JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق

Full Text

15,255 Views

06:51 min

May 23, 2010

DOI: 10.3791/1949-v

Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering,University of Pittsburgh, ²Developmental Biology,University of Pittsburgh

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

القيطم ظهائر الجنينية هي نموذج مثالي لنظام دراسة سلوكيات الخلية مثل التنمية وتغير شكل القطبية خلال التشكل الظهارة. ويتزايد الأنسجة التقليدية لعينات محددة يجري استكمالها التصوير الخلية الحية مبائر. هنا نظهر طرق لعزل الأنسجة الضفادع وتصور الخلايا الظهارية العيش والهيكل الخلوي وذلك باستخدام الخلايا الحية المجهري متحد البؤر.

Transcript

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار التصوير الحي وطرق القياس الكمي البسيطة لتحليل مورفولوجيا الخلايا الظهارية الجنينية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجهيز جميع الأدوات والأجهزة أولا. الخطوة الثانية من الإجراء هي استئصال X explan من أجنة الضفادع وإيوائها في غرف للاستزراع على المدى الطويل.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في جمع صور عالية الدقة للخلايا الظهارية في الوقت الفعلي. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تحديد التفاصيل المورفولوجية للخلايا الظهارية باستخدام Image J. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر مناطق الخلايا المتعقبة وشدة الغشاء من خلال الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة. مرحبا ، أنا ساجار جوشي من مختبر ديفيدسون في قسم الهندسة الحيوية بجامعة بيتسبرغ.

سنعرض لك اليوم إجراء لتصوير الخلايا الحية والتحليل الكمي للخلايا الظهارية الجنينية Xenos lavia. نستخدم هذا الإجراء لدراسة تغيرات الهيكل الخلوي للخلية في الوقت الفعلي. لذلك دعونا نبدأ.

لتحضير غرف لزراعة أغطية ، استخدم شحم السيليكون لإغلاق غرفة أكريليك مخصصة أو غسالة نايلون صغيرة بغطاء زجاجي كبير مقاس 45 × 50 ملم. أضف ملليلتر واحدا من 1٪ BSA في ثلث XMBS إلى الغرفة. قم بتغطية شظايا انزلاق الغطاء الصغيرة بنفس المحلول في الحضانة لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

لتقليل التصاق X explan بالزجاج ، اشطف الغرفة واملأها بوسط DFA حتى قبل النقل مباشرة في xs ، اشطف شظايا انزلاق الغطاء بنفس الطريقة. ثم اغمرهم في طبق من أجنة ثقافة DFA التي تم حقنها بشكل دقيق في مرحلة الخلية الواحدة إلى أربع خلية مع MR NA المطلوب إلى المرحلة المطلوبة في ثلث XMBS. استخدم ماصة نقل ذات فتحة مائلة لنقل الأجنة إلى طبق DFA تحت مجهر استريو تشريح.

استخدم الملقط لإزالة الأجنة لاستئصال نبات النفقات الرأسمالية الحيوانية. استخدم حلقة شعر لدعم الجنين في وضع واحد. استخدم سكين شعر لعمل شق صغير في عمود.

قم بعمل قطع ناعمة متكررة لتمديد الشق وإزالة الأديم الظاهر للغطاء. المكوس ثلاثة أو أربعة × explan بنفس الطريقة. واستخدم ماصة النقل لنقلها إلى غرفة الاستزراع المعدة.

باستخدام حلقة الشعر ، ضع كل X explan بحيث تواجه الظهارة قاع الغرفة. باستخدام ملقط. امسك جزء زلة الغطاء في وسطه.

اغمس الأطراف في شحم السيليكون. ضع جزءا واحدا فوق كل X explan. قم بتثبيت كل جزء برفق في مكانه باستخدام لمسات صغيرة من شحم السيليكون.

الحرص على عدم تحطيم X explan بقوة مفرطة تماما. املأ الغرفة ب DFA ، وقم بتغطية الحواف العلوية للغرفة بشحم السيليكون. ثم أغلق الجزء العلوي بزلة غطاء مقاس 24 × 40 ملم.

اضبط مستوى DFA داخل الغرفة لتقليل فقاعات الهواء واستخدم الأنسجة لمسح أي فائض. يمكن الآن زراعة نباتات X على المدى الطويل في الغرفة المغلقة لمدة يوم في درجة حرارة الغرفة ، وتحريك هدف 20 × المجهر متحد البؤر إلى مكانه. ضع الغرفة التي تحتوي على X explan على مرحلة المجهر وضع أوزان موازنة صغيرة على الغرفة لتثبيتها في موضعها تحت مجال ساطع.

اضبط التركيز واستخدم تحديد موضع الدورة التدريبية لتصور النهايات القمية للخلايا السطحية. قم بالتبديل إلى التألق وهدف طاقة أعلى. لجمع صور مفردة أو أفلام بفاصل زمني لظهارة explan ، قم بضبط عملية الاستحواذ للحصول على أفضل صورة ممكنة.

راجع الجزء المكتوب من هذا البروتوكول للحصول على نصائح حول الضبط والتصوير. الحفاظ على طاقة الليزر منخفضة قدر الإمكان. التقط صورا أو أفلاما بفاصل زمني لظهارة x explan.

راجع الجزء المكتوب من البروتوكول للحصول على اقتراحات حول جمع البيانات. يمكن استخراج ملفات الصور متحدة البؤر للبيانات بطرق مختلفة. فيما يلي مثالان على كيفية تحليل ملفات البيانات باستخدام برنامج تحليل Image J مع المكون الإضافي للتنسيقات الحيوية.

لقياس مساحة الخلية في خلية ظهارية، اسحب قائمة التحليل لأسفل وانقر فوق تعيين القياسات. حدد أداة التحديد من شريط الأدوات وحدد الخلية في قائمة التحليل، وحدد الأدوات، ثم مدير عائد الاستثمار. لفتح مناطق الاهتمام ، اضغط على Control t.

لإضافة المخطط التفصيلي إلى مدير عائد الاستثمار، حدد وأضف أكبر عدد ممكن من المخططات التفصيلية حسب الرغبة من الصورة. ثم انقر فوق حفظ لحفظ عائد الاستثمار المحدد في مدير عائد الاستثمار. انقر فوق القياس.

ستعرض نافذة النتائج الآن المناطق المقاسة لكل عائد استثمار. لقياس شدة غشاء الخلية، حدد أداة الخط المستقيم من شريط أدوات الصورة J. ارسم خطا عموديا عبر الغشاء.

اضغط على CTRL T كما في المثال السابق. لإضافة التحديد إلى مدير عائد الاستثمار ، اسحب قائمة التحليل لأسفل وانقر فوق ملف تعريف المؤامرة لإنشاء مخطط من الشدة النسبية عبر الخط. لحفظ الرسم البياني كصورة، انقر فوق حفظ في نافذة المخطط الجديدة التي تظهر.

اسحب قائمة القائمة لأسفل إلى الملف ، ثم احفظها كما أوضحنا لك للتو كيفية الصورة الحية وتحديد الخلايا الظهارية الجنينية من النفقات الرأسمالية للحيوانات المستقاصة. أثناء القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إضافة مضاد حيوي ومضاد حيوي إلى DFA. لتثبيط نمو البكتيريا والفطريات ، توخي الحذر الشديد أثناء الضغط على المخططات تحت زلات الغطاء لأن الضغط الأكثر من المطلوب يمكن أن يحطم السابق.

من المهم أيضا أن تتذكر أن يكون لديك الإعدادات المثلى على المجهر متحد البؤر للحصول على بيانات صور عالية الجودة. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.

Explore More Videos

علم الأحياء التنموي العدد 39 الخلايا الظهارية والضفادع القيطم المورق ظهائر متعددة الخلايا وعالية الدقة المجهر مبائر والحيوان يزدرع كأب والأجنة