Name: تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق /em (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: تعلم تقنية زرع رسملة الحيوان لتحديد مصير الأنسجة في أجنة Xenopus laevis باستخدام التعبير الزائد للجينات والتتبع الفلوري. تُظهر النتائج تكوين أنسجة خارجية مثل البنى الشبيهة بالعين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من البحوث للوقاية من العمى (جوائز التطوير الوظيفي لMEZ وASV ومنحة غير مقيد إلى قسم العيون) ، ومؤسسة ماتيلدا E. زيغلر (MEZ وASV) والمعهد الوطني للعيون / المعاهد الوطنية للصحة (MEZ والمنح وR01EY015748 R01EY017964).

الجزء الأول مجموعة المتابعة للالفحص ACT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توج توليد الحمض النووي الريبي للحقن كما اقترح من قبل الشركة المصنعة ، وذلك باستخدام الفينول منها : طريقة تنقية كلوروفورم (مثل mMessage mMachine كيت ؛ النظم البيولوجية التطبيقية / Ambion ، أوستن ، تكساس). ويستخدم الحمض النووي الريبي الترميز بروتين فلوري باعتبارها المذنبة. نحن تدوين بروتين فلوري إما أصفر (YFP) أو mCherry 5 [كدنا] ، الذي هو في تعبير pCS2 ناقلات +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية لتشكيل الزجاج نصائح مدبب باستخدام مجتذب micropipette. نستخدم سوتر Micropipette بولير ، P - 97 (سوتر الآلات ، وشركة ، نوفاتو ، كاليفورنيا) ، كما هو موضح سابقا 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحلول العقيمة في الجدول رقم 1 من 10 X مارك في لرينغر التعديل (MMR) حل سهم (10 ملي MgCl 2 و 20 ملي بوكل ، و 20 ملي CaCl 2 ؛ HEPES ملي 50 ؛ 1 م كلوريد الصوديوم ؛ تعديلها لدرجة الحموضة 7.5 ، تعقيمها وتخزينها في RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخصيتين من الضفادع الذكور وتخزين الأنسجة عند درجة 4 في محلول معقم من لقاح MMR 1X / جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل سلفات الجنتاميسين ؛ BioWhittaker ، القط # 17 - 518Z). يمكن القيام بذلك حتى قبل أسبوع من بدء التجربة لكنه يفقد فعاليته مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن إجراء باعتبارها 8X الأسهم ، والتي ؛ : الحل البيض (7.6 درجة الحموضة تعديلها لكلوريد الصوديوم 150 ملم ، 2.62 ملم بوكل ، 0.8 ملي نا 2 هبو 4 و 20 ملي Trizma القاعدة ، 2.62 ملي NaHCO 3 و 4 ملي 2.75 MgSO 1X) يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى أسبوعين. ملاحظة : احترس من التلوث في هذا الحل ، لأن هذا سوف يؤثر على نوعية البيض الخاص بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء لوحات الحقن. للقيام بذلك ، ذوبان agarose 1 ٪ في معدل وفيات الأمهات 0.4X في الميكروويف ، إضافة ~ 6 مل حل agarose ذاب في لوحات عيار 60 ملم ، انبسط بلطف an العفن الاستومر (الشكل 1) على رأس من الحل لمنع الفقاعات والسماح لتبرد لحوالي 20 دقيقة في RT. لتحديد العدد المطلوب ، والنظر في عدد من الظروف التجريبية (مثل 1 ، YFP ؛ 2 ، YFP + رأس) ، ويحتاج إلى عدد من الأجنة المضيفة المزروعة. لتجاربنا ، ونحن لا يقل عن 20 توليد اجنة المضيف المزروعة لكل حالة تجريبية. في 18-19 وسوف درجة مئوية ، وتكون الأجنة في هذه المرحلة 15 لمدة ساعة تقريبا. إذا كان يستغرق ساعة واحدة لتنفيذ 20 عملية زرع ، ثم هناك حاجة إلى نقطتين وقت الإخصاب ، على افتراض الأجنة المضيفة قبول جميع عمليات زرع. ولذلك ، ستكون هناك حاجة أطباق الحقن الأربعة (2 × ظروف عملي وقت الإخصاب 2 نقطة = 4). تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء لوحات العزل باستخدام غطاء + 1 ٪ agarose 0.7X MMR مع قوالب بالنسبة للوحة الحقن. جعل العدد نفسه من العزلة سقف لوحات الحقن زائد واحد في الوقت الاضافي التسميد نقطة (4 + 2 نقطة التسميد الوقت = 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الإناث مع 500 وحدة موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية في وقت متأخر من يوم قبل يوم microinjection. الإناث في مخزن 16-18 درجة مئوية خلال الليل. </li></ol> الجزء الثاني. RNA Microinjection الأجنة المورق القيطم ألف التحضير لmicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإناث يسببها هرمونيا ووضعها في خزانات تحتوي على الفرد 1X حل البيض (ELS) ملاحظة : نحن لا نستخدم البيض الذي تم في ELS أكثر من ساعتين كما هو انخفاض جودة البيض. لذلك ، قبل نحو ساعة من التخصيب في المختبر ، ونحن تجاهل كل البيض من خزان بحيث يتم جمع البيض الطازج وضعت فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإبرة لmicroinjection بواسطة القص قبالة الطرف للحصول على قطر 25-35 ميكرومتر. وضع الإبرة على لpicoinjector ومعايرتها بحيث يوزع 10 في NL الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة حاضنة إلى 14 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وضعت الإناث البيض للإزالة ، على بعد حوالى ساعة من البيض من الدبابة باستخدام ماصة نقل ووضعها في أطباق بتري 60 مم. كما ELS إزالة الكثير من البيض واستبدالها ممكن مع 1X MMR. ويمكن إخصابها البيض على الفور أو البقاء في MMR 1X لمدة تصل إلى ساعة واحدة. لمقايسة زرع ، فمن الأفضل أن يخصب طبقين ، و 80 ٪ كاملة من طبقة واحدة من البيض في مدة تصل إلى ثلاث دفعات منفصلة عند حوالي الساعة 11 صباحا وظهرا ومساء 1. بعد الحقن ، سيتم وضعها في 14 درجة مئوية بحيث أنها ستنمو الى المراحل المطلوبة لعزل غطاء (مرحلة 8،5-9) وزرع (المرحلة 15 ، وانظر الجزء الأول ، # 6 أعلاه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من جودة الخصيتين ، ونحن إجراء التلقيح في الصباح الباكر (~ 08:00) ، والذي يسمح لنا لاستخراج الخصيتين من جهة اخرى ذكر إذا كان من أول الحيوانات المنوية ليست قابلة للحياة. ملاحظة : نحن التجانس ~ 0.25 في الخصيتين MMR 1X 1 مل وإضافة ما يقرب من 5-7 نقاط لكل لوحة من البويضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المختبر تخصيب البويضات مع الخصيتين المتجانس ، وبعد ساعة ، وإزالة الطبقة الهلامية على البيض باستخدام دي هلام الحل (DTT 164μl 1M + 10ML 1M تريس ، ودرجة الحموضة 8.8 إلى 50 مل من الماء nanopure تعقيمها). انتظر حتى تصل إلى عامين لتبدأ مرحلة الخلية والفرز ، والذي يستغرق حوالي 2 ساعة على 18 درجة مئوية أو 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام transfإيه ماصة ، مصطبغة فرز الأجنة بشكل موحد وتقسيم بالتساوي ، كما هو مبين في الغطاء الحيواني اليسار في الشكل 3 ، في بئر حقن طبق مليء Ficoll + 0.4X MMR 6 ٪. </li></ol> باء Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm تمتد فوق الجزء العلوي من غطاء 60 مم طبق بيتري. ماصة 2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي الخاص لأول مرة في Parafilm ونضح باستخدام PLI - 100 لملء الخاص إبرة الحقن. تأكد من التحقق من أن الإبرة الاستغناء NL يزال 10 من العينة قبل البدء في الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الأجنة 20-30 مرحلتين الخلية (سواء blastomeres) مع 500 RNA YFP بيكوغرام في صحن واحد والجين اهتمامكم (على سبيل المثال 20 بيكوغرام رأس RNA) ، بالإضافة إلى RNA YFP في طبق آخر 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100-200 مكان غير حقن الأجنة في نقطة زمنية أخرى في طبق مع حقن محلول Ficoll. نقلها داخل وخارج الحاضنة في نفس الوقت مع حقن الأجنة. هذه هي يستضيف لاستخدامها في الجزء الرابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن ، واحتضان جميع الأجنة عند 14 درجة مئوية خلال الليل. أكرر للجميع نقاط الوقت. </li></ol> الجزء الثالث. عزل قبعات من أجنة الحيوانات حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصل في وقت مبكر من صباح اليوم إلى مرحلة الأجنة. ينبغي أن تكون نقطة أقرب وقت ممكن في مرحلة 9. إزالة تلك التي لم تنج. المضي قدما في الخطوات التالية العمل مع كل نقطة في الوقت دفعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي من حل Ficoll من كل لوحة وإضافة MMR 0.7X الخلفي / حل الجنتاميسين. لسقف صحن العزلة ، إضافة كمية سخية من حل MMR / جنتاميسين 0.7X. طرد الأجنة من آبارهم طبق الحقن باستخدام ماصة نقل ومكان في صحن سقف العزلة الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبعات عزل الحيوانات في حل MMR 0.7X + جنتاميسين ، وحفظ أو 2 أو 3 أجنة سليمة لتنظيمه. ويمكن استخدام إما Gastromaster ، مزودة تلميح عازمة الأصفر إلى 400 ميكرون ، أو زوج من حاد ملقط 5 العدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القبعات مرة في 14 درجة مئوية حاضنة حتى اليوم التالي. يجب إزالة الأجنة المضيف من الحاضنة في الوقت نفسه للحفاظ على القبعات في هذه المرحلة التنموية نفس الأنسجة المانحة. </li></ol> الجزء الرابع. زرع القبعات على الخاصرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القبعات والأجنة من نقطة لأول مرة من الحاضنة 14 درجة مئوية ومرحلة الأجنة. الفرز للقبعات موحدة الفلورسنت إيجابية أصفر أو أحمر ، اعتمادا على حقن التتبع (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من القبعات وإزالة مضاعفة عدد الأجنة لمرحلة 12-13 طبق حقن الطازجة مع MMR 0.7X / حل الجنتاميسين. بالملقط # 5 حادة ، وإزالة الغشاء المحي من كل. نقلها إلى اللوحة مع القبعات ، ولكن كن حذرا. دون أغشية المحية بها ، يمكن فصل الأجنة بسرعة على سطح الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام gastromaster (نصيحة الصفراء ، والأسلاك 200 250μm عازمة ، أعلى الإعداد) أو # 5 الملقط ، إزالة 200 ميكرومتر مربع على جانب من الأجنة في مرحلة 14-15 (الشكل 3). ثم ، وخفض سقف في نصف (مع gastromaster أو ملقط # 5) ومكان النسيج في الحفرة التي أدلي بها في الجنين المضيف. تدوير الجنين ضد البئر للسماح للشفاء. كما تفعل ذلك لأجنة كثيرة كما يمكنك أثناء وجودهم في المرحلة 15. أكرر للجميع نقاط الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تلتئم الجنين عادة في غضون 30 دقيقة. إزالة الخلايا الميتة (أبيض) مع اقتراح لطيف بالفرشاة مع ملقط # 5. بزراعتها في 18 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر مضان تشريح والأجنة الفرز مع الأنسجة ، fluorescently المسمى المزروعة. وضعها من جديد في 18 درجة مئوية إلى النمو حتى مرحلة 42-43. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات في tricaine. عند هذه النقطة ، يمكنك التقاط الصور تحت المجهر مضان تشريح. بعد الانتهاء ، الإصلاح ، والقسم immunostain أو تنفيذ في الموقع التهجين باستخدام علامات للأنسجة اهتمامك. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. تصميم شبكي لصب القالب الاستومر التي تستخدم في صنع أطباق عقد الجنين. A 38 × 38 ملم ذهابا ويحشر مربع (~ 5 ملم العميق) تم توجيهها من قطعة من زجاج شبكي أن 50 × 50 ملم مربع و 25 مم. وقد تم حفر دائرية ، وحفر الآبار متباعدة بشكل متساو (1.5 مم) 1 ملم عمق البلاستيك. لجعل العفن الاستومر للأطباق microinjection ، تدفقت علينا الاستومر Sylgard في زجاج شبكي وسمح لها لترسيخ ، وفقا لتعليمات الصانع. ويستخدم هذا القالب لجعل الاستومر الحقن وألواح العزل الغطاء. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. قبعة الحيوانية الفرز قبل الزرع هو المهم ، كما يمكن أن يختلف التعبير. قبعة الحيوان على اليسار عن mCherry بالتساوي في جميع أنحاء الأنسجة بينما يزدرع على حق التعبير ومتقطعا ، وسوف يتم التخلص منها. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. مضيف tadpوقد وضعت أوله بنية تشبه العين على حدودها من زرع الخلايا الحيوانية سقف ، وقد overlayed صورة الفلورسنت على الصورة brightfield.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

في هذا الفيديو ، لقد أثبتنا لدينا نسخة من التقنيات التي يستخدمها علماء البيولوجيا الكلاسيكية القيطم ، ونحن ترتيبها لخلق غطاء زرع فحص الحيوانات. في درجة حرارة الغرفة ، والأجنة القيطم تتطور بسرعة كبيرة من خلال المراحل 9 و 15. عن طريق وضعها في 14 درجة مئوية وتباطأ ، ووضع الجنين إلى أسفل ويمكن تنفيذ العديد من عمليات زرع في تجربة واحدة. إذا كان ذلك ضروريا لنمو الأجنة في المراحل القديمة (&gt; 42 / 43) ، ثم نوصي باستخدام حيوانات معدلة وراثيا فينوس YFP ، لأن حقن بروتين ف...

<table><tbody><tr><td>طقم mMessage mMachine SP6</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب شعرية من البوروسيليكات (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>جهاز سحب الماصات الدقيقة Sutter</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الجنتاميسين [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>طقم Sylgard/elastomer 1.1lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>أطباق بتري من البوليسترين 60 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>أنظمة الحقن المجهري Pico-Injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>حضانة Torrey Pines Scientific ECHOtherm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>ماصة نقل</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط Dumostar #5</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (act) في الفحص القيطم المورق</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

العديد من البروتينات تلعب دورا مزدوجا في التطور الجنيني. يمكن لتلك التي تنظم تقرير مصير الخلية في الأنسجة محددة تؤثر أيضا على تطوير أكبر منطقة جنين. هذا ما يجعل تحديد دورها في نسيج خاص يجعل من الصعب تحليلها. على سبيل المثال ،<em&gt; رأس</em&gt; في overexpression<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة يؤدي التوسع في المنطقة الأمامية بأكملها ، بما في ذلك العين<sup&gt; 1،2</sup&gt;. من هذه النتيجة ، ليس معروفا ما إذا كان رأس يلعب دورا مباشرا في تحديد العين أو التي تسبب توسعا في الأنسجة العصبية ، ويؤثر بشكل غير مباشر تشكيل رأس العين. وجود هذا النمط الظاهري المعقدة تجعل الدراسة في العين الخاصة دور في تقرير مصير الخلايا الصعب تحليلها. طورنا مقايسة أن يتغلب على هذه المشكلة. الاستفادة من الطبيعة المحفزة لل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الحيوان قبعة<sup&gt; 3</sup&gt; ، طورنا مقايسة لاختبار قدرة المنتج الجين (ق) ، مثل<em&gt; رأس</em&gt; أو عوامل النسخ العين الميدان (EFTFs) ، لتحويل مباراة دولية في أنسجة معينة أو أنواع الخلايا عن طريق زرع هذا النسيج على الجانب الجنين<sup&gt; 4</sup&gt;. في حين أننا وجدنا معاملة إما بروتين رأس أو مجموعة من عوامل النسخ يمكن تحديد مصير الخلايا الشبكية في مباراة الحيوان ، يمكن أن تستخدم هذا الإجراء لتحديد الجين المنتج (ق) المشاركة في تحديد الأنسجة الأخرى كذلك.

يتم زرع الجينات الحيوانية القبعات overexpressing منتج (ق) إلى الجهة تطوير<em&gt; القيطم المورق</em&gt; أجنة من أجل تحديد ما إذا كان يتم تحديد الأنسجة.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

تلعب العديد من البروتينات دوراً مزدوجاً في النمو الجنيني؛ حيث يمكن لتلك البروتينات التي تنظم تحديد مصير الخلايا في نسيج معين أن تؤثر أيضاً على تطور...

يتمثل الهدف العام من مقايسة A CT في اختبار ما إذا كان جين أو مجموعة من الجينات المستهدفة يمكنها توجيه الأديم الظاهر البدائي نحو مصير خلوي محدد. تبدأ الإجراءات أولاً بالتعبير المفرط لـ RNAs التي ترمز لجين مراسل فلوري والجين أو الجينات المستهدفة في أجنة XUS lavis النامية. وتتمثل الخطوة التالية في تشريح القبعة الحيوانية أو القرص الجنيني البدائي الذي يعبر عن الـ RNAs المفرطة التعبير وتنميتها حتى المرحلة 15.تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إزالة الأنسجة من جانب جنين مضيف في المرحلة 15. أما الخطوة النهائية فهي نقل نصف أنسجة القبعة الحيوانية المانحة إلى جانب الجنين المضيف وتنمية المضيف حتى المرحلة 42 إلى 43. وتظهر النتائج تكون أنسجة منتبذة، مثل تراكيب شبيهة بالعين، وذلك من خلال عمل مقاطع نسيجية وإجراء صبغ مناعي لعلامات محددة للأنسجة.مرحباً، أنا وأند سين من قسم طب العيون في جامعة أبستيت الطبية. سأعرض لكم اليوم إجراءً نسميه مقايسة نقل القمة الحيوانية التي قمت بتطويرها بالتعاون مع مايك سوبر. نستخدم هذه المقايسة في كلا مختبرينا لدراسة الجينات الكافية لتكوين العين.فلنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير جزيئات الـ RNAs ذات القبعة (cap RNAs) للحقن عن طريق نسخ جين noggin أو أي جين آخر محل اهتمام، وجين YFP لاستخدامه ككاشف تتبع. قم أيضاً بتحضير المحاليل القائمة على MMR، ومحلول مخزون من محلول وضع البيض بتركيز 8x، والإبر المخصصة لحقن الأجنة.يُستخدم قالب مطاطي مُصنع خصيصاً لصنع أطباق احتجاز الأجنة. قم بتجهيز لوحة حقن واحدة لكل حالة تجريبية عن طريق صهر 1% AROS في 0.4 XMMR باستخدام الميكروويف. انقل حوالي ستة ملليلتر من المحلول إلى لوحة قياسها 60 مليمتر.ضع قالبًا من الإلاستومر برفق فوق المحلول لمنع تكون الفقاعات واتركه ليبرد لمدة 20 دقيقة تقريبًا. وفي درجة حرارة الغرفة، قم بتجهيز لوحة عزل غطاء واحدة لكل حالة تجريبية، باستخدام 1%AGROS بالإضافة إلى 0.7 XMMR مع القوالب كما تم توضيحه سابقًا للوحات الحقن. جهّز لوحات إضافية لكل نقطة زمنية.راجع البروتوكول المكتوب المرفق للحصول على تفاصيل حساب النقاط الزمنية. بعد ذلك، قم بعزل الأنسجة. اختبر هذه الأنسجة من ضفدع ذكر وخزن النسيج عند درجة حرارة 4 °C في محلول معقم من 1XMMR مدعم بـ 50 µg/mL من Gentamycin.يمكن القيام بذلك قبل بدء التجربة بمدة تصل إلى أسبوع، ولكن يرجى ملاحظة أن الحيوانات المنوية تفقد فعاليتها بمرور الوقت، وتحديداً في وقت متأخر من اليوم السابق لعملية الحقن المجهري. يتم حقن الإناث بـ 500 units من human chorionic gonadotropin. ثم تُوضع الإناث في درجة حرارة تتراوح بين 16 إلى 18 degrees Celsius طوال الليل.الآن أصبح كل شيء جاهزاً للحقن المجهري في اليوم التالي. ابدأ بإخراج الإناث التي تم تحفيزها هرمونياً ووضعهن في أحواض فردية تحتوي كل منها على XELS واحد. قم بتجهيز الإبرة المخصصة للحقن المجهري عن طريق قص الطرف.للحصول على قطر يتراوح بين 25 إلى 35 ميكرومتر، ضع الإبرة في الحاقن الدقيق PLI 100 وقم بمعايرته بحيث يضخ 10 نانولتر في كل عملية حقن. اضبط الحاضنة على درجة حرارة 14 درجة مئوية عن طريق وضع المخرج في هذه درجة الحرارة المنخفضة بعد حقنها بـ RNA، حيث يتباطأ تطور الجنين مما يسمح بإجراء المزيد من عمليات النقل في تجربة واحدة. قبل الإخصاب بنحو ساعة، أخرج البيض من الحوض. وبمجرد أن تضع الإناث البيض لمدة ساعة إضافية، استخدم ماصة نقل لإزالة البيض الموضوع حديثاً من الحوض.ملاحظة: تجنب استخدام البويضات التي بقيت في محلول ELS لأكثر من ساعتين. وبما أن جودة البويضات تتناقص، ضع البويضات في أطباق بتري بقطر 60 مليمتر. يجب أن يكون الطبق ممتلئاً بنسبة 80% تقريباً بطبقة واحدة من البويضات.قم بإزالة أكبر قدر ممكن من سائل ELS من البويضات واستبدله بـ XMMR واحد. يمكن للبويضات أن تبقى في XMMR واحد لمدة تصل إلى ساعة واحدة. بعد ذلك، قم بتخصيب البويضات في المختبر باستخدام خصى متجانسة.يُفضل تخصيب الأجنة في ثلاث دفعات منفصلة في حوالي الساعة 11:00 صباحاً والظهر والساعة 1:00 مساءً لضمان نموها إلى المرحلة المطلوبة؛ من 8.5 إلى تسعة لعزل الغطاء (cap isolation)، والمرحلة 15 لعملية الزرع. وبعد ساعة من تخصيب البيض، قم بإزالة الغلاف الهلامي عن البيض باستخدام محلول D jelly، ثم اغسله بكميات وفيرة من 0.1 XMMR، وبعد ذلك انتظر حتى تصل البيوض المخصبة إلى مرحلة الخليتين.لبدء عملية الفرز، قم بتحضير طبق حقن مملوء بـ 0.4 XMMR مضافاً إليه 6%F ccal. وبمجرد وصول الأجنة إلى مرحلة الخليتين، استخدم ماصة نقل لفرز الأجنة ذات التصبغ الموحد والانقسام المتساوي ووضعها في فجوة طبق الحقن.انتقل إلى الحقن المجهري؛ أولاً قم بمد غشاء رقيق فوق غطاء طبق بتري بقطر 60 مليمتر. وباستخدام الماصة، ضع 2 µL من عينة RNA على الغشاء الحيوي ثم اسحبها. استخدم جهاز الحقن المجهري (pico injector) لملء إبرة الحقن.تأكد من أن الإبرة لا تزال تضخ 10 liters من العينة قبل البدء في الحقن. يتم حقن RNA في كلا القاذفتين عبر جنين في مرحلة الخليتين. احقن من 20 إلى 30 جنيناً، بحيث يتلقى كل منها 500 picograms من Y-F-P-R-N-A، ثم ضعها في طبق واحد.قم بحقن 20 إلى 30 جنينًا آخرين، بحيث يحصل كل منها على 20 picograms من Nain, RNA المخلوط مسبقًا مع Y-F-P-R-N-A، ثم ضعهم في طبق. بالإضافة إلى ذلك، ضع من 100 إلى 200 جنين غير محقون لكل نقطة زمنية في طبق حقن آخر يحتوي على محلول FICO. انقل هذه الأجنة إلى الحاضنة وإخراجها منها في نفس وقت نقل الأجنة المحقونة.هذه هي العوائل التي ستُستخدم لنقل القبعات بعد الحقن. يتم تحضين جميع الأجنة عند 14 degrees Celsius طوال الليل. تُكرر هذه العملية لجميع النقاط الزمنية المخطط لها.بعد فترة التحضين طوال الليل، يمكن عزل غطاء الجنين (animal cap). يجب الحضور في الصباح الباكر لتحديد مرحلة الأجنة. تذكر أيضًا إخراج الأجنة المضيفة غير المحقونة من الحاضنة.يجب أن تكون أبكر نقطة زمنية عند المرحلة التاسعة. أولاً، قم بإزالة الأجنة التي لم تنجُ. ثم انتقل إلى عزل القبعات الحيوانية من الأجنة القابلة للحياة، مع العمل على كل نقطة زمنية في مجموعات ضمن طبق عزل القبعات.أضف كمية وافرة من محلول 0.7 XMMR مضافاً إليه Gentamycin. بعد ذلك، قم بسكب محلول fol من كل طبق يحتوي على الأجنة المحقونة، وأضف مجدداً محلول 0.7 XMMR مضافاً إليه Gentamycin. قم بإخراج الأجنة من آبار طبق الحقن باستخدام ماصة نقل، وضعها في طبق عزل الأغطية الذي تم تحضيره حديثاً.استخدم إما أداة gastro master المزودة بطرف أصفر مثني بمقدار 400 micrometers أو زوجاً من الملاقط الحادة رقم خمسة لعزل القبعات الحيوانية في محلول 0.7 XMMR مضافاً إليه Gentamycin. احتفظ بجنينين أو ثلاثة أجنة سليمة لتحديد المرحلة العمرية. بعد عزل القبعات الحيوانية، أعدها إلى الحاضنة عند درجة حرارة 14 degrees Celsius جنباً إلى جنب مع الأجنة المضيفة حتى اليوم التالي، حيث يتم نقل القبعات إلى جانب الأجنة المضيفة.أخرج الأغطية والأجنة المضيفة من النقطة الزمنية الأولى من الحاضنة عند درجة حرارة 14 degrees Celsius، وقم بتحديد مرحلة الأجنة وفرز الأغطية ذات التألق الموجب الموحد. احصِ عدد الأغطية ثم قم بإزالتها. انقل ضعف عدد الأجنة المضيفة إلى طبق حقن مُجهز حديثاً يحتوي على محلول 0.7 XMMR مضافاً إليه Gentamycin باستخدام ملقط حاد رقم خمسة.قم بإزالة غشاء Lene من كل جنين مضيف. ثم انقلهم إلى الطبق الذي يحتوي على الأغطية، مع توخي الحذر بسبب فقدان أغشية Lene. يمكن للأجنة أن تتفكك بسرعة عند سطح الماء، لذا استخدم gastro master مزوداً بطرف أصفر يحتوي على سلك منحني بقطر 200 إلى 250 micrometer على أعلى إعداد، أو استخدم ملقط رقم خمسة.قم بإزالة مربع بمساحة 200 ميكرومتر من جانب الجنين في المرحلة 14 إلى 15. ثم باستخدام gastro master أو ملقط رقم خمسة مرة أخرى، قم بقص السدادة (cap) إلى نصفين وضع النسيج في الفتحة التي تم صنعها في الجنين المضيف.قم بتدوير الجنين مقابل جدار البئر للسماح بالتئام الجرح. كرر هذه العملية لأكبر عدد ممكن من الأجنة بينما تكون في المرحلة 15. كرر ذلك لجميع النقاط الزمنية.عادةً ما يلتئم الجنين في غضون 30 دقيقة. وباستخدام ملقط رقم خمسة، قم بإزالة الخلايا الميتة التي تظهر باللون الأبيض من خلال حركة مسح لطيفة. يتم تحضين الأجنة المنقولة عند درجة حرارة 18 درجة Celsius طوال الليل.بعد الحضانة طوال الليل، يتم العمل باستخدام المجهر التشريحي الفلوري لفرز الأجنة التي تحتوي على أنسجة منقولة وموسومة فلورياً. تُعاد الأجنة المختارة إلى درجة حرارة 18 درجة مئوية لتنمو حتى المرحلة 42 إلى 43. وعندما تصل الحيوانات إلى المرحلة المطلوبة، يتم تخديرها باستخدام الـ trica وفحصها تحت المجهر التشريحي الفلوري والتقاط الصور.يمكن بعد ذلك تثبيت الأجنة المنقولة وتقطيعها وإجراء صبغ مناعي لها، أو يمكن إجراء تهجين موضعي باستخدام واسمات لنسيج معين محل الاهتمام. وفيما يلي نتائج نموذجية لشرغوف مضيف يحتوي على نسيج مانح يعبر عن مقتف فلوري وnoggin بعد يوم واحد من عملية النقل. لاحظ كيف يتكتل النسيج على جانب الشرغوف.تبدأ الأجنة المضيفة التي استقبلت نسيجاً مانحاً ضابطاً يعبر فقط عن المقتفي الفلوري بالفعل في دمج خلايا القبعة الحيوانية على جانبها. وبعد بضعة أيام، تشكل الشراغيف التي استقبلت خلايا مانحة تعبر عن nain تراكيب تشبه العين على جانبها، بينما تمتلك الشراغيف التي استقبلت النسيج المانح الضابط خلايا فلورية على سطح جلدها. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء اختبار نقل القبعة الحيوانية في Zaps Lavis.عند إجراء هذا المقايسة، من المهم تذكر تحضير كل شيء مسبقاً قبل البدء في إجراءات ذلك اليوم، حتى لا تتطور الأجنة بسرعة تتجاوز قدرتك على التعامل معها. وهذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

القيطم ظهائر الجنينية هي نموذج مثالي لنظام دراسة سلوكيات الخلية مثل التنمية وتغير شكل القطبية خلال التشكل الظهارة. ويتزايد الأنسجة التقليدية لعينات محددة يجري استكمالها التصوير الخلية الحية مبائر. هنا نظهر طرق لعزل الأنسجة الضفادع وتصور الخلايا الظهارية العيش والهيكل الخلوي وذلك باستخدام الخلايا الحية المجهري متحد البؤر.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

القيطم المورق يوفر نظام نموذجا مثاليا لدراسة الخلية مواصفات مصير وظيفة فسيولوجية لخلايا شبكية العين الفردية في الثقافة الخلية الأولية. هنا نقدم تقنية لتشريح الأنسجة الشبكية وتوليد الثقافات الخلية الأولية التي يتم تصويرها للنشاط الكالسيوم وتحليلها بواسطة التهجين في الموقع.

تشريح والثقافة، وتحليل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأنسجة الجنينية الشبكية

تقنية لزرع "المتطرفة الأمامي المجال" بين أنسجة الوجه القيطم المورق وقد تم تطوير الأجنة. يمكن نقل الأنسجة من احد خلفية التعبير الجيني إلى أخرى، والسماح للدراسة المتطلبات المحلية للتنمية والقحفي للانزعاج التفاعلات بين مناطق الوجه.

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

مخطوطة يوفر هنا مجموعة بسيطة من طرق لتحليل إفراز ونشر بروابط الموسومة fluorescently في القيطم. ويوفر هذا السياق لاختبار قدرة بروتينات أخرى لتعديل توزيع يجند والسماح التجارب التي قد تعطي نظرة ثاقبة آليات تنظيم التدرجات محدثة التخلق.

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

في أجنة Xenopus ، تكون الخلايا من سقف الأريمية متعددة القدرات ويمكن برمجتها لتوليد أنسجة مختلفة. هنا ، نصف بروتوكولات استخدام مصانع سقف الأريمة البرمائية كنظام فحص للتحقيق في الميزات الرئيسية في الجسم الحي وفي المختبر للتطور العصبي المبكر.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

نصف بويضة Xenopus ونظام غطاء حيواني للتعبير عن استنساخ الجينات القادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختص ، ونناقش تقنيات التحليل اللاحق لهذه الجينات. هذا النظام مفيد في التحديد الوظيفي لمجموعة واسعة من المنتجات الجينية.

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

تقدم هذه المقالة طريقة مريحة وسريعة لتصور مختلف السكان الخلية العصبية في الجهاز العصبي المركزي للأجنة القيطم باستخدام مناعي تلطيخ على أقسام.

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق المناعية

يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة التنمية القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي .

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

وصفنا بروتوكولا لزرع الأجانب في صفار أجنة الزرد الشفافة التي يتم تحسينها بطريقة مرحلية بسيطة وسريعة. تشمل تحليلات ما بعد الحقن البقاء على قيد الحياة وتقييم عبء المرض للخلايا المزروعة بالأجانب عن طريق قياس التدفق الخلوي.

طريقة بسيطة وسريعة وفعالة لتحليل زراعة الأعضاء في الأورام في أجنة الزرد الشفافة

هذا هو الجزء الأول من بروتوكول أخذ عينات Xenopus الشامل. الأنسجة التي تم أخذ عينات منها هي بطين القلب ، والجذع الشرياني ، وفص الكبد الأيسر ، والمرارة ، والرئة ، والبنكرياس ، والطحال ، والحنجرة ، والمريء ، والمعدة ، والأمعاء ، والخصيتين ، والأجسام الدهنية ، وقناة البيض ، والكلى المزدوجة ، والضفيرة الوركي ، والجلد ، والغدة الصعترية ، والعين الكاملة.

تقنيات فعالة لأخذ عينات شاملة من الأنسجة التي يمكن الوصول إليها في Xenopus البالغين

تعلم تقنية زرع رسملة الحيوان لتحديد مصير الأنسجة في أجنة Xenopus laevis باستخدام التعبير الزائد للجينات والتتبع الفلوري. تُظهر النتائج تكوين أنسجة خارجية مثل البنى الشبيهة بالعين.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق

استكشف المزيد من الفيديوهات