تطبيق أساليب حركية متوقف تدفق بالتحقيق في آلية عمل لإصلاح الحمض النووي من البروتين

هذا عرض لطريقتين من طرق التدفق المتوقف لقياس حركية التفاعل لبروتين Msh2-Msh6، وهو بروتين لإصلاح عدم التطابق في الحمض النووي DNA. يقوم Msh2-Msh6 بالتعرف على عدم تطابق أزواج القواعد في DNA وإعطاء إشارة للإصلاح في تفاعل يتم تحفيزه بواسطة ATP. تقيس الطريقة الأولى ارتباط Msh2-Msh6 بـ DNA من خلال الزيادة في فلورة قاعدة 2-aminopurine الموجودة بجوار زوج GT غير متطابق في DNA. يتم خلط المتفاعلات في جهاز التدفق المتوقف ومراقبتها بمرور الوقت لتحديد ثابت المعدل.

تقيس الطريقة الثانية نشاط Msh2-Msh6 ATPase باستخدام بروتين مراسل فلوري رابط للفوسفات. تُخلط المتفاعلات في جهاز التدفق المتوقف ويتم رصدها بمرور الوقت. ولتحديد ثوابت معدل تحلل ATP وتحرير الفوسفات، تُستخدم البيانات الحركية الناتجة لتوضيح آلية عمل Msh2-Msh6 في إصلاح عدم تطابق الحمض النووي (DNA).

مرحباً، أنا نوح بيرو من مختبر MONI في قسم البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية بجامعة ويسليان. وأنا دي جي جيه، أيضاً من مختبر Man في جامعة ويسليان. وأنا كريس ديسيت، أيضاً من مختبر JI.

سنعرض لكم اليوم مقايسين يعتمدان على الفلورة لمراقبة حركية التفاعل في المقياس الزمني للميلي ثانية. نحن نستخدم هذه الطرق في مختبرنا لدراسة كيفية ارتباط بروتين إصلاح DNA المسمى MutSα الأزواج القاعدية غير المتطابقة في DNA وبدء عملية الإصلاح. لذا، لنبدأ.

قبل البدء بهذا الإجراء، يجب توفير كواشف البروتين والحمض النووي (DNA) المطلوبة. يتم الحصول على بروتين s visier mush two mush six الذي تم التعبير عنه مسبقاً بشكل مفرط في بكتيريا coli وتنقيته بواسطة كروماتوغرافيا التبادل الأيوني والكروماتوغرافيا التقاربية. ولتجهيز كواشف DNA، يتم شراء DNA مفرد السلسلة، معدل بنظير النوكليوتيد الفلوري 2-amino purine، ثم تُنقى السلاسل عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد الممسخ، وتُدمج لتوليد DNA مزدوج السلسلة غير متطابق يحتوي على جزيئين من 2-amino purine مجاورين لعدم تطابق GT.

وبالمثل، قم بتحضير DNA غير مُعلم من DNA أحادي الخيط غير مُعدل. يمكن العثور على تسلسلات DNA المستخدمة هنا في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول. طوال هذا الإجراء، تأكد من الحفاظ على سلامة تجريبية عالية باستخدام مواد كيميائية عالية الجودة لتقليل الشوائب الفلورية.

قم أيضاً بترشيح جميع المحاليل المخزنة عبر غشاء بمسامية 0.2 ميكرومتر لإزالة الجسيمات التي قد تتسبب في انسداد جهاز التدفق المتوقف. وللتجهيز لتجارب ارتباط DNA، قم بتحضير العينات بحجم نهائي قدره 400 ميكرولتر لكل عينة، وهي كمية كافية لحوالي 10 تتبعات حركية. احفظ العينات على الثلج.

للحفاظ على نشاط البروتين، قم بتحضير عينة DNA بتركيز 0.12 micromolar وعينة mush two mush six بتركيز 0.8 micromolar في محلول منظم لربط DNA. سينتج عن ذلك تراكيز نهائية تبلغ 0.06 micromolar لـ DNA و0.4 micromolar لـ mush. Two M six بعد الخلط بنسبة واحد إلى واحد في جهاز التدفق الموقوف.

يستخدم جهاز التدفق المتوقف محرك دفع لدفع المحاليل المتفاعلة بشكل متزامن وسريع من محاقن الدفع إلى جهاز خلط. بعد ذلك، يتدفق المحلول المختلط إلى خلية رصد لجمع البيانات. ولتجهيز الجهاز، تأكد أولاً من إيقاف تشغيل الكمبيوتر ووحدة التحكم.

ثم قم بتشغيل حمام الماء الدوار لتبريد المصباح، وقم بإشعال المصباح. اضبط المونوكروماتور على طول موجة الإثارة المطلوب، وهو 315 nanometers. بالنسبة لـ two amino purine، اضبط عرض الشق (SL width) على القيمة المطلوبة.

ضع مرشحاً بحد قطع 350 nanometer عند أنبوب المضاعف الضوئي أو PMT لجمع إشارة الفلورة لثنائي أمينو البيورين. قم بتشغيل وحدة التحكم والكمبيوتر. بعد ذلك، قم بتشغيل حمام الماء الدوار.

يؤدي ذلك إلى ملء الغلاف المائي المحيط بمحاقن الدفع للحفاظ على تفاعل درجة الحرارة المطلوبة أثناء التجربة. وأخيراً، قم بتنفيذ برنامج إيقاف التدفق (stop flow) من قائمة التحكم في P-M-T-H-V. اضبط جهد PMT، والذي يمكن تغييره في البداية لضبط حساسية PMT، ولكن يجب الحفاظ عليه ثابتاً.

خلال التجربة، قم بقياس التيار المظلم لتصحيح ضوضاء الخلفية الكهربائية. بعد ذلك، اغسل محاقن دفع التدفق الموقوف وخلية الملاحظة. اضبط صمام تحميل العينة على وضع التحميل.

املأ محقنة سعة 1 mL بماء منزوع الأيونات ومفلتر. قم بتوصيل المحقنة بمنفذ التحميل الموجود أسفل محقنة الدفع وادفع الماء بين المحقنتين. كرر هذه العملية مرتين لكل منهما.

المحقنة الدافعة التي ستُستخدم في التجربة. ثم املأ المحاقن الدافعة بالماء لغسل خلية الرصد. قم بتحويل صمام تحميل العينة إلى وضع الإطلاق.

استخدم أمر ضبط محرك السرنجة لخفض لوحة المحرك ودفع الماء عبر خلية الرصد وصولاً إلى خط الخروج. احذر من دفع المكبس إلى نهاية محرك السرنجة تماماً. وأخيراً، ارفع لوحة المحرك وحوّل الصمام إلى وضع التحميل.

اغسل مرة واحدة باستخدام محلول التفاعل المنظم وقم بتفريغ المحاقن. لبدء تجارب ربط الـ DNA، انقل كل عينة من الأنبوب إلى محقنة جديدة سعة 1 mL. قم بتوصيل كل محقنة بمنفذ التحميل وادفع المحلول إلى محقنة الدفع.

قم بإزالة أي فقاعات هوائية عن طريق دفع المحلول يدويًا بين المحقنتين مع التوقف على فترات متقطعة. بعد ذلك، اخفض لوحة التشغيل حتى تلامس الجزء العلوي من محقنات التشغيل. ولجمع البيانات، افتح نافذة قنوات الوقت المحددة.

حدد وضع قناة جمع البيانات لتحليل البيانات، وعدد التتبعات المراد جمعها. أدخل وقت جمع البيانات الذي سيتم خلاله جمع 1000 نقطة بيانات. بعد ذلك، اضبط الصمام على وضع الإطلاق (fire position) وانقر فوق زر جمع البيانات.

يبدأ هذا الإجراء بخلط المادة الرغوية الثانية والمادة الرغوية السادسة مع DNA، يليه دخول التفاعل إلى وحدة المراقبة. يتم رصد الانبعاث الفلوري الخلوي من 2-amino purine طوال فترة التجربة. اجمع ما لا يقل عن خمسة تتبعات حركية للحصول على مجموعة بيانات عالية الجودة، واحفظ الملف عند اكتمال التجربة.

افتح كل ملف بيانات واحسب متوسط الآثار الحركية المتعددة. ثم احفظ ملف البيانات المتوسط وقم بتصديره إلى برنامج رسم بياني لإجراء التحليل. وأخيراً، أطفئ المصباح، واغسل المحاقن وخلية الملاحظة جيداً بالماء.

ثم قم بإيقاف تشغيل بقية المعدات باستثناء حمام الماء الدوار، حيث يُترك يعمل لمدة 15 دقيقة إضافية لتبريد المصباح. ومن الأفضل تمثيل البيانات الحركية لارتباط mush two mush six بالـ DNA غير المتطابق باستخدام دالة أسية واحدة، والتي تعطي معدل ارتباط سريع في حدود 10⁷ لكل مولار في الثانية، بينما تعطي تجارب التدفق المتوقف (stopped flow) المماثلة معدل تفكك معقد mush two mush six والـ DNA غير المتطابق، والذي يحدث ببطء شديد بمعدل يتراوح بين 0.01 إلى 0.02 في الثانية.

توفر هذه النتائج قياساً مباشراً للسرعة والألفة التي يرتبط بها mush two mush six بزوج قاعدي غير متطابق أثناء تفاعل إصلاح DNA. بعد ذلك، سيتم إجراء تجربة التدفق المتوقف لقياس نشاط A TPa لـ mush two mush six.

فيما يتعلق بظروف الحالة قبل المستقرة لهذا المقايسة، من الضروري للغاية تجنب استخدام الزجاج في جميع مراحل تحضير الكواشف، بما في ذلك تنقية البروتين وDNA، وذلك لتقليل مستويات الفوسفات في الخلفية. يُستخدم بروتين ربط الفوسفات أو PBP، الذي تم تنقيته من e coli ووسمه بفلورو فور MDCC، ككاشف لقياس تحرر الفوسفات عقب التحلل المائي لـ TP. ويعد M-D-C-C-P-B-P كاشفاً قوياً لحركية التحلل المائي لـ A TP وتحرر الفوسفات في الحالة قبل المستقرة؛ حيث يرتبط بالفوسفات بسرعة وبألفة عالية، مما يؤدي إلى زيادة كبيرة في فلورية MDCC.

قم بتحضير عينة تحتوي على 4 µM من mush، و2 mush 6 protein مع أو بدون 6 µM من DNA غير متطابق. قم بتحضير عينة أخرى تحتوي على 1 mM من HEP المذاب حديثاً و20 µM من M-D-C-C-P-V-P لإزالة أي فوسفات ملوث. أضف purine وnucleoside وphosphorylase وseven methyl guine إلى العينات، ثم قم بحضنها على الثلج لمدة 20 دقيقة على الأقل.

قم بتجهيز جهاز التدفق المتوقف (stopped flow) كما وُصف سابقاً. بالإضافة إلى ذلك، قم بإزالة أي ملوثات فوسفاتية من محاقن الدفع باستخدام البيورين والنوكليوزيد والفوسفوريل وسبعة ميثيل غوانين. قم بالتحضين لمدة 20 دقيقة. اضبط الطول الموجي للإثارة عند 425 nanometers واستخدم مرشح قطع 450 nanometer مع أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) للكشف عن فلورة M-D-C-C-P-B-P.

املأ محاقن الدفع بالعينات كما وصفنا سابقاً. اضبط معايير جمع البيانات وانقر على "جمع البيانات" (collect data) لخلط mush two mush six مع TP و M-D-C-C-P-B-P لمراقبة تحرر الفوسفات بواسطة mush two mush six والزيادة المقترنة في فلورة M-D-C-C-P-P-P بمرور الوقت. اجمع خمسة آثار حركية (kinetic traces) على الأقل للحصول على مجموعة بيانات عالية الجودة واحفظ الملف، ثم قم بحساب متوسط عدة آثار حركية وصدر ملف البيانات للتحليل كما وصفنا سابقاً. قم بإعداد منحنى معايرة لتحديد العلاقة الخطية بين تركيز الفوسفات وفلورة M-D-C-C-P-P-P؛ أولاً، اخلط M-D-C-C-P-P-P مع تركيزات مختلفة من الفوسفات تحت نفس الظروف التجريبية في جهاز التدفق المتوقف (stopped flow).

ثم قم برسم العلاقة بين أقصى فلورة لمركب M-D-C-C-P-P-P مقابل كل تركيز للفوسفات لمنحنى المعايرة، واستخدم الميل لتحديد تركيز الفوسفات في تفاعلات mush two mush six. ارسم تركيز الفوسفات مقابل الزمن وقم بمطابقة البيانات مع دالة أسية ودالة خطية. تصف هذه الدالة اندفاعاً من تحلل A TP وإطلاق الفوسفات في مرحلة ما قبل الحالة المستقرة، تليها المرحلة الخطية للحالة المستقرة للتفاعل. تظهر البيانات الحركية أن mush two mush six يحلل A TP ويطلق الفوسفات بسرعة تصل إلى 1.4 per second في أول دورة تحفيزية.

يتبع ذلك خطوة بطيئة في التفاعل تحد من عمليات التحول اللاحقة إلى حالة ثابتة من الثابت الحفزي، والتي تكون أبطأ بسبعة أضعاف وبقيمة 0.2 في الثانية. ومع ذلك، عندما يرتبط mush to mush six بالـ DNA غير المتطابق، يتم تثبيط اندفاع تحلل ATP وتحرر الفوسفات. وتظهر هذه النتائج بشكل مباشر أنه عند الارتباط بزوج قاعدي غير متطابق وDNA، ينتقل mush to mush six إلى حالة مرتبطة بـ ATP.

يعد هذا التحول خطوة حاسمة في تفاعل إصلاح DNA. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية استخدام جهاز التدفق المتوقف (stop flow) لقياس حركية التفاعل في الوقت الفعلي. وقد ساهمت هذه القياسات في تعزيز فهمنا لآلية عمل MASH two وMASH six وعملية إصلاح عدم تطابق DNA.

عند إجراء هذا النوع من التجارب، من المهم تذكر استخدام عوامل ذات جودة عالية، بما في ذلك DNA وبروتينات عالية النقاء، وتوخي الحذر الشديد لتجنب تلوث الفوسفات في مقايسة ATPs. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.