باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

مرحباً، اسمي جاي هاركينز. أنا باحث علمي في Protein Discovery. سأوضح لكم اليوم مدى سهولة استخدام نظام GelFree 8100 Fractionation الجديد لتحقيق تجزئة عالية الاسترداد بناءً على الوزن الجزيئي.

باستخدام تقنية gel free، يمكنك تحميل ما يصل إلى 1 mg من البروتين الكلي لكل قناة، وفصل ما يصل إلى ثماني عينات بشكل متكرر في غضون 90 دقيقة تقريبًا. ويتضمن النظام جهازًا، وخرطوشة قابلة للتخلص، وجميع المحاليل المنظمة التي تحتاجها لإجراء التجربة. لذا، دعونا نبدأ.

ابدأ هذا الإجراء بتجهيز وتسمية ما يصل إلى ثماني أنابيب سعة 500 µL. أضف ما يصل إلى 1 mg من عينة البروتين في حجم يصل إلى 112 µL. تعتمد كمية البروتين في العينة على مدى تعقيد العينة.

بالنسبة للعينات الأكثر تعقيداً، مثل متجانس الأنسجة المستخدم في هذا العرض التوضيحي، فإن استخدام 150 إلى 200 micrograms لكل قناة سيعطي أفضل النتائج. بعد ذلك، أضف 30 µL من منظم عينات تركيز خمسة أضعاف (five x sample buffer)، والموجود في طقم خرطوشة الهلام المجانية. أضف ثمانية µL من DTT بتركيز one molar إلى كل عينة بروتينية.

بعد ذلك، قم بتعديل كل عينة باستخدام الماء للوصول إلى حجم نهائي قدره 150 µL. ثم سخّن القوارير لمدة خمس دقائق عند 95 °C لتمسخ العينة. اترك العينات المسخنة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة بينما تبرد العينة.

أخرج خرطوشة gel free 8, 100 من الغلاف القصديري. ثم قم بإزالة سدادة اللوحة والتخلص منها. استخدم الماصة لإزالة محلول التخزين من حجرات الخرطوشة.

إذا سيتم استخدام جميع حجرات الخرطوشة الثماني، اقلب الخرطوشة لتصريف منظم التخزين من المقصورات. بعد ذلك، يتم إضافة 8 mL من منظم التشغيل الحر للجِل إلى كل خزان من خزانات منظم الأنود. وتضاف 6 mL إلى كل خزان من خزانات منظم الكاثود، ثم يتم سحب 100 µL بالماصة ووضعها في كل حجرة من حجرات التجميع.

باستخدام ماصة ثمانية القنوات بسعة 100 إلى 200 µL، قم بإزالة والتخلص من أي محلول منظم تدفق من خزان المحلول المنظم للكاثود إلى حجرة تحميل العينات، ثم قم بتحميل العينات على الفور في حجرات التحميل. بمجرد تحميل العينات، ضع الخرطوشة في محطة التجزئة gel free 8, 100. بعد ذلك، قم بخفض مصفوفات الأقطاب الكهربائية وإغلاق الغطاء باستخدام واجهة المستخدم الرسومية سهلة البرمجة على شاشة العرض التي تعمل باللمس في الجهاز، وانتقل إلى قائمة الطرق المبرمجة مسبقاً والمتاحة.

حدد الطريقة المناسبة بالضغط على زر الطريقة. اضغط على زر الاسترجاع وأدخل رقم الطريقة المبرمجة مسبقاً والمطلوبة. باستخدام لوحة المفاتيح الموجودة على الشاشة، اضغط على موافق. ثم اضغط على زر التطبيق.

ستظهر الطريقة التي تم تطبيقها في أسفل الشاشة الرئيسية. تتكون كل طريقة من الطرق المبرمجة مسبقاً من جهود كهربائية محددة وفترات توقف زمنية مصممة لفصل البروتينات ضمن نطاق محدد من الأوزان الجزيئية. بمجرد اختيار الطريقة المناسبة، اضغط على زر القناة الموجود في الشاشة الرئيسية.

بعد ذلك، حدد القنوات التي سيتم استخدامها في عملية التشغيل. لاختيار جميع القنوات الثماني، اضغط على "تحديد الكل" (select all). ثم اضغط على "تم" (done).

للعودة إلى الشاشة الرئيسية، تأكد من إغلاق غطاء السلامة ومن أن مؤشر الضوء في أسفل الشاشة باللون الأخضر. الآن اضغط على زر البدء لبدء التجربة؛ وأثناء تشغيل النظام، توضح الدوائر الظاهرة في المربع الموجود على الجانب الأيسر من الشاشة حالة كل قناة، حيث تشير الدائرة الخضراء إلى أن القناة نشطة.

يتم عرض الجهود والتيارات المطبقة إلى يمين دوائر حالة القناة. سيقوم جهاز gel free 8, 100 بالتوقف مؤقتًا تلقائيًا لجمع الأجزاء وفقًا للفترة المحددة في الطريقة. عندما يتوقف الجهاز مؤقتًا لجمع الأجزاء، سيظهر مربع نص ينبهك بحدوث التوقف، وستتحول دوائر الحالة إلى اللون الأصفر.

داخل الخرطوشة، يتم تطبيق جهد كهربائي ثابت بين خزاني المصعد والمهبط. وتحت تأثير هذا الجهد، يتم دفع خليط البروتينات بالرحلان الكهربائي من غرفة التحميل إلى القالب المصبوب بدقة والمصمم خصيصاً. تتراكم البروتينات أولاً داخل حزمة حادة في هلام التجميع، ثم يتم فصلها بناءً على أوزانها الجزيئية المحددة في هلام الفصل.

عندما تخرج البروتينات من الهلام، يتم احتجازها وتركيزها في الطور السائل. في غرفة التجميع الخالية من الهلام. ثم يتم إيقاف الجهاز مؤقتًا.

بناءً على فترات زمنية محددة مسبقاً، يتم تجميع الأجزاء باستخدام ماصة. بعد ذلك، يتم تطبيق الجهد الكهربائي مرة أخرى للإشارة إلى بدء احتجاز الجزء الثاني من الوزن الجزيئي المطلوب. وتُكرر هذه العملية حتى يتم تجميع جميع الأجزاء المرجوة.

تحتوي كل خرطوشة على ثماني قنوات ترحيل كهربائي مستقلة، مما يتيح للمستخدم تشغيل عدد القنوات الذي يحتاجه والاحتفاظ بالقنوات غير المستخدمة للاستخدام في تاريخ لاحق. ولإزالة الأجزاء، افتح غطاء الجهاز، ثم استخدم ماصة القنوات المدمجة. انقل 150 µL من السائل في كل غرفة تجميع إلى أنابيب تجميع أو لوحة متعددة الآبار.

بمجرد إزالة الكسور، اغسل غرفة التجميع مرتين باستخدام محلول التشغيل الخالي من الجل (gel free running buffer) عن طريق إضافة 100 µL لكل قناة والسحب والضخ بالماصة مرتين. بعد الغسيل، أضف 100 µL من محلول التشغيل الخالي من الجل مرة أخرى في غرف التجميع. أغلق الغطاء واضغط على زر الاستئناف.

سيعمل جهاز gel free 8, 100 حتى الفترة الزمنية التالية. يظهر إجمالي الوقت المتبقي في التجربة على الجانب الأيمن من الشاشة. اضغط على الزر الموجود فوق المربع الذي يعرض الوقت للتبديل بين الوقت المتبقي، والوقت المنقضي، وإيقاف الوقت مؤقتًا.

بمجرد جمع كافة الأجزاء، يمكن استخدامها مباشرة في عمليات التحضير اللاحقة، مثل التركيز المتساوي الكهربائي (isoelectric focusing) أو الرحلان الكهربائي للهلام (gel electrophoresis)، أو للتحليل باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة، أو مطيافية الكتلة، أو التقارب المناعي. في هذا العرض التوضيحي، تم تقسيم ثماني عينات بروتينية بتركيز 200 micrograms لكل منها إلى 12 جزءاً لكل عينة، ليصبح المجموع 96 جزءاً. ولتصوير نتائج عملية التجزئة، تم تشغيل جزء من كل جزء من الأجزاء الـ 12 المأخوذة من عينة متجانس الكبد البقري على هلام قياسي أحادي البعد (1D gel) ثم صبغها بالفضة.

كما هو موضح في هذا الشكل، تم فصل عينة البروتين إلى 12 جزءاً متميزاً تغطي نطاق الوزن الجزيئي من 3.5 kilodaltons إلى 150 kilodaltons. ويسلط الجل المعروض هنا الضوء على قدرة نظام gel free 8, 100 على فصل كمية كبيرة من البروتين إلى أجزاء ذات أوزان جزيئية متميزة. وتعد هذه أداة قوية للغاية في دراسات البروتوميات من الأعلى إلى الأسفل (top-down) ومن الأسفل إلى الأعلى (bottom-up) باستخدام مطياف الكتلة، وكذلك في تجارب الألفة المناعية التي تتطلب جزءاً واحداً منقّى من البروتين السليم بوزن جزيئي محدد.

لقد كان من دواعي سرورنا أن نوضح لكم مدى سهولة استخدام نظام التجزيء gel free 8, 100 لتقسيم عينتكم بشكل قابل للتكرار إلى كسور ذات أوزان جزيئية منفصلة، وتحقيق استرداد عالٍ للمرحلة السائلة. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.