العزلة والإثراء من خلايا فأر الجذعية الوسيطة (MSCS) والفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة

يتم عزل الخلايا الجذعية الميزنشيمية، والتي يُرمز لها اختصاراً بـ MSCs، من جرذ أنثى من سلالة rag dolly يتراوح عمرها بين ستة وثمانية أسابيع، وتُزرع في طبق بتري بقطر 10 centimeter حتى تصل نسبة الاندماج الخلوي إلى حوالي 80%co fluency. ولإثراء الـ MSCs، تُصبغ الخلايا باستخدام أجسام مضادة أولية مقترنة بالبيوتين، تليها حبيبات مغناطيسية مقترنة بالستربتافيدين. بعد ذلك، يتم فصل الخلايا المَصنفة إلى جزأين، الجزء السلبي والجزء الإيجابي، وذلك عن طريق فرز الخلايا بالتنشيط المغناطيسي.

بعد ذلك، يُستخدم تحليل قياس التدفق الخلوي لتأكيد تعبير المؤشرات السطحية. وفي الختام، تُستخدم أسطوانات الاستنساخ للحصول على خلايا جذعية ميزنكيمية (MSCs) مشتقة من مستعمرة واحدة. مرحباً، أنا لي من مختبر كريستينا تشانغ في قسم الهندسة الكيميائية وعلوم المواد بجامعة ولاية ميشيغان.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل وإثراء الخلايا الجذعية لـ chy، بالإضافة إلى الحصول على خلايا مشتقة من مستعمرات مفردة. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة سلوكيات التكاثر والتمايز للخلايا الجذعية الحمراء. لذا، فلنبدأ.

سيتم عزل الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSCs) من أنثى جرذ من سلالة spra dolly يتراوح عمرها بين ستة إلى ثمانية أسابيع. لبدء هذا الإجراء، يتم قطع عظم الفخذ وعظم الساق من الأطراف الخلفية للحيوان الذي تم القتل الرحيم له. قم بإزالة الجلد والعضلات، ثم ضع عظم الفخذ وعظم الساق المستأصلين في 70%isopropanol لبضع ثوانٍ، وبعد ذلك يتم نقلهم إلى 1X-DPBS.

يجب تنفيذ الخطوات التالية داخل كابينة السلامة الحيوية. أولاً، يتم نقل عظم الفخذ وعظم الظنبوب إلى طبق سعة 10 سنتيمتر يحتوي على DMEM. بعد ذلك، وأثناء تثبيت كل عظمة بملقط، يتم قص الطرفين باستخدام المقص.

قم بتثبيت إبرة قياس 22 في محقنة سعة ثلاثة ملليلتر واملأها بوسط DMEM. أدخل الإبرة في أحد الطرفين المفتوحين للعظمة وقم بدفع النخاع إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. كرر العملية من مرتين إلى ثلاث مرات لكل عظمة حتى يتم استخلاص النخاع بالكامل.

أعد تعليق الخلايا، ثم مرر معلق الخلايا عبر مصفاة خلايا بقطر 70 ميكرومتر لإزالة حطام العظام وتجمعات الدم. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 GS في درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. بعد إزالة السائل الطافي عن طريق الشفط، أعد تعليق الخلايا في 25 مل من وسط استنبات MSC.

أضف 10 milliliters من معلق الخلايا في كل من طبقي زراعة بقطر 10 centimeter. يتم تحضين أطباق الزراعة في حاضنة بدرجة حرارة 37 degrees Celsius ونسبة 5%carbon dioxide لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين. وبمجرد أن تصل خلايا MSCs المعزولة مسبقاً من الجرذان إلى درجة تلاقي تبلغ حوالي 80%، يتم سحب الوسط وإضافة من أربعة إلى خمسة milliliters من trypsin EDTA إلى كل طبق.

أعدِ الأطباق إلى الحاضنة واحضنها لمدة خمس دقائق تقريبًا. وللسماح بانفصال الخلايا، أضف كمية مساوية من وسط الزرع لتعطيل trypsin. اجمع معلقات الخلايا في أنبوب سعة 15 milliliter وقم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 GS في درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة خمس دقائق.

سنقوم الآن بتوضيح عملية إثراء الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) باستخدام علامتين سطحيتين، وهما CD 54 وCD 90. باستخدام مغناطيس BD I، وهو مغناطيس لفصل الخلايا من شركة BD Biosciences. ابدأ بإعادة تعليق كتلة الخلايا في محلول صبغة الخلايا بتركيز 20 million cells per milliliter.

بعد ذلك، أضف جسماً مضاداً لـ CD 54 مُقروناً بالبيوتين وجسماً مضاداً لـ CD 90 مُقروناً بالبيوتين إلى معلق الخلايا، ثم اخلط المزيج برفق. بعد الحضن على الثلج لمدة 15 دقيقة، اغسل الخلايا المميّزة بحجم زائد من محلول BD IMAG buffer بتركيز one X. قم بطرد الخلايا المميّزة مركزياً عند 200 GS في درجة حرارة أربعة درجات مئوية لمدة خمس دقائق. جهّز جزيئات BD imag streptavidin عن طريق الرج الشديد بجهاز vortex، ثم أضف 40 microliters من الجزيئات لكل 10 million خلية.

امزج الجسيمات مع الخلايا الموصومة جيداً، ثم حضن الخلايا عند درجة حرارة تتراوح بين 6 إلى 12 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة. وخلال فترة التحضين هذه، قم بتمييز أنبوب اختبار ذو قاع مستدير لجمع الجزء الموجب. وعند انتهاء التحضين، اضبط حجم الخلايا الموصومة ليصل إلى 20 مليون خلية لكل milliliter.

باستخدام منظم مغناطيسي واحد من نوع Expedia I. انقل الخلايا الموصومة إلى أنبوب تجميع الجزء الموجب. ضع أنبوب الجزء الموجب على المغناطيس BDI واتركه لمدة ست دقائق.

بعد ذلك، وبينما لا يزال أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس BDI، قم بإزالة الطافي باستخدام ماصة باستير زجاجية. بعد ذلك، انزع أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس BDI وضعه على الثلج. أضف 1 mL من منظم XBDI mag buffer المبرد على الثلج وأعد تعليق الخلايا عن طريق الخلط اللطيف.

أعد الأنبوب إلى مغناطيس BDI واتركه لمدة تتراوح من دقيقتين إلى أربع دقائق. تخلص من الطافي باستخدام ماصة باستير زجاجية جديدة. كرر عملية الغسل كما هو موضح سابقاً.

مرة أخرى. وأخيراً، قم بإزالة السائل الطافي باستخدام ماصة باستير زجاجية جديدة. ثم قم بإخراج الأنبوب من جهاز BDI magnet reus.

قم بتعليق الخلايا في 1 مل من وسط الزرع، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من وسط الزرع. دورق مربع بمساحة 175 سنتيمتر مربع للحفاظ على الخلايا، وطبق بقطر 10 سنتيمتر لقياس التدفق الخلوي.

لبدء إجراء فصل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) المشتقة من مستعمرة واحدة، يتم زرع الخلايا بكثافة تتراوح بين 50 إلى 100 خلية لكل طبق بقطر 10 سنتيمتر، وتُحضن في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C ونسبة 5% carbon dioxide لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين. وخلال هذه الفترة التي تمتد من أسبوع إلى أسبوعين، يتم فحص المستعمرات المعزولة جيدًا باستخدام مجهر مقلوب. وبمجرد وصول المستعمرات إلى حجم كافٍ يتجاوز 100 خلية في كل مستعمرة، يتم تحديد هذه المستعمرات باستخدام قلم تحديد دائم في قاع الطبق.

عند اختيار مستعمرة لتمييزها، تأكد من عدم وجود مستعمرات محيطة بالقرب منها. قم بشفط الوسط واغسل الطبق مرة واحدة باستخدام 1X DPBS باستخدام الملقط. التقط أسطوانة استنساخ معقمة وضعها برفق حول المستعمرة المميزة.

كرر هذه العملية حتى يتم وضع أسطوانة استنساخ فوق كل مستعمرة مُعلمة. أضف 100 µL من tripsin EDTA إلى كل أسطوانة استنساخ وأعد الطبق إلى الحاضنة. بعد خمس دقائق، افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت قد بدأت في التكور.

عندما تنفصل الخلايا، أضف كمية مساوية من وسط الزرع لإيقاف مفعول التريبسين. اخلط معلق الخلايا باستخدام الماصة الدقيقة سعة 200 microliter وانقل معلق الخلايا إلى طبق قطر 60 millimeter يحتوي على three milliliters من وسط زرع تم تدفئته مسبقاً. ضع ملصقات تعريفية على الأطباق وأعدها إلى الحاضنة بعد عزل الخلايا الملتصقة بالبلاستيك.

يجب أن تكون الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) مرئية في اليوم التالي للزراعة. ومع استمرار تكاثر الخلايا، يجب أن تبدو الخلايا المتراصة مثل الخلايا الموضحة في صورة تباين الطور هذه، حيث يكون معظمها شبيهاً بالمغزل أو النجمة. وتكون الزراعة مناسبة عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80% من درجة التراص.

بعد عملية التريبسين (trypsinization)، يجب أن تظهر الخلايا المنفصلة بشكل مستدير وعائمة في الوسط. وبمجرد إثراء الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) عن طريق فرز الخلايا المغناطيسي، يتم إجراء قياس التدفق الخلوي للتحقق من تعبيرات العلامات السطحية. إذا كانت عملية الإثراء جيدة، فيجب أن تظهر الخلايا صبغاً إيجابياً تجاه علامات الخلايا الجذعية الميزنكيمية، CD 54 وCD 90، ولكن صبغاً سلبياً تجاه علامة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) وهي CD 45؛ وتُستخدم الضوابط النمطية IgG two A و IgG one كضوابط سلبية.

عندما يتم وضع الخلايا بكثافة نسيلية مناسبة، يجب أن تنمو المستعمرات من خلايا مفردة كما هو موضح في هذا المثال. يمكن بعد ذلك استخدام أسطوانات الاستنساخ لفصل المستعمرات، ومن ثم يمكن استزراع الخلايا المشتقة من تلك المستعمرات بشكل منفصل. في هذين المثالين، تظهر الخلايا المشتقة من إحدى المستعمرات بشكل مغزلي، بينما تظهر الخلايا المشتقة من مستعمرة أخرى بشكل مستدير.

لقد عرضنا لكم كيفية عزل وإثراء الخلايا الجذعية العشوائية والشائعة، وكذلك كيفية الحصول على خلايا مشتقة من مستعمرة واحدة. ومن المهم تذكر ضرورة التخلص من التجلطات الدموية وبقايا العظام أثناء عملية العزل خلال هذا الإجراء. كما يجب استخدام الكمية المثلى من الأجسام المضادة أثناء عملية الإثراء، وتمييز المستعمرات المعزولة جيداً أثناء عملية فصل المستعمرات.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.