تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

الهدف العام من التجربة التالية هو توليد سلائف الخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية الجنينية عبر سلسلة من خطوات الاستزراع على مدى 30 يوما. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد أجسام الجنين أولا من خلايا الفئران الجذعية الجنينية لبدء تمايز الخلايا. كخطوة ثانية ، تتم معالجة أجسام الأجنة بالجزيئات الصغيرة وحمض الريتينويك والمورفين النقي ، مما يؤدي إلى التمايز الموجه للخلايا إلى عرين الدرجة.

سلائف Cyte. كخطوة ثالثة ، يتم تقسيم أجسام الأجنة إلى خلايا مفردة بعد 22 يوما إضافيا. في الثقافة ، ما يقرب من 80٪ من الخلايا عبارة عن OPCs.

بعد ذلك ، يتم نقل OPCs المشتقة من MESC مع فيروسات باو التي تحمل وحدة فرعية NAV 1.2 من أجل توليد نتائج OPCs المتصاعدة التي تظهر التعبير عن علامة OPC وخصائص الارتفاع لهذه OBCs المشتقة من MESC بناء على الفحص المجهري المناعي والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. مرحبا ، أنا بونغ شيانغ من مختبر الدكتور إنج في قسم بيولوجيا الخلية والتشريح البشري بجامعة كاليفورنيا ديفيس. نحن أيضا تابعون لمستشفى شرينرز للأطفال في شمال كاليفورنيا.

مرحبا ، أنا قارورة راج ، أيضا من مختبر دينغ. سنعرض لك اليوم إجراء لتمايز الخلايا الجذعية للفأر إلى خلايا سلائف الإبادة الجماعية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة خصائص سلائف الخلايا الجذعية الجنينية من أجل توليد خلايا ذات إمكانات علاجية أفضل.

لذلك دعونا نبدأ. اليوم ، سيتم إنشاء خلايا سلائف قليلة التغصن أو OPCs من خط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر GFP OG ثنائي GFP. يجب تمرير هذه الخلايا الجذعية الجنينية كل ثلاثة أيام للحفاظ على صحتها بكثافة مثالية ولمنع التمايز التلقائي. مرور.

خلايا ESS عندما تكون عند التقاء 70٪ تحت غطاء التدفق الرقائقي. قم بإزالة الوسيط فوق الثقافة. اشطفها بعيون PBS و trypsin بملليلترين من التدفئة.

رحلة واحدة × LE Express لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. أوقف التفاعل وأعد تعليق الخلايا في أربعة ملليلتر من وسط خلية MES. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بحبيبها عند 1000 RP لمدة خمس دقائق.

أعد تعليقها في لوحة متوسطة MESL ، عشر من الخلايا فوق طبقة ملتقية من مغذيات الميثامفيتامين المشعة في وسط خلية MES. بعد ثلاثة أيام ، تكون الخلايا الجذعية الجنينية حوالي 70٪ ملتقية وتكون جاهزة للمرور أو التعليق لتشكيل أجسام جنينية لتحفيز أجسام الأجنة والبدء في التمايز مستعمرات خلايا الجذعون الجنينية لفأر التربسين كما كان من قبل ثم إعادة تعليق الخلايا في استبدال مصل الضربة القاضية أو وسط KSR. عد الخلايا الموجودة على hemo TER ، وقم بتخفيف التعليق في KSR.

متوسطة إلى 15 ، 000 خلية لكل لوحة مليلتر ثلاثة ملليلتر في كل بئر من مرفق منخفض للغاية ستة ثقافة لوحة جيدا. الخلايا المعلقة عند 37 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. قم بتغيير الوسيط تماما كل يومين.

بدءا من اليوم الرابع ، استبدل الوسيط يوميا في اليوم الرابع استكمل KSR بحمض الريتينويك 0.2 ميكرومولار في مكمل اليوم الخامس مع كل من حمض الريتينويك ومجاعة أولية ميكرومولار في اليومين السادس والسابع. قم بتغذية أجسام الجنين في وسطين ، مكملة بحمض الريتينويك 0.2 ميكرومولار ومجاعة أولية ميكرومولار. بعد ثمانية أيام في المزرعة ، تعبر غالبية أجسام الأجنة عن GFP وتكون جاهزة لتكون عيون التربسين المصنفة وحساب الخلايا كما كان من قبل.

ثم قم بتعليقها عند 3.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. في OPC المتوسطة إعادة تشكيل ثلاثة ملليلتر من التعليق في OPC متوسطة. باستخدام أطباق بولي أورنيثين المطلية بحجم 60 ملم كل أسبوع تقريبا ، ستصبح الخلايا ملتقية وستبدو مثل هذا الممر إلى الخلايا كما كان من قبل مع إزياء التربسين لمدة ثلاث دقائق.

بعد 30 يوما من تعليق الإعادة الأصلي. في وسط KSR ، تظهر الخلايا خصائص الخلايا السليفة قليلة التغصن لتوليد OPCs متصاعدة. استخدم OPCs المشتقة من ESL بالماوس والتي تتراوح بين 50 و 70٪ متجمعة.

استبدل الوسيط بجهاز XPBS واحد لشطف الخلايا. لإدخال الصوديوم المسور بالجهد. القناة 1.2 الوحدة الفرعية ألفا.

نستخدم مجموعة قناة الصوديوم MAM الخلفية. امزج ملليلتر واحد من مكون MAM الخلفي A مع أربعة ملليلتر من XPBS واحد. قم بإزالة شطف PBS وأضف المكون المخفف.

حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. استبدل عامل الذاكرة الخلفية بوسيط OPC المحسن بالمكونات B و C كما هو موضح في المجموعة. تحتضن التعليمات لمدة ساعتين إضافيتين عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، استبدل الوسط المحسن بوسط OPC الجديد. بعد 24 ساعة أخرى من الثقافة ، يمكن فحص OPCs المشتقة من ESL للارتفاع في هذه المرحلة الزمنية. لا يظهر EBS أي مضان GFP.

يظهر EBS تعبيرا قويا عن GFP وهو جاهز لزراعة التصنيف لمدة 30 يوما تقريبا بعد تعليق الإعادة الأصلي. في وسط KSR ، تكون غالبية الخلايا إيجابية للمناعة لتلوين NG two ، وهو ما يتوافق مع تعبير GFP. ومع ذلك ، على عكس OPCs في الدماغ ، تفشل OPCs المشتقة من خلايا MES في إطلاق إمكانات عمل حتى عندما تم إزالة استقطاب الخلايا إلى صفر مللي فولت.

بعد إدخال الوحدة الفرعية NAV 1.2 عن طريق التنبيغ الفيروسي ، تتحمس OPCs المشتقة من خلايا MES وتطلق إمكانات عمل النار. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى OPCs وتوليد OPCs المرتفعة عن طريق التنبيغ الفيروسي. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تخزين حمض الريتينويد لكل مورفين و FGF اثنين بشكل صحيح واستخدام الحصص الطازجة دائما ، والتخلص من أي حمض ريتينويد إضافي بعد الاستخدام.

هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.