Name: الخطية من الفحص البروتين برادفورد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: تعلم إجراء التخطيط الخطي لتحسين دقة وتحسس قياس البروتين باستخدام تقنية برادفورد المُحسّنة. تُقلل هذه الطريقة من تداخل المنظفات وتُحسّن الحساسية عشر مرات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وتكرس هذه الورقة لذكرى الراحل Selinger الدكتور تسفي ، الذي استضاف البحوث الأصلية وصفها هنا.

الخطية للمعايرة برادفورد رسم بياني البروتين : ويستخدم على نطاق واسع الرائعة Coomassie مقايسة البروتين الأزرق ، والمعروفة عموما باسم مقايسة برادفورد 1 ، بسبب البروتوكول الملحق بها سريعة ومريحة وكذلك حساسيته النسبية. للأسف ، هناك درجة كبيرة من انحناء أكثر من مجموعة واسعة من تركيزات البروتين (الشكل 1). لذلك ، يستخدم فقط مجموعة ضيقة من تركيزات عالية نسبيا من البروتين ، 2-10 ملغ / مل جيش صرب البوسنة ، لمعايرة الرسم البياني ، والتي تناسبها ثم أفضل الانحدار الخطي (الشكل 1 ، والأخضر). ومع ذلك ، فإن استقامة يتطلب تركيز البروتين من العينات غير معروف على أنها تقع ضمن نطاق محدود من الرسم البياني المعايرة من أجل تجنب خطأ كبير ، وأنه أيضا يقلل من الدقة في نطاق محدود. واستقامة يمثل مشكلة خطيرة ولا سيما عندما المبالغ ميكروجرام من البروتين ليست متاحة ، وغالبا ما يتطلب الأمر التخفيفات متعددة من العينات غير معروف. كما لوحظ في ورقة برادفورد الأصلي ، "مصدر استقامة هو في حد ذاته منذ كاشف هناك تداخل في طيف من الألوان المختلفة الشكلين للصباغة." 1. في الواقع ، ثلاثة أشكال من الصبغة الزرقاء الرائعة Coomassie في التوازن الحمضي القاعدي في درجة الحموضة الحمضية المعتاد للمقايسة 2. الأشكال الأحمر والأزرق والأخضر وماكسيما الامتصاصية في 470 ، 590 ، 650 نانومتر ، وعلى التوالي (الشكل 2). الأزرق هو الشكل الذي يربط البروتين ، وتشكيل المعقدة التي تمتص الضوء بشكل مكثف في 594 نانومتر 3 و 4 (الشكل 2). برادفورد أشار أيضا إلى أن "قيمة أساسية للكاشف يتناقص باستمرار كما لا بد من صبغ لبروتين" (1) (الشكل 3). لذا ، حاولنا لحساب الحد من الخلفية 590 نانومتر كما يتم إضافة كميات متزايدة من البروتين ، عن طريق قياس التغير في الامتصاصية عند 450 نانومتر ، حيث معقدة البروتين صبغة لا تمتص. وجدنا أن خلفية الانخفاض جزئيا ، ولكن ليس بشكل كامل ، وحسابات للاستقامة (الشكل 4). ثم افترضنا ان هذا الانخفاض في تركيز الصبغة حرة أخرى تنتج تشويه للاستجابة خطية ، لأنه كما البروتين صبغة ملزمة في التوازن 5 ، تشكيل معقدة لا يتوقف فقط على تركيز البروتين الحرة ، ولكن أيضا على أن للصباغة مجانا (الشكل 5). مع الأخذ في الاعتبار كلا من المسائل المتصلة تركيز متغير من الصبغة مجانا ، وضعنا المعادلة الرياضية التي توضح وجود علاقة خطية بين تركيز البروتين ونسبة قياسات الامتصاصية ، 590 نانومتر أكثر من 450 نانومتر (الشكل 6). ويمكن العثور على وصف مفصل للدراسة النظرية والتجريبية في المنشور لدينا 1996 في الكيمياء الحيوية التحليلية 6. تم اختبار تجريبي للمعادلة رياضية ، ووجدت أن تسفر منحنى معايرة خطي على المدى تركيزات بروتين كامل (الشكل 7). وعلاوة على ذلك ، تم التحقق من صحة هذه المعادلة أيضا قرار مستقل من قيمة الرقم الهيدروجيني التي تعتمد على الصحيح من التقاطع العمودي 6. بروتوكول مفصلة لتحسين الفحص البروتين برادفورد ، وذلك باستخدام قارئ امتصاص Microplate : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون 0.1 ملغ / مل من الألبومين القياسية ، المصل البقري. ويمكن اختيار أي معيار آخر ، ولكن الملاحظة التي يجب أن تستخدم نفس المعايير في جميع التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف عينات غير معروفة في المياه منزوع الأيونات. تهدف إلى 5-50 ميكروغرام / مل. حتى الآن ، وتركيزات البروتين أعلى أو أقل من مقبولة ، حيث لا يوجد حد واضح لمجموعة خطية من الفحص. ومع ذلك ، يجب أن يكون القياس ضمن نطاق خطية من القارئ الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع كاشف برادفورد (بيو راد) 2.5 أضعاف في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0 و 10-50 ميكرولتر من محلول المخزون BSA إلى الآبار ثلاث نسخ (0-5 خلق منحنى المعايرة BSA ميكروغرام). تكمل مع الماء منزوع الأيونات لتصل إلى 100 ميكرولتر / أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في آبار مختلفة ، إضافة ميكرولتر من 100 عينة غير معروفة في triplicates. ويمكن استخدام تركيزات مختلفة من عينة غير معروفة لزيادة الدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من كاشف برادفورد المخففة لجميع الآبار. الحجم الكلي هو 200 ميكرولتر / أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار ما لا يقل عن 5 دقائق ، ولكن ليس أكثر من 60 دقيقة من أجل التنمية اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون فارغة 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات (وليس البروتين الصبغة صفر أيضا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية في 590 نانومتر ، وعند 450 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رسم بياني المعايرة عن طريق قسمة صافي القيم الامتصاصية في 590 نانومتر ، وعند 450 نانومتر. علما أن البروتين صفر (صباغة فقط) ينبغي أن تدرج قيمة كنقطة البيانات (الشكل 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيز عينة مجهولة على أساس معادلة خطية من منحنى المعايرة (الشكل 9). </li></ol> ممثل النتائج : خلافا للالامتصاصية في طول موجة واحدة من 590 نانومتر ، ونسبة من القيم الامتصاصية ، 590 نانومتر أكثر من 450 نانومتر ، والخطية ثإيث تركيز بروتين (شكل 10). قد يكون تركيز البروتين من العينة مجهولة تحسب ببساطة باستخدام معادلة خطية من منحنى المعايرة (الشكل رقم 10 ، المعادلة). ومع ذلك ، يتم الحصول على زيادة الدقة عن طريق قياس عدة التخفيفات عينة مجهولة. تحقيقا لهذه الغاية ، وإعداد الرسوم البيانية two. الاول هو رسم بياني لمعايرة مستوى البروتين مع ميكروغرام على المحور X (الشكل رقم 11 ، الحق). الرسم البياني الثاني هو لنموذج غير معروف ، مع ميكرولتر من العينة الأصلي مخفف على المحور X (الشكل رقم 11 ، اليسار). وينبغي أن تدرج قيمة الصبغة فقط في كل من الرسوم البيانية (الشكل رقم 11). مشتق تركيز البروتين من العينة مجهولة بقسمة المنحدرات من عينة مجهولة ومعيار (الشكل رقم 11 ، المعادلة). <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. التقليدية الرسم البياني المعايرة برادفورد. يتم تمثيل مجموعة الرموز الخطية الخضراء. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. الأطياف للمجمع البروتين وصبغ للصباغة وحدها. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. البروتين صبغة التوازن. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="الشكل 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. لحد من الخلفية تصحيح احتساب الانخفاضات جزئيا استقامة. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="الشكل 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 5"> الشكل 5. البروتين صبغة التوازن. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="الشكل 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 6"> الشكل 6. الأساس الرياضي لالخطية للفحص البروتين برادفورد. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="الشكل 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 7"> الشكل 7. الخطية من الرسم البياني المعايرة برادفورد. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="الشكل 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 8"> الشكل 8. حساب القيم نسبة الامتصاصية. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="الشكل 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 9"> الرقم 9. برادفورد والمعايرة الخطي الرسم البياني. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="الشكل 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 10"> الرقم 10. الخطية من الرسم البياني المعايرة برادفورد. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="الشكل 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 11"> الرقم 11. مجهول العينة تركيز الحساب.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

وفحص البروتين برادفورد تحظى بشعبية نظرا لسهولة الأداء والحساسية النسبية. عرضت الخطية على تركيزات بروتين كامل مجموعة التي حصلت عليها بروتوكول هنا يبسط كذلك مقايسة ، والعينات غير معروفة لا تحتاج إلى تدخل ضمن نطاق الرسم البياني المعايرة. الأهم من ذلك أن البروتوكول ينص أيضا على تحسين المزايا التالية عبر بروتوكول برادفورد الأصلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:r...

<table><tbody ><tr ><td >كاشف برادفورد</td ><td >Bio-Rad</td ><td >500-0006</td ><td></td </tr><tr ><td >ألبومين المصل البقري</td ><td >Amersco</td ><td >0332</td ><td></td </tr><tr ><td >قارئ الامتصاصية متعدد اللوحات</td ><td >BioTek</td ><td >Synergy2</td ><td></td </tr></tbody></table>

الخطية من الفحص البروتين برادفورد

Linearization of the Bradford Protein Assay

ويتم إنجاز تقرير كميات من البروتين ميكروغرام في مقايسة Coomassie برادفورد الزرقاء الرائعة التي كتبها قياس الامتصاصية في 590 نانومتر. هذا الاختبار الأكثر شيوعا وبسيطة تمكن السريع الكمي البروتين في الخلية lysates ، الكسور الخلوية ، أو عينات البروتين المؤتلف ، لغرض التطبيع القياسات البيوكيميائية. ومع ذلك ، واستقامة تنازلات جوهرية لحساسية ودقة هذه الطريقة. وتبين أنه في ظل ظروف الفحص القياسية ، فإن نسبة من قياسات الامتصاصية في 590 نانومتر و 450 نانومتر خطي صارم مع تركيز البروتين. هذا الإجراء البسيط يزيد من دقة ويحسن من حساسية مقايسة حول الكمي ، 10 أضعاف السماح باستمرار إلى 50 نانوغرام من ألبومين المصل البقري. علاوة على ذلك ، تقلص إلى حد كبير التدخل قدم عادة بواسطة المنظفات المستخدمة لإنشاء خلية lysates البروتوكول الجديد. معادلة خطية وضعت على أساس العمل الجماعي وقانون بير يناسب تماما على البيانات التجريبية.

هو خطر على دقة وحساسية من بروتين تقرير الفحص برادفورد سريعة ومريحة من خلال استقامة الذاتية. نظهر الخطية إجراء بسيط هو أن يزيد كثيرا من الدقة ، ويحسن من حساسية مقايسة حول أضعاف - 10 ، ويخفف كثيرا تدخل المنظفات.

يتم تحديد كميات الميكروجرام من البروتين في مقايسة برادفورد باستخدام صبغة كوماسي بريليانت بلو (Coomassie brilliant blue) عن طريق قياس الامتصاصية عند طول موجي 590 نانومتر.

يبدأ مقايسة برادفورد للبروتين بإضافة معيار BSA بكميات متزايدة وتخفيفات من عينة مجهولة إلى لوحة ذات 96 بئراً، حيث يُضاف الماء منزوع الأيونات لاستكمال الحجم المتغير. بعد ذلك، يُضاف كاشف برادفورد إلى جميع الآبار باستثناء البئر الفارغ، والذي يجب أن يحتوي على الماء. بعد مرور خمس دقائق، تُقاس الامتصاصية عند 590 نانومتر للكشف عن معقد صبغة البروتين، وعند 450 نانومتر.لتحقيق خطية في الرسم البياني، تكون نسبة قيم الامتصاصية عند 590 نانومتر وعند 450 نانومتر خطية تماماً مع كمية البروتين. مرحباً، أنا من قسم الكيمياء الحيوية في جامعة تل أبيب في إسرائيل، أنا أو آر تي من المختبر. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحديد تركيز البروتين باستخدام بروتوكول برادفورد الخطي المُحسّن.نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتوحيد كمية البروتين في SZaS، على سبيل المثال، قبل تحميل الهلامات. لذا، لنبدأ. في مقايسة برادفورد، توجد ثلاثة أشكال من صبغة كوماسي بريليانت بلو في حالة توازن قاعدي حمضي عند الرقم الهيدروجيني الحمضي المعتاد للمقايسة.تمتلك الأشكال الحمراء والزرقاء والخضراء قيم امتصاص قصوى عند 475 و590 و650 نانومتر على التوالي. والشكل الأزرق هو الذي يرتبط بالبروتين مكوناً معقداً يمتص الضوء بكثافة عند 594 نانومتر. وتتميز هذه المقايسة واسعة الاستخدام بدرجة كبيرة من الانحناء عبر نطاق واسع من تركيزات البروتين.لذلك، يتم استخدام نطاق ضيق من تركيزات البروتين المرتفعة نسبيًا فقط لرسم منحنى المعايرة، مما يجعله أكثر ملاءمة للانحدار الخطي. وأحد أسباب عدم الخطية هو الامتصاصية عند 590 nanometers للصبغة الحرة، والتي تتناقص مع زيادة كميات البروتين المضافة. ويتم الحد من عدم الخطية جزئيًا عن طريق قياس التغير في الامتصاصية عند 450 nanometers، حيث تمتص الصبغة نفسها، وليس معقد البروتين والصبغة.ومن خلال طرح قيمة العينة الفارغة (blank) المحسوبة بدقة، فإن الانخفاض في تركيز الصبغة الحرة يؤدي إلى تشويه آخر في الاستجابة الخطية؛ وذلك لأن ارتباط الصبغة بالبروتين في حالة توازن، مما يجعل تكوين المعقد يعتمد ليس فقط على تركيز البروتين الحر، بل وأيضاً على تركيز الصبغة الحرة. وبأخذ هاتين المسألتين المتعلقتين بتغير تركيز الصبغة الحرة في الاعتبار، تم تطوير معادلة رياضية تصف العلاقة الخطية بين تركيز البروتين ونسبة قياسات الامتصاص عند 590 nanometers إلى 450 nanometers.تم اختبار المعادلة الرياضية تجريبياً ووُجد أنها تعطي منحنى معايرة خطياً عبر كامل نطاق تركيز البروتين. للبدء، قم بتحضير محلول مخزون من ألبومين المصل البقري القياسي بتركيز 0.1 mg/mL. يمكن اختيار أي معيار آخر، ولكن يجب ملاحظة ضرورة استخدام المعيار نفسه في جميع التجارب.قم بتخفيف العينات المجهولة في ماء منزوع الأيونات. استهدف تركيزاً يتراوح بين 5 إلى 50 ميكروغرام/مل، ومع ذلك، فإن تركيزات البروتين الأعلى أو الأقل مقبولة نظراً لعدم وجود حد واضح للنطاق الخطي للمقايسة. لاحظ على however، أن القياس يجب أن يكون ضمن النطاق الخطي لجهاز قارئ الامتصاصية.قم أيضاً بتخفيف كاشف برادفورد (Bradford reagent) بمقدار 2.5 ضعف في ماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، أضف صفر ومن خمسة إلى 50 ميكرولتر من محلول BSA المخزون إلى آبار مكررة ثلاث مرات في لوحة ذات 96 بئراً لإنشاء منحنى معايرة لـ BSA من صفر إلى خمسة ميكروجرام، مع استكمال الحجم بالماء منزوع الأيونات للوصول إلى 100 ميكرولتر لكل بئر في آبار مختلفة. أضف 100 ميكرولتر من العينة المجهولة في مكررات ثلاثية، ويمكن استخدام عدة تركيزات من العينة المجهولة لزيادة الدقة.أخيرًا، أضف 100 µL من كاشف برادفورد المخفف إلى جميع الآبار. ليصبح الحجم الإجمالي 200 µL لكل بئر. كما يجب تحضير عينة ضابطة (blank) لقياس الامتصاصية.يجب أن تكون هذه الكمية 200 µL من الماء منزوع الأيونات وليست صبغة البروتين صفرية. يتم الانتظار لمدة خمس دقائق على الأقل، ولكن ليس أكثر من 60 دقيقة، وذلك من أجل تلوين العينة.باشر بقياس الامتصاصية عند 590 نانومتر وعند 450 نانومتر. تذكر استخدام الماء لإجراء قياس العينة الفارغة (blank). قم بإعداد منحنى معايرة عن طريق قسمة قيم الامتصاصية الصافية عند 590 نانومتر على قيمها عند 450 نانومتر.لاحظ أنه يجب إدراج قيمة البروتين صفر كنقطة بيانات. احسب تركيز العينة المجهولة بناءً على المعادلة الخطية لمنحنى المعايرة. وعلى عكس الامتصاصية عند طول موجي واحد قدره 590 nanometers، فإن نسبة قيم الامتصاصية 590 nanometers إلى 450 nanometers تكون خطية مع تركيز البروتين.يمكن حساب تركيز البروتين في العينة المجهولة ببساطة باستخدام المعادلة الخطية لمنحنى المعايرة. ومع ذلك، يمكن تحقيق دقة أعلى من خلال قياس عدة تخفيفات للعينة المجهولة. ولتحقيق هذه الغاية، قم بإعداد رسمين بيانيين.يمثل الرسم البياني الأول منحنى معايرة للمحلول القياسي، حيث يمثل المحور السيني ميكروجرامات من البروتين. أما الرسم البياني الثاني فهو للعينة المجهولة، حيث يمثل المحور السيني ميكرولترات من العينة الأصلية غير المخففة. يجب إدراج قيمة الصبغة فقط في كلا الرسمين البيانيين.يتم اشتقاق تركيز البروتين في العينة المجهولة عن طريق قسمة ميل العينة المجهولة على ميل العينة القياسية. لقد قدمنا لك للتو كيفية قياس تركيز البروتين باستخدام بروتوكول برادفورد الخطي المحسن. إن استخدام هذا الإجراء يزيد بشكل كبير من دقة التحليل، ويحسن الحساسية بنحو 10 أضعاف، ويقلل بشكل كبير من التداخل الناتج عن المنظفات عند تطبيق هذا الإجراء.من المهم تذكر استخدام العينة الفارغة المناسبة، وهي الماء، بدلاً من عينة صبغة البروتين الصفرية. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

linearization-of-the-bradford-protein-assay

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وكميا عينات Microvolume بواسطة نظام يستخدم معمل الطبيعية التوتر السطحي للاحتفاظ عينات من دون استخدام cuvettes أو الشعيرات الدموية. وزيادة كبيرة في مجموعة ديناميكية من تركيزات البروتين والسرعة التي يمكن قياسها مع هذا الأسلوب.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

يوضح الفيديو تقنية نشاف غربية قائمة على تطبيع البروتين بالكامل لتحديد تعبير البروتين المستهدف في العينة. من خلال استخدام تلطيخ البروتين الكلي للعينة ، يتم إجراء تحليل نسبي لتحديد مستوى التعبير النسبي للبروتين المستهدف.

النشاف الغربي الكمي لتقدير مستويات التعبير عن البروتين

البروتوكولات هنا وصف المقايسات الحركية للتفاعلات البروتين البروتين مع بيو طبقة التداخل. F-نوع ATP سينسيز، التي تشارك في استقلاب الطاقة الخلوية، يمكن تحول دون الوحيدات ε في البكتيريا. تكيفنا الحيوي طبقة التداخل لدراسة التفاعلات المعقدة للالحفاز مع المثبطة-C محطة مجال ε ل.

التداخل الحيوي طبقة لقياس حركية البروتين البروتين التفاعلات والآثار تفارغي يجند

ويتجلى المناعة المستندة إلى شعري استخدام منصة تجارية لقياس البروتينات المستهدفة من مجموع البروتين الأعمال التحضيرية. وباﻹضافة إلى ذلك، المعلمات المقايسة وقت التعرض وتركيز البروتين، وتمييع جسم هي الأمثل لنظام نموذجي ثقافة خلية.

إجراءات واستراتيجيات التحسين الرئيسية لأسلوب الآلي المناعة شعرية المستندة إلى الغرواني الكهربي

ويصف هذا البروتوكول نهجاً خالية من المعايرة لتحديد كمية البروتين هومو أوليجوميريزاتيون في المختبر استناداً إلى الأسفار تقلب التحليل الطيفي باستخدام ضوء التجارية الفحص المجهري. يتم عرض الإعدادات الصحيحة اقتناء وأساليب التحليل.

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

ويصف هذا الأسلوب نهجاً قويا واستنساخه لمقارنة مستويات البروتين في الأنسجة المختلفة وفي تيميبوينتس التنموية المختلفة باستخدام نهج blotting غربية كمية موحدة.

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج مذنبات الأكتين على أسطح الخرز باستخدام مكونات البروتين المتاحة تجاريا. تحاكي هذه الأنظمة الهياكل البارزة الموجودة في الخلايا ، ويمكن استخدامها لفحص الآليات الفسيولوجية لإنتاج القوة بطريقة مبسطة.

إعادة تكوين الحركة القائمة على الأكتين مع البروتينات المتاحة تجاريا

توفر هذه الورقة بروتوكولا لقياس كمية البروتين باستخدام مقايسة برادفورد والهاتف الذكي كجهاز تحليلي. يمكن قياس مستويات البروتين في العينات باستخدام بيانات الألوان المستخرجة من صورة صفيحة دقيقة تم التقاطها باستخدام هاتف ذكي.

RGBradford: كمية البروتين مع كاميرا الهاتف الذكي

هنا نصف بروتوكولات التوصيف الفيزيائي الحيوي للتكوين المركب الثلاثي الناجم عن التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم (PROTACS) الذي يتضمن أربطة يوبيكويتين فون هيبل-لينداو E3 ligase (VHL) و Cereblon (CRBN).  تشمل الطرق الفيزيائية الحيوية الموضحة هنا رنين البلازمون السطحي (SPR) ، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) ، وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC).

تطوير وتطبيق المقايسات الفيزيائية الحيوية لتقييم تكوين المركب الثلاثي الناجم عن التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم (PROTACS)

توضح هذه المقالة بروتوكولا لدراسة تفاعلات الحمض النووي والبروتين باستخدام نظام قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) القائم على الستربتافيدين. يحدد الخطوات والاعتبارات الأساسية لاستخدام حركية الربط الأساسية أو المتقدمة لتحديد تقارب ربط التوازن (KD) للتفاعل.

تحليل تفاعلات الحمض النووي والبروتين مع قياس تداخل الطبقة الحيوية القائم على الستربتافيدين

تعلم إجراء التخطيط الخطي لتحسين دقة وتحسس قياس البروتين باستخدام تقنية برادفورد المُحسّنة. تُقلل هذه الطريقة من تداخل المنظفات وتُحسّن الحساسية عشر مرات.

الخطية من الفحص البروتين برادفورد

استكشف المزيد من الفيديوهات