Name: زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: تعلم زراعة الخلايا الجرثومية المُعبّرة عن GFP في أجنة سمك الزرد لدراسة تطور الشبكية والدماغ. تتيح هذه الطريقة تتبع سلوك الخلايا ورصد مصيرها أثناء التطور الجنيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) كور غرانت (5P30EY008098) والصناديق التالية لXW : المعاهد الوطنية للصحة والبحوث R01EY016099 المنحة لمنع العمى جائزة التطوير المهني. نشكر اثروب كيرا للحصول على مساعدة في مجال التصوير مبائر.

اليوم 1. إعداد 1. إعداد الصلبان الأسماك إعداد الصلبان البشرى من الزرد في المساء. لمنع التزاوج العشوائي قبل الوقت المطلوب ، استخدم فواصل لفصل الأسماك الإناث والذكور في أشرطة التزاوج. GFP - معربا عن الأسماك المعدلة وراثيا تستخدم كمصدر للblastomeres المانحة. خط pt104 المعدلة وراثيا (زو وآخرون ، 2008) ، وتستخدم هنا ، ويعرب عن GFP بتواجد مطلق تحت سيطرة المروج EF1. GFP التعبير يسمح التصور من الخلايا المانحة بواسطة التصوير الحي. ويمكن استخدام خطوط أخرى الأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مناسبة لاحتياجات محددة. 2. إعداد شكل إسفين agarose الآبار للحصول على عقد الجنين صب ذاب agarose 1 ٪ ، أعد البيض في الماء E3 (Westerfield ، 2007) ، في طبق بتري. تطفو في قالب من البلاستيك يحتوي على شكل نتوءات اسفين على حل agarose وترك حل agarose ترسيخ تماما. إزالة القالب بعناية ، وتزج السرير agarose بالماء E3. 3. إعداد زرع الإبر استخدام الإبرة مجتذب العمودي (ديفيد KOPF صكوك) في إعداد القوة لجعل 11،5 الإبر عن طريق سحب الزجاج الماصات الشعرية (البنك آلات دقيقة). نصائح جيدة ينبغي أن إبرة تفتق مع اعمدة طويلة. طحن نصائح الإبرة بزاوية 45 درجة مع مطحنة مايكرو (Marishige) حتى فتحات مشطوف من 45μm - 40 في القطر الداخلي ويتم الحصول على (الشكل 1A). لتنظيف نصائح الإبرة ، ونعلق خرطوم إلى نهاية حادة من الإبرة ، وربط خرطوم لحقنة ، ومن ثم تمتص والافراج عن 10 ٪ من محلول حمض الهيدروفلوريك حتى يتم إزالة كافة الانقاض مرئية. المقبل ، وغسل بالماء المقطر نصائح ، تليها الإيثانول بنسبة 100 ٪. الهواء الجاف والإبر حتى يتبخر كل الايثانول. فمن المهم لضمان أن تكون جافة تماما نصائح : الإيثانول المتبقية سوف تدمر الإبر خلال تلميع خطوة من ارتفاع الحرارة. لتليين وتلميع حواف خشنة من النصائح الإبرة ، أخبز نصائح إبرة مع الحرارة المتولدة عن خيوط من مزور مايكرو (Marishige). لا تدع نصائح إبرة تلمس خيوط خلال التلميع. يمكن ضبط كمية الكهرباء المارة على الرغم من خيوط والمسافة بين خيوط وإبر نصائح لتحقيق الشروط المطلوبة للتدفئة. ينبغي أن لا تكون درجة الحرارة مرتفعة جدا : هذا سوف تذوب وتشوه نصائح الإبرة. بعد مملس حواف خشنة ، المس بعناية خيوط ساخنة مع طرف الإبرة ثم اسحب برفق بعيدا عن خيوط الإبرة لتوليد نهاية أشارت (1B الشكل). إبرة حادة ، ناعمة ، ونظيفة أمر بالغ الأهمية من أجل الحصول على blastomeres المانحة على حالها وعدم الإضرار الأجنة المضيفة. 4. يعد المسبار الجنين لتحديد المواقع سحب ماصة الزجاج أكثر من لهب الغاز للحصول على الزجاج غرامة التحقيق مع نهاية مملس. وسيتم استخدام هذا التحقيق لوضع الأجنة في الاتجاه الصحيح قبل الزرع. اليوم 2. قسيم أرومي زرع 1. جمع واجنة dechorionate في اليوم التالي ، إزالة الفواصل في أشرطة عبر السماح الأسماك للتزاوج. وضع الأجنة في طبق بتري مملوءة بالماء E3. ثم والأجنة التي تمزق dechorionate يدويا بعيدا chorions من الأجنة مع زوج من ملقط الغرامة. استخدام ماصة الزجاج مع رمح عازمة على نقل الأجنة بعناية dechorionated في آبار agarose. تجنب أي اتصال من الأجنة مع الهواء ، مما يؤدي إلى انفجار الأجنة. السماح للأجنة في تطوير 28،5 درجة مئوية في الآبار agarose حتى 3 التسميد آخر ساعة ، أو HPF. 2. انشاء جهاز زرع في حين أن الأجنة تطوير وانشاء جهاز الزرع من خلال ربط الإبرة إلى زرع الزيوت المعدنية المليئة النظام الجزئي الضخ. تأكد من أن النظام لا تسرب محاصرون وليس فقاعات الهواء في النظام. شغل الإبرة مرة زرع كامل مع الزيوت المعدنية ، باستثناء 0.5 -- في افتتاح غيض 1 ميكرولتر من الفضاء. 3. زرع blastomeres لزرع blastomeres ، واستخدام الزجاج التحقيق لتحديد المواقع لتوجيه الجانب قسيم أرومي من أجنة 3 - 4 - HPF صعودا. ثم ، تضاف برفق الإبرة إلى زرع جنين المانحة وتمتص ببطء 50-20 blastomeres في الإبرة. ادخال الإبرة قسيم أرومي مملوءة إلى الجنين المضيف والافراج عن blastomeres ببطء. سيكون الموقع الذي يتم الإفراج عن التأثير فيها blastomeres ذريتها توطين في مراحل تنموية في وقت لاحق. لتحليل وضع شبكية العين والدماغ والخلايا الافراج في القطب الحيواني. خلال الزرع ، وتأكد من أن رأس الإبرة لا اتصال الهواء. لتقليل الأضرار الميكانيكية ، يجب ترك الأجنة المضيفة في الآبار في agarose 28.5 درجة مئوية حتى اليوم التالي. ثم ، رransfer الأجنة الفسيفساء إلى 24 لوحات جيدا قبل المغلفة مع 0.5 مل من agarose 1 ٪ ، مع جنين واحد في كل جانب. يضاف 1 مل من الماء إلى البيض E3 كل بئر. لمنع العدوى البكتيرية ، وإضافة 10 ميكرولتر من البنسلين والستربتوميسين 100X إلى الماء البيض E3. اليوم 3. التضمين والتصوير المباشر للأجنة الفسيفساء 1. التضمين الأجنة إعداد 1.5 ٪ نقطة انصهار منخفضة agarose (LMP) في الماء والحفاظ على بيضة E3 الحل في حمام الماء 30 درجة مئوية. نقل الجنين الى صحن فسيفساء نسيج الثقافة FluoroDish مع قاع كوب من سمك 0.17mm في (الآلات الدقيقة الدولي). إزالة المياه الزائدة E3 على مغادرة جنين المشمولة فقط من خلال الحد الأدنى من E3. إضافة 30-50 ميكرولتر ذاب LMP 1.5 ٪ إلى الجنين. الموقف بسرعة العين أو الدماغ أقرب إلى أسفل الزجاج ممكن قبل حل agarose يتصلب. بعد حل يبرد ، إضافة إضافية agarose حل لتأمين مزيد من الأجنة في المكان. ثم غمر طدت agarose مع كتلة 2-3 مل ماء بيضة E3. 2. مبائر التصوير للفحص المجهري متحد البؤر ، يستخدم هدفا الغمر بالمياه المقلوب (أوليمبوس ، PlanApo ، 40 X/0.90 WLSM ، اليابان) مع التركيز عمق كبير. إضافة قطرة من الماء على الهدف والمكان بعد ذلك زراعة الأنسجة FluoroDish طبق على الهدف. صورة للتنمية ، نفذ الوقت الفاصل بين التصوير التي تلتقط صورا للأجنة كل 5 دقائق. اعتمادا على طبيعة التجارب ، ينبغي ضبط الفواصل الزمنية بين الطلقات. ممثل النتائج الشكل 2 يوضح ممثل HPF 24 الزرد الفسيفساء. GFP التعبير تسلط الضوء على الخلايا المانحة باللون الأخضر. الخلايا الظهارية العصبية للشبكية تغطي كامل سماكة الجدار في شبكية العين. الفيلم يتناول تحركات خلايا المانحة في الدماغ المضيفة في 24 HPF. إشعار الخلايا morphologies تتغير بمرور الوقت. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. أشكال من النصائح إبرة الزرع. ألف وكان افتتاح مشطوف من غيض من إبرة خالية من الحطام بعد يغسل حمض الهيدروفلوريك. ولدت ألف باء وأشار في نهاية طرف الإبرة. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. التصور من GFP - معربا عن الخلايا المانحة في الأجنة الزرد خيالية في 24 HPF. اللوحة اليسرى يظهر إشارات GFP في الدماغ وشبكية العين. لوحة الوسطى هي صورة مشرقة من حقل الجنين. لوحة الحق يظهر صورة مدمجة. الفيلم 1. تصوير الخلايا الحية GFP المانحة إيجابية أظهرت تغيرات واسعة في الخلايا الظهارية العصبية morphologies الدماغ أثناء التطور. وجمعت الأطر الفردية من الفيلم كل 5 دقائق بين 24 و 25 HPF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">انقر هنا لمشاهدة الفيلم</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لزرع قسيم أرومي لتحليل وضع شبكية العين والدماغ في الزرد. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لتحليل تطور الأنسجة والأجهزة الأخرى عن طريق الإفراج عن ببساطة blastomeres المانحة إلى مواقع المناظرة في الأجنة المضيفة. وسم مع جزيئات GFP تعطي خلفية أنظف من العلامات مع ديكستران صبغ مترافق فلوري (هو وكين 1990). هذا لأن الحطام من الأصباغ ديكستران من خلايا ميتة المانحة يستمر لفترة أطول بكثير من GFP ، وبالتالي استنتاج مع التصوير (كاتالانو وآخرون<...

E3 البيض المياه : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مم كلوريد الصوديوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.17 ملي بوكل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 ملي CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 ملي MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 ٪ الميثيلين الأزرق </li></ul>

زرع gfp - معربا عن blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

تغيير الخلايا على نطاق واسع في مواقع وممتلكاتهم خلال مرحلة التطور الجنيني. وتنظم هذه التغييرات من التفاعلات بين الخلايا وبيئتها. أجنة خيالية ، والتي تتكون من خلايا جينية مختلفة عن الخلفية ، هي أدوات عظيمة لدراسة التفاعلات خلية خلية بوساطة الجينات في المصالح. شفافية الجنينية من الزرد في مراحل النمو المبكر تصاريح التصوير المباشر للالتشكل الأنسجة والأعضاء على المستوى الخلوي. هنا ، علينا أن نظهر بروتوكول لتوليد خيالية شبكية العين والدماغ في الأجنة الزرد والتصوير لأداء حية من خلايا المانحة. البروتوكول يشمل إعداد الإبر زرع ، وزرع GFP - معربا عن blastomeres المانحة لGFP سلبية المضيفين ، ودراسة سلوك الخلية المانحة تحت المجهر مبائر حية. مع تعديلات طفيفة ، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة التطور الجنيني من الأنسجة والأجهزة الأخرى في الزرد. وتناقش أيضا مزايا استخدام GFP إلى الخلايا المانحة التسمية.

ندلل على بروتوكول لتوليد اجنة الزرد خيالية للسلوك التصوير العيش الخلوية خلال مرحلة التطور الجنيني.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

تتغير الخلايا بشكل واسع في مواقعها وخصائصها أثناء التخلق الجنيني. وتُنظم هذه التغييرات من خلال التفاعلات بين الخلايا و...

تعد خلايا بلاستولا (Blasts) هي الخلايا الجنينية التي تتكون خلال مرحلة الانقسام من التطور. هنا، يتم نقل خلايا بلاستولا موسومة بـ GFP من جنين سمكة زيبرا إلى جنين آخر باستخدام إبرة زرع. وتسمح هذه الطريقة بتتبع سلوك ومصير الخلايا ذات الخلفيات الجينية المعدلة في جنين طبيعي، أو العكس، وذلك عن طريق التصوير المجهري الحي.مرحباً، أنا الدكتور زوران، من مختبر الدكتور شو في قسم طب العيون بجامعة بيتسبرغ. سنعرض لكم اليوم إجراءً لنقل الأجنة في أسماك الزيبرا. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تطور الشبكية والدماغ.فلنبدأ الآن. في المساء، قم بإعداد تزاوجات زوجية لأسماك الزيبرا لمنع التزاوج العشوائي. وقبل الوقت المطلوب، استخدم الحواجز لفصل الأسماك الإناث عن الذكور. هنا.تُستخدم الأسماك المعدلة وراثياً والتي تعبر عن GFP كمصدر للأرومات blastomeres المانحة. يعبر الخط المعدل وراثياً PT 1 0 4 عن GFP بشكل شامل تحت تحكم محفز EF one. لتحضير آبار الـ agros التي ستوضع فيها الأجنة، صب 1% agros مذاباً ومحضراً في ماء بيض E three في طبق بتري. قم بتعويم قالب بلاستيكي يحتوي على نتوءات على شكل إسفين فوق محلول الـ agros.بعد ذلك، اتركه ليبرد. ولضمان التصلب بعناية، قم بإزالة القالب وغمر سرير الأغار في ماء E ثلاثة. بعد ذلك، قم بتجهيز إبر النقل.استخدم جهاز سحب الإبر الرأسي عند ضبط الطاقة على 11.5 لسحب ماصات الشعيرات الزجاجية. يجب أن تكون رؤوس الإبر الجيدة مستدقة ذات سيقان طويلة. قم ببرد رؤوس الإبر بزاوية 45 درجة باستخدام مطحنة دقيقة حتى يتم الحصول على فتحات مائلة يتراوح قطرها الداخلي من 30 إلى 40 micrometers.لتنظيف رؤوس الإبر، قم بتوصيل خرطوم بالطرف الكليل، ثم صِل الخرطوم بمحقنة، وبعد ذلك قم بسحب وتحرير محلول حمض hydrofluoric بتركيز 10%. استمر في ذلك حتى تتم إزالة جميع الرواسب المرئية. اغسل الرؤوس بالماء المقطر.بعد ذلك، استخدم 100%ethanol لتجفيف الإبر في الهواء حتى يتبخر الإيثانول تماماً. ومن الضروري التأكد من جفاف الأطراف تماماً، حيث إن وجود بقايا من الإيثانول سيؤدي إلى تلف الإبر أثناء عملية التلميع في درجات الحرارة المرتفعة.الخطوة الثانية، لتنعيم وصقل الحواف الخشنة لأطراف الإبر، يتم تسخينها باستخدام الحرارة المتولدة من فتيل جهاز صهر دقيق (micro forger). يجب عدم السماح لأطراف الإبر بلمس الفتيل أثناء الصقل؛ حيث يمكن ضبط كمية الكهرباء المارة عبر الفتيل والمسافة بين الفتيل والإبر للوصول إلى ظروف التسخين المطلوبة.يجب ألا تكون درجة الحرارة مرتفعة للغاية؛ لأن ذلك سيؤدي إلى صهر وتشويه رؤوس الإبر بعد تسوية الحواف الخشنة. لامس الفتيل المسخن بعناية باستخدام رأس الإبرة، ثم اسحب الفتيل بلطف لتكوين طرف مدبب.تعد الإبرة الحادة والملساء والنظيفة أمراً بالغ الأهمية للحصول على الخلايا المانحة السليمة دون إتلاف الأجنة المضيفة. اسحب ماصة زجاجية فوق لهب غازي لصنع مسبار زجاجي دقيق ذو نهاية ملساء. سيُستخدم هذا المسبار لوضع الأجنة في الاتجاه الصحيح قبل عملية النقل.في يوم التجربة، قم بإزالة الفواصل في كاسيتات التقاطع للسماح للأسماك بالتزاوج. ثامناً، بعد مرور 30 دقيقة، اجمع من 100 إلى 200 جنين عن طريق صبهم في شبكة. ضع الأجنة في طبق بتري مملوء بـ E three water.بعد ذلك، وباستخدام ملقط دقيق، قم بإزالة الغلاف عن الأجنة عن طريق تمزيق الـ CORs يدوياً. ثم استخدم ماصة زجاجية ذات ساق منحنية لنقل الأجنة المغلفة بعناية إلى آبار aros. احرص على عدم ملامسة الأجنة للهواء، لأن ذلك سيؤدي إلى انفجارها.اترك الأجنّة لتتطور عند درجة حرارة 28.5 °C في آبار aros حتى مرور ثلاث ساعات بعد الإخصاب أو HPF أثناء تطور الأجنّة. قم بتجهيز جهاز النقل عن طريق توصيل إبرة النقل بنظام ضخ دقيق مملوء بالزيت المعدني. تأكد من أن النظام لا يسرب ولا يحتوي على أي فقاعات هواء محبوسة.املأ إبرة الزرع بالكامل بالزيت المعدني، باستثناء مساحة تتراوح من 0.5 إلى 1 µL عند فتحة الطرف. استخرج الأجنة من الحاضنة وضعها على منصة المجهر لنقل الـ blaspheme. استخدم مسبار تحديد موضع زجاجي لتوجيه جانب الـ blaspheme في الأجنة التي يبلغ عمرها من ثلاث إلى أربع ساعات بعد الإخصاب (HPF) نحو الأعلى.ثم أدخل إبرة النقل برفق في جنين مانح واشفط ببطء من خمسة إلى 20 أرومة في الإبرة، مع التأكد من عدم ملامسة طرف الإبرة للهواء أثناء عملية النقل. أدخل الإبرة المملوءة بالأرومات في جنين مضيف وحرر الأرومات ببطء. إن الموقع الذي يتم فيه تحرير الأرومات سيؤثر على مكان تمركز نسلها في المراحل النمائية اللاحقة؛ ولتحليل تطور الشبكية والدماغ، يتم تحرير الخلايا عند القطب الحيواني.إذا كان من المقرر تحليل تطور أنسجة وأعضاء أخرى، فيجب مراعاة مواقع إطلاق مختلفة وفقاً لذلك. وللحد من الضرر الميكانيكي أثناء النقل، تُترك أجنة المضيف في آبار agros عند 28.5 درجة مئوية حتى اليوم التالي. بعد ذلك، يتم نقل الأجنة الفسيفسائية إلى أطباق ذات 24 بئراً مطلية مسبقاً بـ 0.5 ملي لتر من 1%aros ومملوءة بـ 1 ملي لتر من مياه بيض E three.يجب إضافة جنين واحد إلى كل بئر لمنع العدوى البكتيرية باستخدام 10 µL من البنسلين والستريبتومايسين بتركيز 100x. قم بوزن وتحضير Agar ذو نقطة انصهار منخفضة (LMP) لكل بئر، مع الحفاظ على المحلول في حمام مائي عند درجة حرارة 30 °C. انقل جنيناً فسيفسائياً إلى طبق فلورا ذو قاعدة زجاجية بسمك 0.17 mm.قم بإزالة أي كمية زائدة من الماء E3 بحيث يبقى الجنين مغطىً بالكاد. بعد ذلك، أضف من 30 إلى 50 µL من LMP بتركيز 1.5% المذاب إلى الجنين بسرعة قبل أن يتصلب محلول ARO. قم بوضع العين أو الدماغ في أقرب نقطة ممكنة من القاعدة الزجاجية.بعد أن يبرد المحلول، أضف المزيد من محلول agros لتثبيت الأجنة في مكانها بشكل إضافي. اغمر كتلة agros المتصلبة في 2 إلى 3 ملليلتر من ماء البيض E three من أجل المجهر البؤري (confocal microscopy). تُستخدم عدسة شيئية مقلوبة غاطسة في الماء بقوة 40x ذات عمق تركيز كبير.أضف قطرة من الماء على العدسة الشيئية، ثم ضع طبق زراعة أنسجة نباتية على المنصة وقم بالتركيز لتطوير الصورة. قم بإجراء التصوير بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) عن طريق التقاط صور للأجنة كل خمس دقائق. ويمكن تعديل الفواصل الزمنية بين اللقطات وفقاً لطبيعة التجارب.تظهر هنا صورة نموذجية لجنين سمكة زيبرا في عمر 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF). يبرز تعبير GFP الخلايا المانحة باللون الأخضر. وتمتد الخلايا الظهارية العصبية الشبكية عبر كامل سمك الجدار الشبكي.يعرض هذا المقطع الحركي تحركات الخلايا المانحة في دماغ المضيف عند 24 HPF. لاحظ تغير مورفولوجيا الخلايا بمرور الوقت. يوضح لك هذا المقطع كيفية إجراء نقل المرآة الثديية في أسماك zebrafish.عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير إبرة جيدة في منطقة الثدي المزروع بلطف. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

دليل خطوة بخطوة لتوليد اجنة استهدفت الزرد خيالية بواسطة زرع في المرحلة الأريمة أو المعيدة.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

الزرد زرع الخلايا يمكن الجمع بين علم الوراثة وعلم الأجنة لتوليد نسيج الوهم محددة. هذا الفيديو يوضح المعيدة نظموا زرع الخلية التي سمحت مختبرنا للتحقيق في دور السكان astroglial والعظة توجيهات محددة خلال تشكيل الصوار في الدماغ المقدم.

الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

في هذا الفيديو ، وتقدم تقنيات التصوير متعدد الألوان مرور الزمن مبائر والاجتثاث استهدفت خلية. يتم استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لرصد سلوك من أنواع متعددة من الخلايا...

متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

ومعظمها تم دراستها تجديد شبكية العين الزرد باستخدام شبكية العين الثابتة. ومع ذلك، والعمليات الحيوية مثل الهجرة النووية interkinetic تحدث خلال استجابة التجدد وتتطلب التصوير الخلية الحية للتحقيق في الآليات الكامنة. هنا، نحن تصف الظروف والثقافة وتصوير لمراقبة Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية) في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر multiphoton.

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

تتبع الحية الفردية الأسلاف شبكية العين WT في خلفيات وراثية متميزة يسمح لتقييم مساهمة الخلية إشارات غير المتمتعة بالحكم الذاتي خلال تكوين الخلايا العصبية. هنا، واستخدمت مجموعة من إسقاط الموروثة، وتوليد الوهم عن طريق زرع الجنين وفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لهذا الغرض.

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

تم تنفيذ مزيج من التقنيات البصرية المتقدمة في ليزر المسح المجهري مع الطول الموجي الفوتوني متعدد الأسفار الإثارة منذ وقت طويل لالتقاط التصوير عالية الدقة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للهجرة crest العصبي في تيراغرام (sox10:EGFP) والأجنة الزرد تيراغرام (foxd3:GFP).

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

يصف هذا البروتوكول نهجا لوضع العلامات في توتو والتصوير متعدد الأبعاد لسمك الحمار الوحشي في وقت مبكر من نمو العين. نحن نصف وضع العلامات والتضمين والتصوير رباعي الأبعاد (4D) باستخدام المجهر confocal المسح بالليزر ، واعتبارات لتحسين الحصول على مجموعات البيانات لتشريح آليات مورفوجينيسيس كوب البصرية.

4-التصوير الأبعاد من زيبرافيش كأس البصرية Morphogenesis

يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

نقدم هنا بروتوكولا لزرع الخلايا بدقة مكانية وزمانية عالية في أجنة الزرد واليرقات في أي مرحلة بين 1 و 7 أيام على الأقل بعد الإخصاب.

زرع الخلايا عالية الدقة في الزرد الجنيني واليرقات

تعلم زراعة الخلايا الجرثومية المُعبّرة عن GFP في أجنة سمك الزرد لدراسة تطور الشبكية والدماغ. تتيح هذه الطريقة تتبع سلوك الخلايا ورصد مصيرها أثناء التطور الجنيني.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

استكشف المزيد من الفيديوهات