الميكروسكوب الضوئي مبعثر استنادا فلاتر غابور ثنائي الأبعاد
يونيو 2, 2010
نظهر طريقة المجهر داكنة ميدانية على غابور مثل تصفية لقياس ديناميكية التحت خلوية داخل الخلايا الحية واحد. تقنية حساسة للتغيرات في بنية العضيات ، مثل تجزئة الميتوكوندريا.
في هذا الفيديو ، يتم استخدام الفحص المجهري المبعثر البصري لتحديد تجزئة الميتوكوندريا أثناء موت الخلايا المبرمج. على الرغم من أن الفحص المجهري البصري للتبعثر لا يتطلب عادة التألق في هذا البروتوكول ، إلا أنه سيتم الحصول على صور الفلورسنت لأغراض التحقق من الصحة. بعد إعداد نظام التصوير ، يتم تصنيف الخلايا بجهاز تعقب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا باللون الأخضر ومعالجتها باستخدام سبورين ستور للحث على موت الخلايا المبرمج.
يتم الحصول على البيانات البصرية للكشف عن التغيرات في اتجاه العضيات الخلوية في غضون ساعتين. يمكن قياس بداية تجزئة الميتوكوندريا باستخدام البيانات المتناثرة البصرية ، والتي تظهر انخفاضا في درجة اتجاه الجسيمات تحت الخلوية. ثم يتم التحقق من صحة البيانات عن طريق ربط البيانات المتناثرة البصرية بمناطق الفلورسنت التي تحتوي على الميتوكوندريا.
مرحبا ، أنا ندى بستاني من مختبر البصريات الحيوية في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة روتجرز. أنا روب باك من مختبر البصريات الحيوية ، وأنا دين أيضا من Bio Lab. سنعرض لك اليوم إجراء لقياس الديناميكيات المورفولوجية تحت الخلوية باستخدام طريقة لا تعتمد على الأصباغ الفلورية.
نستخدم هذه التقنية في مختبرنا لدراسة التغيرات الديناميكية في البنية الخلوية أثناء موت الخلايا المبرمج أو موت الخلايا المبرمج. لذلك دعونا نبدأ. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تعقيم الأيدي التي ترتدي القفازات بنسبة 70٪ من الإيثانول.
ثم ضع محلول مخزون مولاري 100 نانو محضر من وسط زراعة خلايا miot الأخضر والدافئ في غطاء المحرك مع إطفاء الضوء وتعقيم جميع الأسطح. بعد ذلك ، ضع طبقا مزرعيا بستة آبار مع خلايا مطلية على غطاء زجاجي تحت الغطاء. باستخدام ماصة معجون متصلة بخط تفريغ.
قم بإزالة وسط الخلية من الآبار. ثم أضف على الفور ملليلترين من الوسط المسمى إلى كل بئر لتسمية الخلايا. الميتوكوندريا. قم بتغطية لوحة زراعة الأنسجة لمنع التعرض لضوء الغرفة المباشر وإعادة الخلايا بسرعة إلى الحاضنة.
احتضن لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء احتضان الخلايا. قم بإعداد الإعداد البصري أولا بتشغيل مشبك القوس الزئبقي. ثم قم بتشغيل كاميرات مجهر الكمبيوتر وقابس الليزر في جهاز المرآة الرقمية الصغيرة أو DMD في الناشر الدوار.
بعد ذلك ، انظر من خلال عدسة المجهر لمعرفة ما إذا كان الإطلاق البصري محاذاة. يجب أن يكون مجال الرؤية مضاء بشكل ساطع بواسطة ضوء الليزر. لتحميل العينة ، ضع قطرة أو قطرتين صغيرتين من زيت الغمر فوق هدف غمر الزيت 63 × أثناء وجوده على طول الطريق.
ثم على المسرح ، قم بتركيب شريحة تتكون من شبكة من الخطوط على فترات منتظمة تبلغ 10 ميكرومتر تسمى الترادي ، وارفع الهدف بحيث يمسك الزيت بتركيزه. بعد ذلك ، ركز الحافة السداسية لمجال المكثف. توقف بحيث يتم محاذاة الإضاءة المركزية كوهلر.
يجب أن تكون الحافة السداسية متمركزة في العدسة ومركزة بشكل حاد. ثم باستخدام مقابض موضع إيقاف مجال المكثف ، حقل المكثف ، توقف فوق مجال الرؤية. ابدأ تشغيل مختبر IP وأدخل الإعدادات لتشغيل الكاميرا.
تأكد من ضبط الكاميرا على وضع نقل الإطار. قم بتشغيل الأمر acquire focus لبدء المعاينة المباشرة. ثم قم بتعيين بادئة الفهرس وموقع الملف الذي سيتم حفظ الصور فيه.
بعد ذلك ، ابدأ صورة RS. قم بتعيين الإعدادات لتشغيل الكاميرا المفاجئة الرائعة. يجب ضبط وضع الساعة على الوضع الطبيعي.
ابدأ تشغيل برنامج DMD. ضع قزحية الحقل المظلم في قائمة البرنامج النصي. ثم انقر فوق تحميل وإعادة تعيين.
لتشغيل البرنامج النصي يدويا، قم بتعيين شريط المجهر optiv في إطار العرض على LSM. سيؤدي هذا إلى إرسال الصورة من خلال DMD في البصريات المحاذاة. عرض صورة المجال المظلم على CCD لكاميرا Cascade five 12.
يجب أن تظهر صورة الحقل المظلم في المعاينة المباشرة في مختبر IP. إذا لزم الأمر، ركز الصورة على المعاينة المباشرة. اضبط وقت التعريض الضوئي عاليا بما يكفي لضمان ما لا يقل عن 10,000 عدد من الإشارة في الصورة.
ثم التقط لقطة لمجال الرؤية باستخدام الأمر الحصول على واحد بعد الاستحواذ. استخدم الأمر save as indexed لحفظ الصورة على القرص. تقيس صورة GTI حجم مجال الرؤية.
الآن انقل عينة GTI بحيث تكون خارج مجال الرؤية وتكون الخلفية فقط مرئية. التقط صورة خلفية للحقل مع وقت تعريض كاف للحصول على 5,000 عدد على الأقل. ستساعد هذه الصورة في طرح خلفية الصور غير المصفاة.
الآن للحصول على صور Gabor التي تمت تصفيتها للخلفية ، قم بتحميل البرنامج النصي Gabor Filter Bank إلى برنامج التحكم DMD. قم بتشغيل البرنامج النصي بالكامل لتخزين عوامل التصفية مؤقتا إلى الذاكرة المدمجة ل DMD. قد يستغرق هذا بضع دقائق بمجرد تخزين البرنامج النصي بالكامل.
استخدم علامات البدء والإيقاف داخل برنامج DMD للتأكد من تحميل مجموعة واحدة فقط من المرشحات التي تتوافق مع مرشح Gabor Like واحد في كل مرة. قم بتشغيل البرنامج النصي للحصول على صور تمت تصفيتها للخلفية. يجب أن تتغير معاينة الصورة الحية من الحقل المظلم إلى الصورة التي تمت تصفيتها.
بالنسبة لعامل التصفية هذا، افتح البرنامج النصي للاكتساب في مختبر IP من القرص. اضبط وقت التعرض لضمان الحصول على 2000 عدد على الأقل. أثناء تشغيل البرنامج النصي DMD، قم بإلغاء المعاينة المباشرة في مختبر IP وقم بتشغيل البرنامج النصي للاكتساب.
سيؤدي هذا تلقائيا إلى الحصول على الفهرس وحفظ الصورة التي تمت تصفيتها على القرص. بمجرد الحصول على الصورة الأولى ، أوقف تشغيل البرنامج النصي في DMD. احذف الأوامر المستخدمة من البرنامج النصي.
ثم استبدل علامتي البدء والإيقاف في بداية ونهاية مجموعة المرشحات التالية. كرر عملية الاستحواذ في مختبر IP حتى يتم استخدام بنك التصفية بالكامل ويتم الحصول على جميع الصور التي تمت تصفيتها وحفظها. استعد لطلاء الخلايا عن طريق توصيل مكواة لحام على سطح المختبر وتسخين L 15 متوسطا إلى 37 درجة مئوية.
اصنع محطة عمل بمنشفة ورقية ومنديل كيم لامتصاص أي وسط متسرب وللحفاظ على نظافة المنطقة. قم بإعداد عدة فتائل عن طريق تمزيق مناديل الكيم وتدويرها. سيتم استخدام الفتائل لسحب السائل عبر لوحة الخلية.
بعد ذلك ، استخدم حامل العينة المعدنية لإنشاء شطيرة خلية. استخدم حقنة لتطبيق حبة رقيقة من الشحوم المفرغة حول المحيط العلوي للفتحة في الصفيحة المعدنية المشكلة ، وتمتد في منتصف الطريق تقريبا إلى نهايات الأخاديد على كل جانب. مرر برفق غطاء نظيف رقم واحد على الشحوم.
اقلب الطبق وضع الشحوم حول الفتحة. أطفئ أضواء الغرفة مرتديا قفازات الامتحان التجريبي NI المعقمة بالإيثانول. استرجع الخلايا من الحاضنة.
قم بإزالة زلة الغطاء التي سيتم استخدامها للتجربة من لوحة الآبار الستة. جفف زلة الغطاء بعناية. ثم اضغط على جانب خلية انزلاق الغطاء لأسفل في الصفيحة المعدنية المدهونة بالزبدة فوق فتحة العرض.
شطيرة الخلايا داخل اللوحة. تأكد من عدم وجود فجوات هوائية ، وأن الشحوم قد شكلت ختما مانعا لتسرب الماء بحيث يمكن تحميل الوسيط. الآن اقلب اللوحة مرة أخرى فوق سحب 200 ميكرولتر في المرة الواحدة.
أضف وسط L 15 إلى الساندويتش من خلال الأخدود بين زلة الغطاء العلوي واللوحة المعدنية حتى يصل السائل تقريبا إلى الأخدود على الجانب الآخر. بعد ذلك ، اغسل الخلايا عن طريق الإمساك بفتيل في الأخدود المعاكس وسحب 200 ميكرولتر إضافي من الوسط في الساندويتش. سوف يتدفق الوسيط من جانب إلى آخر حيث يزيل الفتيل الوسط القديم.
احرص على منع تكون أي فقاعات داخل السائل خلال هذه الخطوة. كرر هذه العملية مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام فتيل جديد لكل شطف. الآن اقلب اللوحة مرة أخرى لدعم اللوحة من الحواف لاحتجاز السائل في خزان الخلية.
اغمس مكواة اللحام في دورق اللحام لإذابة بعض النحيل بسرعة ، والذي سيتشبث بعد ذلك بطرف حديد اللحام. باستخدام طرف مكواة اللحام ، ضع وعاء طرح الريش بعناية حول حواف زلة الغطاء السفلي. استمر في الغمس والتطبيق على طول محيط انزلاق الغطاء ، وإغلاقه باللوحة المعدنية.
هذا يخلق ختما ميكانيكيا جيدا حتى لا ينفصل انزلاق الغطاء عن اللوحة أثناء عرضها. نظف أي بقايا من القاع. قم بتغطية سطح الانزلاق عن طريق رفع مناديل كيم وتنظيف الغطاء.
انزلق بحركة انزلاقية واحدة للتأكد من أن انزلاق الغطاء أنظف في المنتصف حيث سيتم عرضه. أعد لوحة الجدران الستة إلى الحاضنة. خذ الخلايا المطلية إلى مختبر البصريات وقم بالتركيب على الهدف.
كما كان من قبل ، ابحث عن حقل من الخلايا ذات المظهر السليم واحصل على صورة مجال داكن لمجال الرؤية. ثم قم بمحاذاة المجهر في DIC وتأكد من أن أوقات التعرض مناسبة. احصل على صورة DIC باستخدام كاميرا متتالية.
في هذا الإعداد ، يتم الحصول على صور الفلورسنت باستخدام كاميرا SNAP الرائعة بينما لا يزال المجهر محاذاة في DIC. اضبط VAR المجهر على x واحد ومنفذ العرض على 100٪ مجهر وقم بتحويل الصورة من العدسة إلى الكاميرا. ضع مؤشر LED أزرق فوق المكثف لإضاءة المجال.
ثم قم بمعاينة مجال الرؤية في صورة RSS واضبط التركيز الدقيق. إذا لزم الأمر ، احصل على صورة DIC واحفظها على القرص. لاحظ كيف يختلف مجال الرؤية عن المجال الذي تم الحصول عليه من الكاميرا المتتالية.
يجب تسجيل هذه الصور أثناء مرحلة تحليل التجربة. بعد ذلك ، حرك مكعب مرشح الفلورسنت إلى موضعه واحصل على صورة مضان عن طريق تشغيل الإثارة الفلورية لفترة وجيزة باستخدام مصراع المجهر ، ثم قم بإيقاف تشغيله بمجرد اكتمال الاستحواذ. لتقليل التبييض الضوئي ، احفظ الصورة الفلورية على القرص.
للحصول على صور تمت تصفيتها ، أعد ضبط المجهر إلى الحقل وأرسل الضوء عبر منفذ LSM. كما كان من قبل ، قم بتشغيل البرنامج النصي لبنك مرشح Gabor بالكامل كما كان من قبل لإكمال الحصول على البيانات لنقطة زمنية واحدة بينما لا تزال الخلايا على المسرح ودون إزعاج مجال الرؤية. استخدم طريقة الفتل لتبديل وسط L 15 العادي لنفسه الذي يحتوي على محلول ميكرومولار واحد من STS.
أثناء التجربة ، أضف وسيطا إضافيا لمنع الجفاف عن طريق سحب الوسيط في أخدود صفيحة الخلية دون إزالته من المسرح أو إزعاج مجال الرؤية. الآن ، كرر هذه الخطوات للنقاط الزمنية اللاحقة حتى تكتمل التجربة. ستتضمن البيانات التي تم جمعها عددا كبيرا من الصور التي تمت تصفيتها والتي يجب معالجتها لاستخراج البيانات الهيكلية تحت الخلوية.
هنا يتم عرض مثالين على تجربة. يوضح هذا الشكل صورا متسلسلة لعينة من الطحالب الدياتومية البحرية. الميزات الموجهة مرئية بوضوح.
في التصوير في المجال المظلم. تظهر الصور التي تمت تصفيتها بصريا المسماة خمسة تساوي صفر درجة إلى خمس درجات متساوية 160 درجة جنبا إلى جنب مع الصورة غير المفلترة للعينة. للمقارنة ، تمت معالجة المجموعة المكونة من تسع صور تمت تصفيتها من Gabor للدياتوم بكسل تلو الآخر لاتجاه الكائن.
عند كل بكسل ، تم تقسيم الإشارة القصوى على متوسط الإشارة كدالة لاتجاه المرشح لإعطاء قيمة نسبة العرض إلى الارتفاع. هنا ، توجد نسبة عرض إلى ارتفاع بالقرب من تلك المشار إليها باللون الأزرق في المناطق التي لا توجد فيها زاوية استجابة مفضلة. تشير القيم الأكبر المشار إليها باللون الأحمر إلى المناطق التي توجد فيها استجابة زاوية مفضلة أعلى.
يتوافق السطوع وأهمية الشفرة لاستجابة مرشاح GABOR الإجمالية ، واتجاه المرشاح ، الذي يعطي الحد الأقصى للإشارة عند كل بكسل مع الاتجاه العمودي على اتجاه الكائن الأساسي. يتم ترميز اتجاه جسيمات البنية التحتية في مخطط جعبة حيث يتفق كل سطر بشكل وثيق مع اتجاه الكائن المحلي الأساسي المرئي في الحقل المظلم غير المصفى. يوضح مخطط الجعبة اتجاه الكائنات ذات شدة الاستجابة التي تزيد عن 10٪ من الحد الأقصى.
احتوت هذه الصور المظلمة والصور التي تمت تصفيتها بصريا لحقل ما على خلايا بطانة بقرية حية ، وتم الحصول على الصور المفلترة لاحقا كل 20 دقيقة لمدة ثلاث ساعات بعد العلاج بمحفز موت الخلايا المبرمج سبورين. هنا ، يتم عرض خريطة نسبة العرض إلى الارتفاع في اللوحة العلوية والتصوير الفلوري للميتوكوندريا في اللوحة السفلية كدالة للوقت. يمثل تدرج اللون درجة الاتجاه ، كما هو الحال قبل أن تقارن هذه المخططات الزمنية الانخفاض في درجة اتجاه نسبة العرض إلى الارتفاع للجسيمات في الخلايا البطانية المعالجة ب s thoro sporin ، وتمثل الآثار الفردية مخططات زمنية داخل الخلايا المفردة.
يقتصر التوجه إلى الهبوط على مناطق الخلايا التي تسجل في مناطق الفلورسنت. الآن ، تم تحقيق التحقق من صحة التألق. يصبح أرشيفيا.
وبالتالي ، في التجارب التالية ، يمكن إجراء قياسات الميتوكوندريا عن طريق حذف خطوات التصوير الفلوري واستخدام طريقة التشتت البصري مباشرة. لقد أوضحنا لك للتو كيفية مراقبة تجزئة الميتوكوندريا أثناء موت الخلايا المبرمج باستخدام توقيعات تشتت الضوء بناء على مرشحات جابور. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن يكون لديك إعداد جيد لنمط الحياة والتأكد من محاذاة الإعداد البصري ومعايرته بشكل جيد.
لذلك دعونا نفهم المشاهدة و CoLab مع تجارب واجهة المستخدم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة طريقة مجهر المجال الداكن التي تستخدم الترشيح الشبيه بجابور لتقييم الديناميات تحت الخلوية في الخلايا الحية. تعتبر هذه التقنية حساسة بشكل خاص للتغيرات في هياكل العضيات، مثل تجزؤ الميتوكوندريا أثناء الاستماتة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات التصوير المجهري
الخلفية
- تجزؤ الميتوكوندريا هو مؤشر رئيسي للاستماتة.
- غالبًا ما تتطلب طرق التصوير المجهري التقليدية الفلورسنتة، مما يحد من تطبيقها.
- يوفر مجهر التشتت البصري بديلاً غير باضع.
- فهم ديناميات العضيات أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى حول صحة الخلية.
غرض الدراسة
- لكمِّية تجزؤ الميتوكوندريا باستخدام مجهر التشتت البصري.
- للتحقق من البيانات البصرية بتقنيات التصوير الفلورسنتي.
- لتعزيز فهم الديناميات تحت الخلوية أثناء الاستماتة.
الطرق المستخدمة
- الخلايا الموسومة بـ MIT tracker الأخضر.
- العلاج باستخدام stor sporin لتحريض الاستماتة.
- اكتساب البيانات البصرية لمراقبة اتجاه العضيات.
- ارتباط البيانات البصرية بالصور الفلورسنتية للتحقق.
النتائج الرئيسية
- يكتشف مجهر التشتت البصري بشكل فعال تجزؤ الميتوكوندريا.
- تظهر البيانات انخفاضًا في اتجاه الجزيئات تحت الخلوية.
- يؤكد التحقق الفلورسنتي دقة القياسات البصرية.
- توفر الطريقة رؤى حول ديناميات العضيات أثناء الاستماتة.
الاستنتاجات
- تعزز طريقة الترشيح الشبيهة بجابور من حساسية مجهر المجال الداكن.
- يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة العمليات الخلوية المختلفة.
- فهم ديناميات الميتوكوندريا ضروري لتطوير استراتيجيات علاجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Optical scatter microscopy using two-dimensional Gabor filters enables label-free quantification of subcellular structural dynamics, such as mitochondrial fragmentation during apoptosis, providing a non-invasive method to assess organelle morphology and function in living cells. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by offering quantitative, reproducible readouts of subcellular changes that correlate with functional outcomes, without reliance on fluorescent labels or complex inverse scattering models. The technique’s compatibility with existing microscopy platforms and rapid screening capability facilitate translational continuity from discovery to preclinical studies, enhancing predictive confidence in pathway modulation and compound screening efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying organelle orientation changes as a functional readout of subcellular stress or death pathways.
- Operational Value: Provides label-free, live-cell compatible measurements that reduce experimental variability and support reproducible target engagement assessments.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking compound-induced morphological changes to apoptotic progression through correlatable optical signatures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative aspect ratio maps from Gabor-filtered images that serve as objective, high-content morphological parameters for compound screening.
- Operational Value: Enables rapid acquisition of filtered images across hundreds of cells without high sampling rates, supporting scalable assay formats.
- Assay Readiness: Outputs are derived directly from the object's field transform, avoiding discretization artifacts and enabling consistent, label-free morphological profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Correlates optical scatter data with fluorescent validation to establish a translatable biomarker of organelle dynamics applicable across model systems.
- Preclinical Utility: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing early, measurable indicators of compound-induced subcellular reorganization.
- Mechanistic Insight: Offers distinctive morphometric parameters that reflect organelle size, shape, and orientation without requiring theoretical scatter models for non-spherical structures.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling label-free assessment of subcellular dynamics from early hypothesis testing through lead optimization, where morphological changes serve as functional proxies for pathway modulation and cellular health.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying organelle orientation shifts linked to apoptosis and differentiation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., aspect ratio, orientation maps) that enable comparison of compound effects across populations.
- Analytics: Provides statistical distributions of morphological parameters that help teams compare conditions and identify significant shifts in subcellular organization.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through correlatable optical and fluorescent signals, supporting biomarker alignment for organelle stress responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability on existing microscopes, reducing dependency on specialized fluorescence infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, label-free measurement of organelle dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via platform-agnostic implementation and minimal sample preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early detection of subcellular changes that precede functional outcomes, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing objective, quantitative morphological data to inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical setup alignment, including laser illumination, DMD programming, and Kohler adjustment for optimal signal acquisition.
- Dependent on instrumentation capable of spatial light modulation (e.g., DMD) and synchronized image acquisition systems for sequential filter-based imaging.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition protocols, exposure times, and filter bank sequencing to ensure data comparability.
- Adaptation across model systems may require optimization of illumination intensity and filter parameters based on subcellular refractive index and scattering properties.
- Practical limitations include sensitivity to out-of-focus light and the need for stable environmental control during long-term live-cell imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:50
Introduction
1:26
Protocol
2:18
Preparing the Optical Setup
6:57
Plating the Cells
5:26
Loading the Filterbank and Using the Setup to Acquire Filtered-Background Images
9:44
Performing Optical Scatter Microscopy
11:53
Representative Images
14:28
Conclusion
![[كنفوكل] مجهرية يكشف خلية مستقبلات سطح التجميع عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الصورة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F57164.jpg%3Fv%3D2026-07-04T02%253A54%253A44.000Z&w=384&q=75)
