر لتثبيت المستحضر. أثناء احتضان العينة ، قم بإعداد محاليل منفصلة تحتوي على 30 و 50 و 70 و 90 و 95 و 100٪ من الإيثانول.

اغسل العينة أربع إلى خمس مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد كل غسلة، استخدم PEs بلاستيكية إلى الماصة لنقل العينة إلى قارورة جديدة. بعد الغسيل الأخير ، انقل العينة إلى قارورة زجاجية نظيفة.

بعد ذلك ، قم بتجفيف العينة عن طريق وضعها في سلسلة من محاليل الإيثانول. ابدأ باحتضان مليلتر واحد من 30٪ من الإيثانول. ثم بعد خمس دقائق ، قم بإزالة الإيثانول باستخدام ماصة المراعي واستبدله بمليلتر واحد من 50٪ من الإيثانول.

استمر في الجفاف ، واحتضان تحضير الوصلة العصبية العضلية في حلول 70 و 90 ثم 95٪. سيتم بعد ذلك تحضين العينة في محلول الإيثانول بنسبة 95٪ لأكثر من الاحتضان في 100٪ من الإيثانول ثلاث مرات بعد الجفاف. أضف ملليلترين من راتنج EIN واحد إلى واحد إلى الإيثانول وضع العينة على حاضنة مدورة.

من ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة بعد الدوران عند 100٪ في وضع العينة في قارورة مفتوحة للسماح للإيثانول المتبقي بالتبخر لمدة أربع إلى ست ساعات. صب EIN الطازج في قالب. نضيف المستحضرات ونحتضن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 36 ساعة.

عندما تكون المستحضرات المضمنة في EIN جاهزة ، استخدم ميكروتوما فائقا لتحضير أقسام رقيقة من 50 إلى 80 نانومتر باستخدام سكين الماس. يتم قطع العينات في أقسام رقيقة. تتدفق الأقسام على الحمام المائي للسكين ويمكن التقاطها بعد ذلك على شبكات EM العادية.

الاستعدادات جاهزة الآن للتصوير باستخدام إجراءات EM التقليدية. تم تحفيز الوصلات العصبية العضلية المعزولة من ذبابة الفاكهة ميلان المعدة باستخدام نسبة عالية من البوتاسيوم والأغشية الداخلية. تم تلطيخها باستخدام FM 1 43 كما هو موضح هنا.

يمكن ملاحظة تألق الطرف العصبي باستخدام مجهر مضان epi التقليدي. تحت الإضاءة المستمرة ، يتم تبييض الصبغة تماما وعندما تستمر الإضاءة ، يظهر لون أسود بسبب ترسيب دينو بنزين. يحتوي هذا الطرف العصبي على حويصلات متشابكة ، ولكن لم يتم تحويل أي منها بالصورة.

قد يكون سبب ذلك عدم وجود إضاءة كافية أو ضعف تغلغل DIA أمينو بنزين في الأنسجة. على النقيض من ذلك ، ينتج عن الكثير من الإضاءة طرف مظلم شامل حيث لا يمكن تمييز حويصلات أو عضيات مع القدر المناسب من تحويل صور الإضاءة التي يمكن رؤيتها. يظهر هذا الرسم المجهري بوتون متشابك حيث تظهر مجموعة من الحويصلات الداكنة تشير إلى تحويل صور FM.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحويل الصور الحويصلات المشبكية المسماة ب fem die. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما معايرة أوقات الإضاءة بعناية لخطوة التحويل. هذا كل شيء.

شكرا للمشاهدة. حظا سعيدا في تجاربك.