الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

يوضح هذا البروتوكول طريقة المعلوماتية الحيوية بالفيديو لقياس نمو مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تحليل مقاطع الفيديو ذات الفاصل الزمني التي تم جمعها في حاضنة التصوير المقطعي المحوسب للمحطة الحيوية ، المجهزة بكاميرا لتصوير الفيديو. يتم استزراع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو مستعمرات HESC إلى 70٪ من الطلاقة المشتركة ، وإعادة طلاءها واحتضانها لمدة 48 ساعة ، وبعد ذلك يتم تصوير مستعمرات HESC لمدة 48 ساعة إضافية في Biot ct. يتم تحديد معدل النمو باستخدام وصفات تحسين وقياس التجزئة المطورة باستخدام برنامج CL الكمي.

يتم التحقق من صحة الوصفات بالمقارنة مع Adobe Photoshop ، وهي أداة لتحليل الصور تتيح تركيب القناع اليدوي الدقيق لكل مستعمرة. يمكن استخدام المجال الناشئ للمعلوماتية الحيوية للفيديو لأتمتة معالجة البيانات البيولوجية وتحليلها وتعدينها من مقاطع الفيديو المجهرية. مرحبا ، أنا سيرينا لين من مختبر الدكتور برو تالبوت في قسم بيولوجيا الخلية وعلم الأعصاب هنا في جامعة كاليفورنيا ريفرسايد.

مرحبا ، أنا شون فينو ، أيضا من Talbot Lab. مرحبا ، أنا TI Satish من برنامج الدراسات العليا في البيولوجيا الجزيئية والتنموية الخلوية. سنوضح لك اليوم كيفية قياس نمو مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية بالفيديو.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لقياس آثار المواد السامة البيئية على سلوك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. سنعرض هذا الإجراء في منشأتنا الأساسية الجديدة للخلايا الجذعية. لذلك دعونا نبدأ.

لإعداد HESC لتحليل الفيديو ، قم بزراعة HESC على ستة ألواح بئر مطلية ب matrigel حتى 70٪ وسط شفط ملتقى من بئر واحد يحتوي على HESC وشطفه مرتين بمليلتر واحد من PBS. أضف ملليلترا واحدا من Accutane واحتضنه لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، أضف 10 إلى 12 حبة زجاجية في البئر ورج الطبق برفق حتى تنفصل المستعمرات تماما.

تحييد Accutane باستخدام مليلتر واحد من صيانة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، أو وسط مكيف للأرومات الليفية الجنينية أو الفأرية. اجمع الخلايا المنفصلة بدون الخرزات في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 200 جم لمدة ثلاث دقائق. صب SUP natant وكسر الحبيبات ب 500 ميكرولتر من وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الطازجة أو لوحة M-T-E-S-R 100 ميكرولتر من تعليق HESC بالتنقيط في آبار متعددة من صفيحة مطلية ب 12 بئر.

هز اللوحة ذهابا وإيابا برفق وراقب الثقافات تحت المجهر الضوئي لجعل كتل الخلايا موزعة بالتساوي في جميع أنحاء الآبار. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة لضمان توصيل الخلايا بشكل مسطح وكبير بما يكفي لتخيل بسهولة. بعد 48 ساعة ، قم بشفط الوسط واغسل الآبار ب 500 ميكرولتر من PBS لإزالة الخلايا غير المتصلة ، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط M-T-E-S-R لكل منها.

حسنا ، ضع اللوحة على الفور في Biot CT وابدأ في جمع صور الفاصل الزمني. حاول تحديد الحقول ذات المستعمرات المفردة السرية التي من غير المحتمل أن تنمو في مستعمرات أخرى. في هذا البروتوكول ، يتم تسجيل الخلايا بالفيديو لمدة 48 ساعة إضافية مع إطارات كل سبع دقائق.

لإنشاء وصفة التجزئة أولا، امسح الفيديو بأكمله يدويا للتحقق من احتوائه على مستعمرة واحدة تظل مركزة طوال فترة التسجيل. بعد ذلك ، افتح معالج التجزئة في برنامج CL quants وانقر فوق الزر التالي. حدد قناة الصورة الصحيحة وانقر فوق الزر التالي.

اختر مطابقة ناعمة وانقر فوق التالي. حدد منطقة أو منطقتين تريدان عن طريق تدوير الحافة الخارجية إلى المنطقة المركزية للمستعمرة. يجب أن تكون هذه المنطقة صغيرة قدر الإمكان ، ولكن يجب أن تكون ممثلة للمستعمرة بأكملها.

لا تختار الكثير من المناطق لأن هذا قد يؤدي إلى تطبيق قناع غير دقيق. انقر فوق الزر التالي. حدد لا تريد المناطق عن طريق الدوران حول المناطق التي ليست جزءا من المستعمرة وليست جزءا من الخلفية.

تحتوي هذه المناطق على أنماط يجب قمعها ، مثل الحطام والخلايا الميتة. انقر فوق التالي. حدد الخلفية عن طريق الدوران حول المناطق التي ليست مستعمرات أو حطاما أو خلايا ميتة.

يجب أن تكون الخلفية موحدة ومن المحتمل أن تظهر في كل إطار. عادة ، نختار الخلفية الرمادية حول المستعمرة. انقر فوق الزر التالي.

يجب عرض قناع ملون فوق منطقة الاهتمام إذا كان القناع لا يغطي بدقة منطقة الاهتمام. قد يتم زيادة نطاق عتبة التجزئة في الزاوية اليمنى السفلية من الشاشة أو تقليله إذا كانت هناك حاجة إلى تغيير القناع. حدد مناطق المطابقة الناعمة للتحديثات.

هذا يسمح بتغيير مناطق الرغبة في عدم الرغبة أو الخلفية. إذا كان القناع مرضيا، فحدد تطبيق الحد واحفظ القناع. ثم انقر فوق الزر التالي.

سيتم عرض القناع بعد ذلك بلون مختلف. حدد إنهاء. يجب عرض الوصفة في الزاوية العلوية اليمنى من البرنامج كوصفة تجزئة.

أعد تسمية الوصفة إذا رغبت في ذلك عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن وإدخال اسم جديد. لتطبيق الوصفة. انقر بزر الماوس الأيمن وضع الماوس.

تطبيق الوصفة. ستظهر قائمة تسمح بتحديد عدد الإطارات المراد استخدامها. اضبط الفاصل الزمني للإطار على كل 20 إطارا لضمان دقة القناع.

تحقق بشكل عشوائي من الإطارات التي تم تطبيق القناع عليها يدويا لإنشاء وصفة تحسين تقضي على المناطق غير المرغوب فيها في الحطام. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مجلد وصفة التحسين ثم انقر فوق جديد. يجب عرض وصفة تحسين جديدة من مجال الرؤية الأصلي.

حرك الماوس فوق الرموز الموجودة في شريط الأدوات لتحديد زر وحدة تحسين التبديل الموجود على يمين الصورة وانقر فوقه. حدد القائمة المنسدلة لوضع العلامات. حدد التسمية للاتصال حدد التسمية لاثنين متصلين.

يجب عرض شريط مهام جديد. احصل على القناع الأولي من وصفة التجزئة واسحبه إلى مربع الإدخال. يجب أن يعرض الشريط الآن رقم قناع الإدخال.

اسحب الرمز الذي يحتوي على رقم قناع الإدخال إلى أيقونة القناع صفر. ابحث عن الحد الأدنى للحجم في شريط المهام واضبط الرقم حتى يتم عرض منطقة الاهتمام فقط. تأكد من النقر فوق تنفيذ لكل تجربة مناسبة.

بمجرد أن يكون الحد الأدنى لتعديل الحجم مرضيا ، انقر فوق وصفة التحسين السابقة في أسفل الشاشة ، وحدد حفظ في الوصفة. يطالب البرنامج الآن بالكتابة فوق الوصفة المحددة وتحديد نعم بقعة. تحقق من وصفة التحسين باستخدام نفس إجراء تجزئة التدقيق الموضعي.

إذا كنت راضيا عن وصفات التجزئة والتحسين، فتابع إنشاء قالب القياس. لبدء التحديد، قم بإنشاء قالب قياس على شريط الأدوات الأيمن. في نافذة القياس، حدد تحريك المؤشر فوق شكل خلية القصاصة الفنية.

اضغط مع الاستمرار على مفتاح التحكم وحدد الخلية ضمن قسم التشكل ، وقم بإلغاء تحديد المعلمة الافتراضية وتحقق من معلمة المنطقة. ثم اخرج من نافذة القالب. حدد الرمز.

إنشاء وصفة قياس. أعد تسمية الوصفة. الانتقال إلى علامة تبويب القالب وتحديدها في الزاوية العلوية اليسرى، اسحب قالب القياس الذي تم إنشاؤه مسبقا وأفلته في نافذة القياس.

انقر فوق نعم للمتابعة في نافذة وصفة القياس، وحدد تعيينات القنوات. ثم حدد الخلية بأكملها تعيينات القناع. ثم حدد خيار الخلية الكاملة للقناع المحسن ، حدد وصفة القياس ضمن علامة تبويب الوصفة.

في النافذة الرئيسية ، حدد أيقونة الحفظ داخل نافذة وصفة القياس. ثم أغلق النافذة بعد ذلك ، أغلق وأعد فتح مجال الرؤية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مجلد قائمة الوصفات ثم انقر فوق وصفات سحب جديدة بترتيب التطبيق الضروري في قائمة الوصفات ، وحدد قائمة الوصفات ، وقم بتشغيل الوصفات بالتتابع على بيانات الفيديو باستخدام Adobe Photoshop.

تم تحليل كل إطار 20 من نفس المستعمرات. افتح إطارا لصورة مستعمرة يدويا في Adobe Photoshop. انقر فوق أداة العصا السحرية في شريط الأدوات.

انقر فوق المنطقة المحيطة بالمستعمرة بحيث يتم تغطية الحقل بأكمله باستثناء منطقة المستعمرة. تأكد من أن الخط المنقط حول المستعمرة يناسب محيط المستعمرة وليس داخلها. إذا لم يكن الخط المنقط حول المحيط، فقم بتغيير قيمة التفاوت في شريط الأدوات العلوي وفقا لذلك.

انقر فوق تحرير في وضع القناع السريع في شريط الأدوات وانقر فوق المستعمرة حتى يتم تحديد المستعمرة. انتقل إلى النافذة ، واسحب القائمة لأسفل وانقر فوق الرسم البياني. يجب تعيين ذاكرة التخزين المؤقت إلى واحد.

إذا كانت ذاكرة التخزين المؤقت اثنين، فانقر فوق علامة التعجب على التعبير لتغيير ذاكرة التخزين المؤقت إلى واحدة. سجل قيمة البكسل في جدول بيانات. كرر العملية المذكورة أعلاه لكل إطار 20.

يمكن بعد ذلك رسم البيانات التي تم جمعها باستخدام برنامج Photoshop و CL quant معا. يوضح بروتوكولنا لقياس نمو مستعمرة HESC تطبيقا واحدا للمعلوماتية الحيوية بالفيديو لمشكلة بيولوجية. نعرض هنا رسما بيانيا يقارن الزيادة في حجم المستعمرة على مدار 48 ساعة على النحو المحدد باستخدام برنامج CL الكمي و Adobe Photoshop.

يوضح الرسم البياني خمس مستعمرات مختلفة تم تحليل كل منها بواسطة حزمتي البرامج. يتم تمثيل كل مستعمرة بلون مختلف. تم اشتقاق الخطوط الصلبة باستخدام برنامج الشراع الكمي بينما تم جمع الخطوط المنقطة باستخدام Photoshop.

يوضح الرسم البياني للبيانات الأولية أن كلتا طريقتي القياس متفقتان جيدا لتفسير حقيقة أن المستعمرات لها حجم بداية مختلف. يوضح هذا الشكل البيانات المعاد رسمها كنسبة مئوية للزيادة في حجم المستعمرة. معدلات النمو متشابهة بغض النظر عن حجم المستعمرة المبكرة وكلا مقياسي التحليل يعطيان نتائج متشابهة.

يعرض الرسم البياني التالي وسائل بيانات التغيير المئوية السابقة لنمو مستعمرة HESC. يوضح هذا الرسم البياني بوضوح اتفاقا جيدا بين التحليل الذي تم إجراؤه باستخدام المعلوماتية الحيوية للفيديو وAdobe Photoshop. لقد أوضحنا لك للتو كيفية قياس نمو مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية بالفيديو.

عند القيام بهذا الإجراء باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور ، تأكد من تضمين الهالة حول المستعمرة لاختيار المستعمرة بدقة بواسطة البرنامج. من المهم أيضا أن تتذكر أنه يمكن استخدام طرق أخرى للثقافة والحضانة وجمع الفيديو بدلا من البروتوكول الذي أظهرناه. بمجرد تطوير الوصفات والتحقق من صحتها ، ستقوم بإجراء التحليل بسرعة أكبر بكثير وباختلاف تجريبي أقل من التحليل اليدوي.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.