تحليل الردود من الخلايا العصبية الحسية الشمية ماوس باستخدام تسجيل Electroolfactogram الهواء المرحلة

يتم تركيب مستحضر الظهارة الشمية على طبق ويوضع في تيار من الهواء الرطب. تحت مجهر تشريح ، يتم توصيل قطب مرجعي كهربائيا بالأنسجة من خلال محلول عازل. يتم وضع قطب تسجيل على سطح ظهارة حاسة الشم.

يتم تحفيز الظهارة الشمية عن طريق نفث الرائحة التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر في تيار من الهواء المرطب ، والذي ينقل الروائح إلى الظهارة الشمية. يتم إرسال إشارات EOG من خلال مكبر للصوت ومحول رقمي إلى كمبيوتر التسجيل. مرحبا ، أنا كاثرين سيار من مختبر النظافة XO في قسم الأحياء بجامعة جونز هوبكنز.

سنعرض لك اليوم إجراء لتسجيل الجرام الكهربائي من الفئران. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة استجابات الخلايا العصبية الحسية الشمية للروائح. لذلك دعونا نبدأ.

يتكون جهاز التسجيل من أنبوب توصيل هواء قطب مرجعي لقطب تسجيل ، ومرحلة العينة ، ومجهر تشريح ، وكلها مثبتة على طاولة هوائية داخل قفص فاراداي. تستخدم معالجات ميكروم لوضع الأقطاب الكهربائية في أنبوب توصيل الهواء. يتم فقاعات تيار هواء مستمر من خلال الماء المقطر لإضافة الرطوبة قبل المرور عبر أنبوب توصيل الهواء وفوق العينة.

يتم استخدام طبق استزراع 60 ملم مملوء بالحميض للتكيف مع ستة إلى ثمانية ملليمترات كسطح تركيب للعينة. يتم تجويف البئر والقناة من الحارس في طبق التركيب. لتوفير وسيلة لتوصيل القطب المرجعي كهربائيا بالعينة عبر محلول جرس معدل.

توصيل أقطاب التسجيل والمرجعية بمكبر للصوت. يتم إرسال الإشارات من مكبر الصوت إلى محول الأرقام ثم إلى جهاز كمبيوتر. يستخدم برنامج الرسم البياني الحادي عشر للتحكم في بروتوكول التحفيز وتسجيل الإشارة وتحليل الاستجابات.

يتم توصيل راسم الذبذبات بعد مكبر الصوت للمراقبة في الوقت الفعلي للجهد الكهربائي أثناء وضع قطب التسجيل. وأثناء تسجيلات EOG. يتم التحكم في توصيل محفزات الرائحة بواسطة بيكو سبريزر ، والذي يتم توصيله بنفس الكمبيوتر المستخدم للحصول على الإشارات قبل توصيل محفز الرائحة.

توصيل إخراج بيكو سبريتزر بزجاجة رائحة تحتوي على رائحة سائلة. ثم يتم توصيل الزجاجة بأنبوب توصيل الهواء. الآن دعونا نرى كيفية تحضير الأقطاب الكهربائية لتسجيل التجارب.

قطب التسجيل عبارة عن سلك فضي من الكلوريد في شعيرات دموية زجاجية مسحوبة مملوءة بمحلول جرس معدل. القطب المرجعي هو سلك فضي من كلوريد. ابدأ في تحضير كلا القطبين عن طريق تركيب سلك فضي في حامل القطب.

بالنسبة لقطب التسجيل ، يجب أن يبرز سنتيمتر إلى سنتيمترين من السلك من نهاية حامل القطب. يمكن ترك المزيد من الأسلاك للقطب المرجعي. لإضافة طلاء كلوريد الفضة ، ضع السلك في كلوريد الصوديوم 0.1 مولار وقم بتوصيل حامل القطب الكهربائي بالطرف الموجب لمصدر طاقة تيار مستمر من 1.5 إلى تسعة فولت.

يجب توصيل الطرف السالب لمصدر الطاقة كهربائيا بمحلول كلوريد الصوديوم 0.1 مولار. اسمح للكلوريد في التفاعل بالمضي قدما لمدة 10 دقائق لمعادلة أي شحنة ثابتة بين التسجيل والقطب المرجعي. المس الأقطاب الكهربائية معا لفترة وجيزة قبل تثبيتها على جهاز التسجيل.

بعد ذلك ، اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة صغيرة. يجب أن يكون قطر الفتحة الموجودة في طرف الشعيرات الدموية حوالي خمسة إلى 10 ميكرون. استخدم قلم رصاص ماسي لتسجيل وقطع الطرف الحاد للشعيرات الدموية بحيث يكون أطول بحوالي سنتيمترين من السلك الفضي.

استخدم شعلة البوتان لتلميع الطرف المقطوع الآن قم بإذابة 0.5٪ agros في محلول جرس معدل. استخدم ماصة نقل لسحب كمية صغيرة من المحلول الزراعي المنصهر إلى طرف القطب باستخدام حقنة تم تسخينها وسحبها للحصول على نهاية رفيعة طويلة. املأ الشعيرات الدموية المسحوبة حوالي نصف الطريق.

باستخدام محلول الرنين المعدل ، قم بتحريك الشعيرات الدموية برفق لإخراج أي فقاعات هواء. قم بتخزين القطب الكهربائي المملوء في وعاء التخزين مع كمية صغيرة من محلول الرنين المعدل في الأسفل حتى يصبح جاهزا للاستخدام. بمجرد تحضير عينة من الأنسجة وجاهزة للتسجيل ، قم بتثبيت شعيرات دموية مملوءة فوق سلك قطب التسجيل مع تجهيز الأقطاب الكهربائية.

دعونا نلقي نظرة على تجربة تسجيل لبدء تحضير الأنسجة للتسجيل. قم بإزالة الجلد الذي يغطي جمجمة الفأر المضحى به وقم بتقسيم الرأس إلى قسمين على طول خط الوسط ، وقم بتركيب نصف الجانب الإنسي للرأس لأعلى على طبق التثبيت. قم بإزالة الحاجز بعناية لفضح القرينات.

ضع الطبق مع منديل مركب على مرحلة التسجيل. قم بمحاذاة المرحلة بحيث يكون موقع التسجيل على القرينات متمركزا تحت المجهر. الآن قم بتشغيل خزان الهواء لتوصيل الهواء المرطب بحوالي 600 مل في الدقيقة إلى سطح المحارة

ضع أنبوب توصيل الهواء بحيث يكون على بعد 10 ملليمترات تقريبا من موقع التسجيل. اضبط مكبر الصوت على وضع التيار المستمر حيث سيؤدي تضخيم التيار المتردد إلى إحداث قطع أثرية في إشارة EOG. احصل على مرشح تمرير منخفض يبلغ كيلو هرتز واحد وكسب 100 ×.

الآن قم بتركيب أقطاب التسجيل والمرجعية على المعالجات الدقيقة. قم بخفض القطب المرجعي في البئر الموجود على طبق التثبيت وقم بتغطيته بمحلول جرس معدل بحيث يكون متصلا كهربائيا بالأنسجة. قم بخفض قطب التسجيل بعناية على سطح التوربين اثنين B أو ثلاثة.

يجب أن يلمس القطب الكهربائي بالكاد سطح الظهارة الشمية. عندما يتلامس القطب مع الظهارة ، سيظهر خط أساس مستقيم على راسم الذبذبات. الآن ، قم بتوصيل زجاجة رائحة بالمنفذ الجانبي على أنبوب توصيل الهواء على الكمبيوتر.

بدء بروتوكول التحفيز. وينبغي أن يكون معدل أخذ العينات للحصول على البيانات كيلوهرتز أو أعلى. سيقوم البرنامج بتشغيل نبضة الرائحة والبدء في التسجيل.

قد يكون بروتوكول التحفيز النموذجي عبارة عن نبضات مدتها 100 مللي ثانية ، نبضة واحدة مقترنة ، 100 مللي ثانية مفصولة بفاصل زمني واحد أو نبضة مستمرة مدتها عشر ثوان. لتقليل التكيف ، اترك من دقيقة إلى خمس دقائق بين البروتوكولات بعد تقديم تركيزات عالية من الرائحة. قد تبقى الرائحة المتبقية في الأنبوب ، اغسل أنبوب الهواء بنسبة 95٪ من الإيثانول وجففه قبل الاستمرار في أخذ عينات إضافية من الأنسجة.

يوفر برنامج الكسب غير المشروع Axo أدوات لقياس المعلمات الرئيسية لإشارة EOG. تشمل هذه المعلمات سعة الاستجابة وزمن الوصول والوقت حتى الذروة وثوابت الإنهاء الزمنية. تعد العديد من معلمات EOG مفيدة بشكل خاص لمقارنة الاستجابات الطبيعية بين الفئران ، بما في ذلك سعة الاستجابة ، ووقت ارتفاع الكمون ، ووقت الذروة وثابت الوقت للإنهاء.

تظهر هنا OGs من الفأر استجابة للتحفيز مع زيادة تركيزات أسيتات الأميل السائلة. يشير الخط الأسود في الأعلى إلى توقيت ومدة تحفيز الرائحة. هنا نرى علاقة استجابة الجرعة في المتوسط من خمسة أشرطة خطأ للفئران هي فترات ثقة 95٪.

غالبا ما يلاحظ انخفاض في سعة الذروة عند تركيزات عالية جدا من الرائحة. يظهر مثال على EOG استجابة لتحفيز النبض المزدوج نبضة قصيرة واحدة من الرائحة تثير التكيف لعدة ثوان. يظهر هنا EOG استجابة ل 10 ثوان من التحفيز المستمر للرائحة.

يظهر EOG إزالة التحسس أثناء عرض الرائحة المستمر. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تسجيل عامل القطب الكهربائي غرام من الفئران. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر وضع القطب الكهربائي على سطح الظهارة مباشرة وعدم اختراق القطب الكهربائي تحت السطح.

قم دائما بالتسجيل من نفس الجانب من الرأس وتجنب التعديلات على الإعداد لتقليل التباين ، والحفاظ على رطوبة الأنسجة ، ولكن دون جمع قطرات السائل ، فإن وضع الأنسجة تحت الهواء المرطب مباشرة بعد التشريح سيحافظ على الأنسجة في أفضل حالة للتسجيل. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.