التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris

يصف البروتوكول التالي عملية التعبير البروتيني باستخدام خميرة opus الضمورية الميثيلية. يتم عرض تحضير خلايا الخميرة ذات الكفاءة الكهربائية وتحويل الناقل الذي يحمل الجين المستهدف إلى PPAs، تليها خطوة تنقية الحمض النووي DNA للخميرة للتحقق من التكامل الصحيح للجين المستهدف في جينوم الخميرة. وفي النهاية، سنقوم بإجراء عملية التعبير عن البروتين المؤتلف.

مرحباً، أنا ماريا من مختبر ستيفن هالام في قسم الميكروبيولوجيا والمناعة بجامعة كولومبيا البريطانية. وأنا ماركوس، أيضاً من مختبر هيلم. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتعبير عن البروتينات المؤتلفة في خميرة TRO PQ.Past stories.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة البروتينات المستخلصة من كائنات دقيقة غير مستزرعة، حيث تم استخلاص الحمض النووي البيئي وأرشفته ومكتبات الميتاجينوميات. لذا، فلنبدأ. يتطلب التعبير عن البروتينات المعاد تركيبها في خميرة *Pichia pastoris* استنساخ الجين المستهدف في إطار القراءة الصحيح داخل ناقل *Pichia* أبوي.

نستخدم في تجربتنا الناقل PPIC Z alpha A. يحتوي هذا الناقل على محفز AO X one للتعبير الجيني المنظم بدقة والمحفز بالميثانول للجين المستهدف، وإشارة إفراز العامل ألفا لإفراز البروتين المؤتلف، وجين المقاومة zaas للاختيار في كل من e coli و pic، وببتيد في الطرف الكربوكسيلي (C terminal) يحتوي على إيبيتوب acemic وعلامة بولي هيستيدين للكشف عن البروتين المؤتلف وتنقيته. قبل عملية التحول، قم بخطّ الناقل الذي يحتوي على الجين المستهدف عن طريق الهضم التقييدي. نحن نستخدم إنزيم PME one، ولكن يمكن استخدام مواقع تقييد أخرى طالما أن القطعة المدرجة لا تحتوي على موقع التقييد ذلك.

للحصول على كمية كافية من DNA الناقل الخطي، قم بإعداد ثلاثة إلى أربعة تفاعلات هضم إنزيمي في أنابيب منفصلة بحجم 50 µL لكل منها، وبعد عملية الهضم، ادمج جميع المحاليل وقم بتركيز البناء الجيني الخاص بك. باستخدام وحدة ترشيح طرد مركزي AmCon ووحدة ترشيح طرد مركزي MicroCon، ستحتاج إلى ما يتراوح بين 5 إلى 20 µg من DNA الخطي في 5 إلى 10 µL من الماء المعقم لإجراء عملية التحول في PPA dous. ولتحضير خلايا PPA dous كفؤة كهربائياً، قم بتخطيط الخلايا على طبق A-Y-P-D-S بدون SN قبل أربعة أيام من عملية التحول المقررة، واتركها تنمو عند 30 °C لمدة يوم إلى يومين أو حتى تتكون مستعمرات منفردة قبل يومين من عملية التحول.

قم بتنمية 5 mL من سلالة PPA أو السلالة المستخدمة في وسط YPD داخل أنبوب Falcon سعة 50 mL عند درجة حرارة 30 °C طوال الليل. ضع أنبوب Falcon في دورق لتثبيته في الهزاز قبل يوم واحد من عملية التحول. استخدم 0.25 mL من المزرعة التي نمت طوال الليل لتلقيح 500 mL من وسط YPD الطازج في دورق سعة لترين.

قم بالتحضين مرة أخرى طوال الليل في جهاز هزاز عند 30 degrees Celsius حتى تصل قيمة OD 600 إلى 1.3 إلى 1.5. في يوم عملية التحول، جهز الثلج، والماء المعقم البارد، ومحلول sorbitol بتركيز one molar. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 1500 Gs لمدة خمس دقائق عند أربع degrees Celsius.

بعد عملية الطرد المركزي، نقوم بتعليق الراسب باستخدام 500 milliliters من الماء المعقم والمبرد بالثلج. وبناءً على سعة أنابيب الطرد المركزي، قد تضطر إلى تقسيم الحجم على أنبوبين منفصلين أو إجراء عدة دورات طرد مركزي. يتم إجراء الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ثم إعادة تعليق الراسب باستخدام 250 milliliters من الماء المعقم والمبرد بالثلج.

بناءً على سعة أنابيب الطرد المركزي، يمكنك دمج كتل الخلايا المنفصلة في أنبوب واحد. عند إعادة تعليق الخلايا، قم بإعادة تعليق الكتلة مرة أخرى هذه المرة. انقل الخلايا المعاد تعليقها في 20 milliliters من sorbitol بتركيز one molar مبرد بالثلج إلى أنبوب falcon سعة 50 milliliters ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي.

بعد عملية طرد مركزي نهائية، أعد تعليق الراسب في 1 mL من السوربيتول بتركيز 1 M المبرد بالثلج ليصل الحجم النهائي إلى حوالي 1.5 mL. يتم تخزين الخلايا المعاد تعليقها في أنابيب طرد مركزي دقيقة على الثلج أو عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين وقت استخدامها في عملية التحول. قبل تحويل البنية الخطية المركزة إلى خلايا PPA المخزنة، قم بتحضير الكواشف والأجهزة التالية.

املأ أنبوب طرد مركزي دقيق بـ 1 mL من السوربيتول بتركيز 1 M وضعه على الثلج. ضع كؤوس التثقيب الكهربائي بحجم 0.2 cm على الثلج.

قم بوضع علامة على أنبوب زجاجي معقم سعة 15 milliliter وجهّز أنبوباً زجاجياً معقماً بجانب الماصة الخاصة بك. انقل 80 microliters من الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية (electro competent cells) التي تم تحضيرها مسبقاً إلى كوب electroporation سعة 0.2 centimeter مبرد بالثلج.

أضف محلول الحمض النووي DNA البلازميدي إلى الخلايا واخلطه بتحريك طرف الماصة من جانب إلى آخر في وعاء التثقيب الكهربائي. احضن الوعاء مع الخلايا على الثلج لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، امسح الجزء الخارجي من الـ vete بالمنديل، ثم قم بصعق الخلايا وفقاً للمعايير الخاصة بخميرة التبرعم كما يقترحها مصنع جهاز التثقيب الكهربائي المستخدم. تم استخدام BioRad gene Pulser في هذا العرض التوضيحي بالظروف التالية: جهد شحن قدره 1500 volts، وسعة كهربائية قدرها 25 micro ferres، ومقاومة قدرها 200 ohms مباشرة بعد الصعق.

أضف 1 mL من السوربيتول بتركيز 1 M المبرد بالثلج إلى الأنبوب. انقل محتويات الأنبوب إلى أنبوب معقم سعة 15 mL باستخدام ماصة زجاجية معقمة. قم بحضن الأنبوب عند درجة حرارة 30 °C بدون رج لمدة 1.5 ساعة.

بعد مرور 1.5 hours، تصبح الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي جاهزة للزراعة. أضف من خمسة إلى 10 خرزات زجاجية معقمة إلى كل طبق من أربعة أطباق YPTS مُصنفة تحتوي على 100 micrograms per milliliter من Zain. قم بفرد 250 microliters من ناتج التثقيب الكهربائي.

امزج المحتويات على كل طبق وقم برج الطبق أفقياً لتوزيع الخلايا بالتساوي. اترك الأطباق لتجف لمدة 15 دقيقة، ثم قم بإزالة الخرز من الـ agro عن طريق قلب الأطباق. غلف الأطباق ببلاستيك أسود لمنع تحلل Zain الحساس للضوء، ثم حضن الأطباق مقلوبة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند درجة حرارة 30 درجة مئوية حتى تتكون المستعمرات.

اختر 12 مستعمرة. قم بتنقيتها عن طريق تخطيط المستعمرات على أطباق YPDS جديدة تحتوي على 100 µg/mL من zein. ولتحضير خلايا PPA للتعبير البروتيني، اختر مستعمرة واحدة من مستعمرات pichia المنقاة وقم بتلقيحها في 25 mL من وسط VMGY في دورق معقم سعة 250 mL، ثم قم بتنميتها عند 30 °C في حاضنة هزازة حتى تصل كثافة المزرعة الضوئية OD 600 إلى قيمة تتراوح بين 2 و6.

عندما تصل الخلايا إلى قيمة OD 600 المناسبة، قم بتحضير مخزون من الغليسرول للخلايا بغرض التخزين. انقل 800 µL من مزرعة الخلايا إلى أنبوب تجميد سعة 2 mL وأضف 200 µL من الغليسرول المعقم. يُحفظ مخزون الغليسرول عند درجة حرارة -80 °C.

بالإضافة إلى ذلك، انقل 1.5 milliliters من المزرعة الخلوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. قم بحصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1300 GS لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احفظ الراسب عند درجة حرارة 4 °C.

ستُستخدم هذه الخلايا لتنقية الحمض النووي (DNA) للخميرة لتحليل شرائط pichia بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات خاصة بالقطعة المُدرجة على هلام الأغاروز للتأكد من دمج الجين المستهدف في جينوم pichia. انقل المتبقي من المزرعة ذات سعة 25 milliliter إلى أنبوب Falcon سعة 50 milliliter واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3000 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اسكب السائل الطافي وضع الأنبوب مقلوباً على منديل ورقي لإزالة أي بقايا من الوسط الغذائي. لغسل كتلة الخلايا المترسبة، أعد تعليقها باستخدام جهاز الفورتيكس أو عن طريق السحب والطرد بالمصّة في 20 milliliters من وسط BMMY ثم قم بإجراء الطرد المركزي.

بعد عملية الصب، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا من السائل الطافي عن طريق الرج الميكانيكي (vortexing) أو السحب والضخ بواسطة الماصة حتى تصل الكثافة الضوئية OD 600 إلى 1.0 في وسط BMMY، وهو الوسط المستخدم لتحفيز التعبير الجيني. انقل المزرعة إلى دورق مُجزأ (baffled flask) سعة لتر واحد وقم بتغطية الدورق بسدادة بيكر سعة 200 ملليلتر.

نوصي بشدة باستخدام الدوارق ذات الحواجز (baffled flasks) لأنها تزيد من كمية الأكسجين في المزرعة. ولضمان التعبير الفعال عن البروتين أثناء الحث بالميثانول، يتم تحضين الدورق في المحضنة لمواصلة النمو عند 30 °C. ومن المهم ألا تتجاوز درجة الحرارة 30 °C في حال كانت درجة حرارة المحضنة لديك متذبذبة.

اضبط درجة الحرارة عند 28 °C. أضف الميثانول النقي المعقم ليصل التركيز النهائي إلى 0.5% methanol كل 24 ساعة للحفاظ على عملية الحث في نقاط زمنية محددة بعد بدء التعبير الجيني، ثم انقل 1 mL من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL وقم بطرده مركزياً عند 1300 Gs لمدة 2.5 دقيقة. وفي درجة حرارة الغرفة، انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 mL.

يُحفظ السائل الطافي ورواسب الخلايا عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى إجراء المزيد من التحليلات. سيتم تحليل العينات المأخوذة من نقاط زمنية مختلفة لتحديد الفترة الزمنية المثلى للتعبير البروتيني بعد الحث. نعرض الآن بعض النتائج النموذجية للتعبير الناجح عن البروتينات المؤتلفة باستخدام PIA Pastis كنظام مضيف.

تظهر صورة لطخة ويسترن هذه أربعة بروتينات تم التعبير عنها بعد 24 ساعة من التعبير. وكان الجسم المضاد المستخدم في اللطخة المناعية هو جسم مضاد acemic HRP. ويمثل المسار الثاني ضابطاً سالباً، حيث تم تحميله بطافي من خلايا لا تعبر عن البروتين المؤتلف لأنها حُولت باستخدام الناقل الأصلي.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية التعبير عن البروتينات المؤتلفة باستخدام المضيف حقيقي النواة PQ.Plus. عند القيام بهذا الإجراء، من المهم إجراء تسلسل لبنائكم الجيني للتأكد من استنساخ الجين المستهدف وبقائه ضمن إطار القراءة الصحيح، وتجهيز جميع الأطباق والكواشف قبل البدء. ومن المهم أيضاً تحضير كمية كافية من البلازميد الخطي للحصول على عدد كبير من الخلايا المحولة قبل التعبير البروتيني عن طريق الحث بالميثانول. تأكد من غسل كعكة الخلايا جيداً لإزالة أي آثار متبقية من الجلسرول التي قد تثبط التعبير البروتيني.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.