تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على أجنة نامية مشتقة من مواقع المبيض (OO sites) التي تم معالجتها في المزرعة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل مواقع المبيض المانحة من أنثى واحدة ومعالجتها حسب الرغبة في المزرعة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحفيز هذه الخلايا على النضج باستخدام البروجسترون، وحقن الإناث المضيفات المحتملات بموجهات الغدد التناسلية (gonadotropin) لتحفيز وضع البيض.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في صبغ الخلايا المانحة بأصباغ حيوية وتجهيز أنثى لتكون هي المضيفة. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي نقل الخلايا المانحة جراحياً إلى تجويف جسم المضيف، وبعد مرور عدة ساعات يتم استعادة البويضات المنقولة وتخصيبها. وفي نهاية المطاف، يتم الحصول على أجنة تنقسم بشكل طبيعي مشتقة من المانح الذي تم التلاعب به تجريبياً.

يمكن الحصول على الخلايا وتحليلها تماماً مثل الأجنة الطبيعية. مرحباً، أنا دوغ هيوستن من جامعة أيوا. نحن هنا اليوم في دورة Cold Spring Harbor Xap لنوضح لكم كيفية تنفيذ إجراء نقل المضيف.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة أدوار نواتج الجينات الأمومية وتحديد أدوارها في مراحل نمو الزيبرفيش (zebrafish) المبكرة. لذا، دعونا نبدأ. قبل البدء في الجراحة، تأكد من تعقيم المنطقة الجراحية وجهز الأوساط الغذائية الطازجة والأدوات المعقمة.

أمسك إبرة الخياطة في حامل الإبر بالاتجاه المطلوب. ضع ضفدعة أنثى مخدّرة على ظهرها فوق منديل جراحي رطب. وباستخدام مقص قزحية صغير، قم بعمل شق بطول 1 cm في الجلد في الجزء السفلي من البطن، جانبيًا بالنسبة للخط الناصف.

تجنب القطع في العضلة البطنية. استخدم الملقط لرفع طبقة العضلة واللفافة المحيطة ذات اللون الأبيض. استخدم مقص القزحية لإجراء قطع واحد سريع ومستقيم عبر العضلة.

قم بتوسيع الشق بمقدار سنتيمتر واحد للكشف عن المبيض. استخدم الملقط للإمساك بالمبيض وسحب أحد الفصوص. استخدم المقص لقص الفص عند مستوى جدار الجسم.

ضع النسيج في طبق بقطر 90 مليمتر يحتوي على وسط استنبات الخلايا البيضية أو OCM، ثم قم بتقييم جودة المبيض فوراً باستخدام مجهر تشريحي. يمكن إزالة عدد قليل من الخلايا البيضية باستخدام الملاقط. إذا كانت الخلايا البيضية متماسكة ومتجانسة في الحجم واللون، فقم بإزالة الكمية المطلوبة من نسيج المبيض من الضفدع وضعها في طبق بتري بقطر 90 مليمتر يحتوي على OCM.

أغلق الشق الجراحي. أدخل الإبرة على بعد بضعة ملليمترات جانبياً من الشق، مع التأكد من مرورها عبر كل من العضلة واللفافة. استخدم الملقط لتوجيه الإبرة، مع الحرص على عدم سحب طرف الخيط بالكامل.

أغلق الجرح باستخدام نمط الغرز المتقطعة البسيطة وعقد الجراح المربعة. تم وصف هذه التقنية بالتفصيل في النص المرفق. كرر عملية الخياطة مع طبقة الجلد.

اشطف الأنثى بالماء منزوع الأيونات وضعها في وعاء استشفاء مملوء بالماء البارد. فور الانتهاء من الجراحة، استخدم المقص لتقسيم المبيض. قم بفتح الفصوص الفردية وبسطها ثم قطعها إلى قطع مربعة بحجم سنتيمترين.

اشطف باستخدام وسط نظيف واستخدم الملاقط. لنقل خمس إلى ست قطع إلى طبق جديد من OCM بقطر 90 مليمتر لعزل الخلايا الفردية. ابدأ بنقل إحدى القطع إلى طبق صغير من الوسط وانقلها إلى مجهر التشريح.

استخدم ملاقط الساعات لنقل من 3 إلى 500 بويضة يدوياً. أمسك بطبقة النسيج الضام المحيطة ببويضة مكتملة النمو في المرحلة السادسة بالقرب من المخزون باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط. أمسك بالمبيض المجاور للبويضة باستخدام الزوج الأول من الملاقط.

اسحب بخفة عبر البويضة لتمزيق طبقة الجريب. استخرج البويضة بعناية من النسيج بنجاح. تتميز البويضات منزوعة الجريب بعدم وجود أوعية دمومية مرئية وتكون أكثر ليونة من البويضات ذات الجريبات السليمة.

استخدم ماصة مصقولة بالنار ومسدودة بقطنة لنقل مجموعات تتراوح بين 100 و150 خلية إلى أطباق زراعة بحجم 60 مليمتر تحتوي على ثمانية مليلتر من OCM. تُحفظ البويضات في أطباقها عند درجة حرارة 18 درجة مئوية. يمكن الآن حقن البويضات مجهرياً حسب الرغبة باستخدام oligonucleotides مضادة للمسنى أو mRNAs وفقاً لأي عدد من البروتوكولات، ثم تُزرع في OCM داخل حاضنة عند درجة حرارة 18 درجة مئوية.

استخدم البويضات للنقل في غضون 96 ساعة من العزل في المساء السابق لإجراء عملية النقل. قم بتحضين الخلايا المطلوبة مع البروجسترون لإنضاجها عن طريق إضافة 16 µL من البروجسترون بتركيز 1 mM إلى الوسط المحتوي على الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2 µM. يتم التحضين لمدة تتراوح من 10 إلى 12 ساعة عند درجة حرارة 18 °C في المساء نفسه، ثم يتم حقن ثلاث إلى خمس إناث بـ 1000 وحدة من هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية لكل ضفدع لتحفيز وضع البيض.

اترك الإناث في درجة حرارة الغرفة أو عند 18 درجة Celsius طوال الليل في صباح يوم النقل. افحص العينات تحت المجهر التشريحي للتأكد من أن الخلايا المستنبتة قد خضعت للنضج. أضف الصبغات الحيوية ثم قم بالتدوير بسرعة تزيد عن 10,000 Gs لمدة خمس دقائق.

لتقليل الخلفية الناتجة عن الحطام، أضف 80 µL من الصبغة الحيوية المناسبة إلى كل مجموعة تجريبية من الخلايا البيضية. تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على هزاز. انقل البيض المصبوغ إلى طبق قطر 90 mm يحتوي على o cm طازج وقم بتحريكه لفترة وجيزة لغسله.

قم بصنع ماصة لاستخدامها في نقل الخلايا. استخدم قلم الماس لخدش الماصة على بعد حوالي سنتيمترين أسفل الجزء المستدق ثم اكسرها بدقة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء ماصة بقطر تجويف يبلغ 1.5 مليمتر، وهو حجم كافٍ لاستيعاب بويضة واحدة.

قم بصقل الطرف حتى تصبح الحواف ناعمة دون إغلاق الطرف. نقل البويضات. يجب إجراء الجراحة بأسرع وقت ممكن.

أجرِ شقاً جراحياً كما سبق في أنثى مخدّرة تضع بيوضاً ذات جودة عالية. يجب أن يكون هذا الشق بالحد الأدنى من الطول المطلوب ليتناسب بدقة مع قطر أداة النقل. استخدم الماصة لسحب أقل من واحد سنتيمتر.

قم بتدوير طبق البويضات التجريبية لجمعها في مركز الطبق. استخدم ماصة باستور المُعدة لسحب أكبر عدد ممكن منها. اترك البويضات تستقر في نهاية الماصة لتقليل كمية السائل التي سيتم نقلها إلى الضفدع.

استخدم الملقط للإمساك برفق ورفع إحدى سدائل العضلة واللفافة. أدخل طرف الماصة في الشق واسمح للبويضات بالتدفق ببطء إلى تجويف الجسم. كرر هذه العملية حتى يتم نقل جميع البويضات.

لا تترك طبقة العضلات مفتوحة لمنع تسرب الخلايا البيضية من الشق. استخدم الملقط للإمساك بكلا جانبي الشق وتقريبهما من بعضهما، مما يسمح للخلايا بالاستقرار في تجويف الجسم. ابدأ بخياطة طبقة العضلات واللفافة كما سبق، مع الحرص على الحفاظ على شدّ للأعلى حتى يتم ربط العقدة الأولى.

قم بخياطة الجلد. اشطف الضفدعة بالماء منزوع الأيونات واتركها لتتعافى كما في السابق. يجب أن تبدأ الضفدعة في وضع البيض بشكل طبيعي بعد العملية، وذلك بعد مرور ساعتين إلى ثلاث ساعات من الجراحة.

استخلص البويضات عن طريق العصر المعتاد كل نصف ساعة حتى تتوقف الأنثى عن وضع البويضات في طبق تجميع البويضات. أضف 4 mL من معلق حيوانات منوية تم جمعها حديثاً في 1X MMR واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق. اغمر البويضات واشطفها جيداً باستخدام محلول في درجة حرارة الغرفة.

تُحضن نقطة واحدة من XMMR في درجة حرارة الغرفة للسماح بالتنشيط والانشطار. يمكن استخدام السيستين في أي وقت لإزالة أغلفة الهلام. بعد ذلك، يمكن فرز الأجنة المنقولة في أطباق منفصلة بناءً على اللون واستزراعها كأجنة طبيعية.

عادةً ما يتم تنشيط أكثر من ثلثي البويضات المنقولة في غضون دقائق من الإخصاب، حيث تظهر انقباضات قشرية قوية عند القطب الحيواني. وفي معظم التجارب، تخضع أكثر من نصف البويضات المنقولة للانقسام الأول بشكل طبيعي. وفي بعض الأحيان، يتأخر الانقسام لمدة 20 دقيقة تقريبًا مقارنةً ببويضات المضيف المستخدمة في تجاربنا.

تستمر نسبة 30 إلى 60% من الأجنة المنقولة في الوصول إلى مرحلة المعي البدائي (gastrulation) بشكل طبيعي، وستبقى على قيد الحياة بعد المرحلة العصبية. ستحتفظ الأجنة المنقولة بلون الصبغة الحيوية طوال أيام عديدة من التطور. وستظهر الأجنة المشتقة من الخلايا الضابطة غير المحقونة بشكل طبيعي كما هو متوقع.

على النقيض من ذلك، فإن الأجنة المشتقة من الخلايا البيضية التي حُقنت بـ beta catenine وأوليغونوكليوتيدات مضادة للمعنى، على سبيل المثال، ستظهر بمظهر مركزي. لقد استعرضنا للتو كيفية الحصول على أجنة من خلايا بيضية تم التعامل معها في المزرعة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم البدء ببويضات متبرع سليمة وبالغة تماماً، واستخدام إناث مضيفة ذات بويضات عالية الجودة. كما يميل نجاح هذه الطريقة إلى الارتباط بالسرعة التي يتم بها عزل البويضات وإجراء العمليات الجراحية؛ لذا قد يتطلب الأمر بعض التدريب قبل الحصول على نتائج متسقة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.