زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Blairs هي الخلايا الجنينية التي تشكلت خلال مرحلة الانقسام من التطور. هنا يتم نقل GFP المسمى Blairs من جنين من جنين من أسماك الزرد إلى آخر باستخدام إبرة الزرع. تسمح هذه الطريقة باتباع سلوك ومصير المجدفين ذوي الخلفيات الجينية المتغيرة في جنين طبيعي أو العكس عن طريق التصوير المجهري الحي.

مرحبا ، أنا الدكتور زوران ، مختبر الدكتور شاو في قسم طب العيون بجامعة بيتسبرغ. سنعرض لك اليوم إجراء لنقل الثدي في جنرة الزرد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة شبكية العين ونمو الدماغ.

لذلك دعونا نبدأ. في المساء ، قم بإعداد تقاطعات زوجية من أسماك الزرد لمنع التزاوج العشوائي. قبل الوقت المطلوب ، استخدم الفواصل لفصل الأسماك الإناث والذكور. هنا.

تستخدم أسماك GFP المعبدة وراثيا كمصدر للأسماك المتبرعة. يعبر الخط المعدد وراثيا PT 1 0 4 عن GFP في كل مكان تحت سيطرة مروج EF واحد لإعداد الآبار الزراعية التي ستحتفظ بصب الأجنة الذائبة 1٪ agros المحضرة في E ثلاث بيضات ماء في طبق بتري. قم بتعويم قالب بلاستيكي مع نتوءات على شكل إسفين على محلول agros.

ثم دعها تبرد. للتصلب بعناية ، قم بإزالة القالب واغمر سرير agros في ماء E ثلاثة. بعد ذلك ، قم بإعداد إبر الزرع.

استخدم مجتذب إبرة عمودي عند إعداد الطاقة 11.5 لسحب الماصات الشعرية الزجاجية. يجب أن تتناقص أطراف الإبرة الجيدة مع مهاوي طويلة. قم بطحن أطراف الإبرة بزاوية 45 درجة باستخدام مطحنة صغيرة حتى يتم الحصول على فتحات مشطوفة من 30 إلى 40 ميكرومتر في القطر الداخلي.

لتنظيف أطراف الإبرة ، قم بتوصيل خرطوم بالطرف الحاد ، وقم بتوصيل الخرطوم بحقنة ثم امتصاص محلول حمض الهيدروفلوريك بنسبة 10٪ وتحريره. حتى تتم إزالة جميع الحطام المرئي. اغسل الأطراف بالماء المقطر.

ثم باستخدام 100٪ من الإيثانول ، جفف الإبر بالهواء حتى يتبخر كل الإيثانول. من المهم التأكد من أن الأطراف جافة تماما. سوف يدمر الإيثانول المتبقي الإبر أثناء التلميع بدرجة حرارة عالية.

الخطوة الثانية ، لتليين وتلميع الحواف الخشنة لأطراف الإبرة ، اخبزها بالحرارة الناتجة عن خيوط مزور صغير. لا تدع أطراف الإبرة تلمس الفتيل أثناء تلميع كمية الكهرباء التي تمر عبر الفتيل والمسافة بين الفتيل والإبرة. يمكن تعديل النصائح لتحقيق ظروف التسخين المطلوبة.

يجب ألا تكون درجة الحرارة مرتفعة جدا. سيؤدي ذلك إلى إذابة وتشويه أطراف الإبرة بعد تنعيم الحواف الخشنة. المس الفتيل الساخن بعناية بطرف الإبرة ثم اسحب الفتيل برفق بعيدا لتوليد نهاية مدببة.

الإبرة الحادة والناعمة والنظيفة أمرا بالغ الأهمية للحصول على متفجرات مانحة سليمة دون الإضرار بالأجنة المضيفة. اسحب ماصة زجاجية فوق لهب غاز لعمل مسبار زجاجي ناعم بنهاية ناعمة. سيتم استخدام هذا المسبار لوضع الأجنة في الاتجاه الصحيح قبل الزرع.

في يوم التجربة ، قم بإزالة الفواصل الموجودة في الكاسيت المتقاطع للسماح للأسماك بالتزاوج. تمانية. بعد 30 دقيقة ، اجمع 100 إلى 200 جنين عن طريق سكبها في شبكة. ضع الأجنة في طبق بتري مملوء بالماء E ثلاثة.

ثم باستخدام ملقط دقيق ، قم بتقطيع الأجنة عن طريق تمزيق CORs يدويا. ثم استخدم ماصة زجاجية ذات عمود مثني لنقل الأجنة المطلية بعناية إلى آبار أروس. لا تدع الأجنة تتلامس مع الهواء ، مما يؤدي إلى انفجارها.

اسمح للأجنة بالتطور عند 28.5 درجة مئوية في آبار الآروس حتى ثلاث ساعات بعد الإخصاب أو HPF أثناء نمو الأجنة. قم بإعداد جهاز زرع عن طريق توصيل إبرة الزرع بنظام ضخ صغير مملوء بالزيوت المعدنية. تأكد من عدم تسرب النظام وعدم احتوائه على أي فقاعات هواء محتجزة.

قم بإعادة ملء إبرة الزرع بالكامل بالزيت المعدني باستثناء 0.5 إلى ميكرولتر واحد من المساحة عند فتحة الطرف. استرجع الأجنة من الحاضنة وضعها على مسرح المجهر لزرع التجديف. استخدم مسبار تحديد المواقع الزجاجي لتوجيه جانب التجديف من ثلاثة إلى أربعة أجنة HPF لأعلى.

ثم أدخل إبرة الزرع برفق في جنين متبرع وامتص ببطء من خمسة إلى 20 تجديفا في الإبرة ، مع التأكد من أن طرف الإبرة لا يلامس الهواء أثناء الزرع. أدخل الإبرة المملوءة بالتجديف في جنين مضيف وحرر التجديف ببطء. سيؤثر الموقع الذي يتم فيه إطلاق التجديف على مكان توطين ذريتهم في مراحل النمو اللاحقة لتحليل تطور الشبكية والدماغ ، وإطلاق الخلايا في قطب.

إذا كان سيتم تحليل تطور الأنسجة والأعضاء الأخرى ، فيجب النظر في مواقع إطلاق مختلفة وفقا لذلك. لتقليل الضرر الميكانيكي أثناء الزرع ، تترك الأجنة المضيفة في آبار agros عند 28.5 درجة مئوية حتى اليوم التالي. ثم انقل أجنة الفسيفساء إلى 24 لوحا جيدا مغلفة مسبقا ب 0.5 مل من 1٪ aros ومليئة بملليلتر واحد من E ثلاث بيضات من الماء.

يجب إضافة جنين واحد إلى كل بئر لمنع الالتهابات البكتيرية عند 10 ميكرولتر من 100 × البنسلين والستربتومايسين. لكل منها ، قم بوزن وإعداد نقطة انصهار منخفضة أو LMP aros واحتفظ بالمحلول في حمام مائي 30 درجة مئوية. انقل جنين الفسيفساء إلى طبق نباتي بقاع زجاجي بسمك 0.17 ملم.

قم بإزالة أي ماء زائد E ثلاثة لترك الجنين مغطى للتو. ثم عند 30 إلى 50 ميكرولتر من 1.5٪ LMP المذاب إلى الجنين بسرعة قبل أن يتجمد محلول ARO. ضع العين أو الدماغ بالقرب من القاع الزجاجي قدر الإمكان.

بعد أن يبرد المحلول ، أضف محلول agros إضافي لتأمين الأجنة في مكانها. اغمر كتلة agros الصلبة في ملليلترتين إلى ثلاثة ملليلتر من ماء E ثلاثة بيضات للفحص المجهري متحد البؤر. يتم استخدام هدف مقلوب بالغمر في الماء 40 × مع عمق تركيز كبير.

أضف قطرة ماء إلى الهدف وضع طبق زراعة الأنسجة النباتية على المسرح وركز على تطوير الصورة. قم بإجراء تصوير الفاصل الزمني عن طريق التقاط صور للأجنة كل خمس دقائق. اعتمادا على طبيعة التجارب ، يمكن تعديل الفترات الزمنية بين اللقطات.

هنا تظهر صورة تمثيلية لسمكة سيبر 24 HPF. يسلط تعبير GFP الضوء على الخلايا المانحة باللون الأخضر. تمتد الخلايا الظهارية العصبية للشبكية على طول سمك جدار الشبكية بالكامل.

يظهر هذا الفيلم حركات الخلايا المانحة في الدماغ المضيف عند 24 HPF. لاحظ أن شكلات الخلية تتغير بمرور الوقت. فقط أوضح لك كيفية نقل مرآة الثدي في سمك الزرد.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير إبرة جيدة على منطقة الثدي المزروعة برفق. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.