باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

مرحبا ، اسمي جاي هاركينز. أنا عالم أبحاث في Protein Discovery. سأوضح اليوم مدى سهولة استخدام نظام التجزئة الجديد الخالي من الهلام 8 ، 100 لتحقيق تجزئة عالية الاسترداد على أساس الوزن الجزيئي.

باستخدام الجل الخالي ، يمكنك تحميل ما يصل إلى ملليغرام واحد من إجمالي البروتين لكل قناة ، وتجزئة ما يصل إلى ثماني عينات بشكل متكرر في حوالي 90 دقيقة. لذلك يشتمل النظام على أداة وخرطوشة يمكن التخلص منها وجميع المخازن المؤقتة التي تحتاجها لإجراء التجربة. لذلك دعونا نبدأ.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق إعداد ووضع العلامات على ما يصل إلى ثمانية أنابيب سعة 500 ميكرولتر لكل أنبوب. أضف ما يصل إلى ملليغرام واحد من عينة البروتين بحجم يصل إلى 112 ميكرولترا. تعتمد كمية البروتين في العينة على مدى تعقيد العينة.

بالنسبة للعينات الأكثر تعقيدا ، مثل تجانس الأنسجة المستخدم في هذا العرض التوضيحي ، سيؤدي 150 إلى 200 ميكروغرام لكل قناة إلى أفضل النتائج. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من خمسة × عينة عازلة ، والتي يتم توفيرها في مجموعة الخرطوشة الخالية من الجل. أضف إلى كل عينة بروتين ثمانية ميكرولترات من DTT مولي واحد.

ثم اضبط كل عينة بالماء على حجم نهائي يبلغ 150 ميكرولتر. ثم سخني القوارير لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية لتشويه طبيعة العينة. اترك العينات الساخنة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة بينما تبرد العينة.

قم بإزالة خرطوشة 8 ، 100 خالية من الجل من كيس القصدير. قم بإزالة وتخلص من مادة مانعة للتسرب من اللوحة. قم بإزالة المخزن المؤقت للتخزين من حجرات الخرطوشة باستخدام ماصة.

إذا تم استخدام جميع الغرف الثماني للخرطوشة ، فقم بقلب الخرطوشة لتصريف المخزن المؤقت للتخزين من المقصورات. بعد ذلك ، تتم إضافة ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت الخالي من الهلام إلى كل خزان من خزانات العازلة الأنودية. تتم إضافة ستة ملليلتر إلى كل خزان من خزانات العازلة للكاثود ، ويتم سحب 100 ميكرولتر في كل غرفة من غرف التجميع.

باستخدام ماصة ثماني قنوات من 100 إلى 200 ميكرولتر ، قم بإزالة وتجاهل أي مخزن مؤقت يتدفق من خزان عازلة الكاثود إلى غرفة تحميل العينة وتحميل العينات على الفور في غرف التحميل. بمجرد تحميل العينات ، ضع الخرطوشة في محطة التجزئة 8 ، 100 الخالية من الهلام. ثم قم بخفض مصفوفات الأقطاب الكهربائية وأغلق الغطاء باستخدام واجهة المستخدم الرسومية سهلة البرمجة على شاشة اللمس الخاصة بالأدوات ، وانتقل إلى قائمة الطرق المتاحة المبرمجة مسبقا.

حدد الطريقة المناسبة بالضغط على زر الطريقة. اضغط على زر الاسترداد وأدخل رقم الطريقة المبرمجة مسبقا المطلوبة باستخدام لوحة المفاتيح التي تظهر على الشاشة ، اضغط على موافق. ثم اضغط على زر التطبيق.

ستظهر الطريقة التي تم تطبيقها في الجزء السفلي من الشاشة الرئيسية. تتكون كل طريقة من الطرق المبرمجة مسبقا من الفولتية المحددة والتوقف المؤقت المستند إلى الوقت المصمم لحل البروتينات ضمن نطاق معين من الأوزان الجزيئية. بمجرد تحديد الطريقة المناسبة ، اضغط على زر القناة على الشاشة الرئيسية.

ثم حدد القنوات التي سيتم استخدامها في التشغيل. لتحديد جميع القنوات الثمانية، اضغط على تحديد الكل. ثم اضغط على تم.

للعودة إلى الشاشة الرئيسية ، تأكد من إغلاق غطاء الأمان وأن ضوء المؤشر أخضر في الجزء السفلي من الشاشة. الآن اضغط على ابدأ لبدء التجربة أثناء تشغيل النظام ، وتصور الدوائر المعروضة في المربع الموجود على الجانب الأيسر من الشاشة حالة كل قناة. تشير الدائرة الخضراء إلى أن القناة نشطة.

يتم عرض الفولتية والتيارات المطبقة على يمين دوائر حالة القناة. سيتم إيقاف الجل الخالي من الجل 8 ، 100 تلقائيا لجمع الكسور في الفاصل الزمني المحدد في الطريقة. عند إيقاف الأداة مؤقتا لتجميع الكسور ، سيظهر مربع نص لإعلامك بحدوث توقف مؤقت وستتحول دوائر الحالة إلى اللون الأصفر.

داخل الخرطوشة ، يتم تطبيق جهد ثابت بين خزانات الأنود والكاثود. في ظل هذه الإمكانات ، يتم دفع خليط البروتين كهربائيا من غرفة التحميل إلى المصبوب الدقيق المصمم خصيصا. تتراكم بروتينات الجل أولا داخل شريط حاد في هلام التراص ثم يتم حلها بناء على الأوزان الجزيئية الخاصة بها في هلام الحل.

عندما تتخلص البروتينات من الهلام ، فإنها تحبس وتتركز في الطور السائل. في غرفة التجميع جل مجانية. ثم يتم إيقاف الأداة مؤقتا.

بناء على الفترات الزمنية المحددة مسبقا ، يتم جمع الكسور والكسور باستخدام ماصة. ثم يتم تطبيق الإمكانات مرة أخرى للتلميح إلى نهاية الاحتجاز في الجزء الثاني من الوزن الجزيئي ذي الأهمية. ثم تتكرر هذه العملية حتى يتم جمع جميع الكسور المطلوبة.

تحتوي كل خرطوشة على ثماني قنوات كهربية مستقلة بحيث يمكن للمستخدم تشغيل أكبر عدد ممكن من القنوات حسب حاجته وحفظ القنوات غير المستخدمة لاستخدامها في وقت لاحق. لإزالة الكسور، افتح غطاء الجهاز، ثم استخدم ماصة القناة الفطرية. انقل 150 ميكرولترا من السائل في كل غرفة من غرف التجميع إلى أنابيب تجميع أو صفيحة متعددة الآبار.

بمجرد إزالة الكسور ، اغسل حجرة التجميع مرتين باستخدام مخزن مؤقت خال من الهلام عن طريق إضافة 100 ميكرولتر لكل قناة وسحب العينة لأعلى ولأسفل مرتين. بعد الغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الخالي من الجل مرة أخرى إلى غرف التجميع. أغلق الغطاء واضغط على زر الاستئناف.

سيعمل الجل الخالي من 8 ، 100 حتى الفاصل الزمني التالي. يظهر الوقت الإجمالي المتبقي في التجربة على الجانب الأيمن من الشاشة. اضغط على الزر الموجود أعلى المربع لعرض الوقت للتبديل بين الوقت المتبقي المنقضي ووقت الإيقاف المؤقت.

بمجرد جمع جميع الكسور ، يمكن استخدامها على الفور لمزيد من التحضير في اتجاه مجرى النهر ، مثل التركيز المتساوي الكهربي أو الرحلان الكهربائي الهلامي أو للتحليل باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة أو قياس الطيف الكتلي أو التقارب المناعي. في هذا العرض التوضيحي ، تم تقسيم ثماني عينات من البروتين بوزن 200 ميكروغرام لكل منها إلى 12 جزءا لكل منها ما مجموعه 96 كسورا. لتصور نتائج التجزئة ونقل كل جزء من الكسور ال 12 من عينة تجانس الكبد البقري ، تم تشغيله بعد ذلك على هلام قياسي 1D وملطخ بالفضة.

كما هو موضح في هذا الشكل ، تم تقسيم عينة البروتين إلى 12 جزءا مميزا يمتد من الوزن الجزيئي من 3.5 كيلو دالتون إلى 150 كيلودالتون. يسلط الجل الموضح هنا الضوء على قدرة نظام 8 ، 100 الخالي من الهلام على تجزئة كمية كبيرة من البروتين إلى كسور وزن جزيئي مميزة. هذه أداة قوية بشكل لا يصدق للبروتينات من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى باستخدام قياس الطيف الكتلي بالإضافة إلى تجارب التقارب المناعي حيث يلزم وجود جزء واحد من الوزن الجزيئي للبروتين السليم المنقى.

لقد كان من دواعي سروري أن أوضح لك مدى سهولة استخدام نظام التجزئة 8 ، 100 الخالي من الهلام لتقسيم عينتك بشكل متكرر إلى كسور وزن جزيئي منفصلة ، وتحقيق استرداد عالي للطور السائل. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.