تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح طرق التصوير الحي والتقدير الكمي البسيط لتحليل مورفولوجيا الخلايا الظهارية الجنينية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تجهيز جميع الأدوات والأجهزة اللازمة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في استئصال X explan من أجنة الضفادع ووضعها في غرف للزراعة طويلة الأمد.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في جمع صور عالية الدقة للخلايا الطلائية في الوقت الفعلي. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في قياس التفاصيل المورفولوجية للخلايا الطلائية باستخدام برنامج Image J. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر مساحات الخلايا المتبعة وكثافة الغشاء من خلال المجهر البؤري عالي الدقة. مرحباً، أنا Sagar Joshi من مختبر Davidson في قسم الهندسة الحيوية بجامعة Pittsburgh.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير الحي للخلايا والتحليل الكمي للخلايا الظهارية الجنينية لـ Xenos lavia. نستخدم هذا الإجراء لدراسة التغيرات في الهيكل الخلوي للخلايا في الوقت الفعلي. لذا، دعونا نبدأ.

لتحضير غرف استزراع القبعات الحيوانية، استخدم الشحم السيليكوني لإغلاق غرفة أكريليك مخصصة أو حلقة نايلون صغيرة على غطاء زجاجي كبير بمقاس 45 by 50 millimeter. أضف 1 mL من 1%BSA في ثلث XMBS إلى الغرفة. قم بطلاء شظايا صغيرة من شرائح الغطاء بنفس المحلول واتركها في الحاضنة لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل في درجة حرارة 4 °C.

لتقليل التصاق شرح X بالزجاج، اشطف الحجرة واملأها بوسط DFA، وقبيل نقل The xs مباشرة، اشطف شظايا الغطاء الزجاجي بنفس الطريقة. بعد ذلك، اغمرها في طبق من أجنة مزارع DFA التي تم حقنها مجهرياً في مرحلة الخلية الواحدة إلى أربع خلايا بـ MR NA المطلوب وصولاً إلى المرحلة المطلوبة في ثلث XMBS. استخدم ماصة نقل ذات فتحة مائلة لنقل الأجنة إلى طبق من DFA تحت مجهر ستيريو تشريحي.

استخدم الملاقط لاستئصال سدادة القطب الحيواني من الأجنة. استخدم حلقة شعر لتثبيت الجنين في وضعية واحدة. استخدم سكين شعر لإجراء شق صغير في القطب الحيواني.

قم بإجراء قطع خاطفة وسلسة ومتكررة لتوسيع الشق وإزالة الأديم الظاهر للقلنسوة. استأصل ثلاث أو أربع مستنبتات بنفس الطريقة. واستخدم ماصة نقل لنقلها إلى غرفة الزرع المجهزة.

باستخدام حلقة الشعر، ضع كل X explan بحيث تكون الظهارة مواجهة لقاع الحجرة. وباستخدام الملقط، أمسك قطعة من غطاء الشريحة من مركزها.

اغمس النهايات في شحم السيليكون. ضع شظية واحدة فوق كل X explan. ثبت كل شظية في مكانها برفق باستخدام كميات صغيرة من شحم السيليكون.

مع الحرص على عدم كسر X explan بقوة مفرطة تماماً. املأ الحجرة بـ DFA وقم بتغطية الحواف العلوية للحجرة بالشحم السيليكوني. ثم أغلق الجزء العلوي باستخدام شريحة غطاء بمقاس 24 x 40 millimeter.

اضبط مستوى الـ DFA داخل الحجرة لتقليل الفقاعات الهوائية، واستخدم مناديل ورقية لتجفيف أي فائض. يمكن الآن زراعة نباتات X لفترة طويلة في الحجرة المختومة لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بوضع العدسة الشيئية 20x للمجهر البؤري (confocal microscope) في مكانها. ضع الحجرة التي تحتوي على X explan على منصة المجهر، وضع أوزان موازنة صغيرة على الحجرة لتثبيتها في موضعها تحت الحقل المضيء (bright field).

اضبط التركيز واستخدم وضعية التحديد الرأسي (course positioning) لتصوير النهايات القمية للخلايا السطحية. انتقل إلى وضع الفلورة واستخدم عدسة شيئية ذات قوة تكبير أعلى. ولجمع صور مفردة أو مقاطع فيديو بنظام التصوير الزمني (time-lapse) للظهارة المفروشة، قم بضبط إعدادات الالتقاط للحصول على أفضل صورة ممكنة.

يرجى الرجوع إلى الجزء المكتوب من هذا البروتوكول للحصول على نصائح حول الضبط والتصوير. حافظ على قدرة الليزر عند أدنى مستوى ممكن. قم بالتقاط صور أو مقاطع فيديو بنظام التصوير الزمني (time-lapse) لظهارة x explan.

يرجى الرجوع إلى الجزء المكتوب من البروتوكول للحصول على مقترحات بشأن جمع البيانات. يمكن استخراج البيانات من ملفات الصور المجهرية البؤرية (Confocal) بطرق متنوعة. فيما يلي مثالان على كيفية تحليل ملفات البيانات باستخدام برنامج تحليل Image J مع ملحق bio formats.

لقياس مساحة خلية طلائية، قم بفتح قائمة التحليل (analyze) وانقر فوق تعيين القياسات (set measurements). اختر أداة التحديد من شريط الأدوات وحدد محيط الخلية، ثم من قائمة التحليل، اختر الأدوات (tools)، وبعد ذلك مدير مناطق الاهتمام (ROI manager). لفتح مدير مناطق الاهتمام، اضغط على control t.

لإضافة المخطط التفصيلي إلى مدير المناطق ذات الاهتمام (ROI manager)، حدد وأضف أي عدد ترغب به من المخططات التفصيلية من الصورة. ثم انقر فوق "حفظ" (save) لحفظ مجموعة المناطق ذات الاهتمام في مدير المناطق ذات الاهتمام. انقر فوق "قياس" (measure).

ستظهر الآن نافذة النتائج المساحات المقاسة لكل منطقة اهتمام (ROI). ولقياس كثافة الغشاء الخلوي، اختر أداة الخط المستقيم من شريط أدوات Image J، ثم ارسم خطاً عمودياً عبر الغشاء.

اضغط على CTRL T كما في المثال السابق. ولإضافة التحديد إلى مدير منطقة الاهتمام (ROI manager)، قم بفتح قائمة التحليل (analyze) وانقر على رسم المخطط البياني (plot profile) لإنشاء مخطط للشدات النسبية عبر الخط. ولحفظ الرسم البياني كصورة، انقر على حفظ (save) في نافذة المخطط الجديدة التي تظهر.

قم بسحب القائمة المنسدلة إلى ملف، ثم اختر حفظ باسم. لقد عرضنا لك للتو كيفية التصوير الحي والقياس الكمي للخلايا الظهارية الجنينية من مستأصلات CapEx الحيوانية. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إضافة المضاد الحيوي والمضاد الفطري إلى DFA. ولمنع النمو البكتيري والفطري، توخَّ الحذر الشديد عند ضغط المستأصلات تحت أغطية الشرائح، لأن الضغط الزائد عن الحد المطلوب قد يؤدي إلى سحق المستأصل.

من المهم أيضاً تذكر ضبط الإعدادات المثلى للمجهر البؤري (confocal microscope) للحصول على بيانات صور بأعلى جودة ممكنة. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.