تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحميل الكرات النانوية (Nanospheres) على الأنيبيبات الدقيقة، والتي تنزلق على سطح مغطى ببروتينات الكينيسين (kinesin) المحركة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق طلاء سطح خلية تدفق زجاجية بمحلول الكازين. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في امتصاص بروتينات الكينيسين المحركة على سطح خلية التدفق.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إضافة الأنابيب الدقيقة. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي إضافة جزيئات strept haver in، والتي ستتصل بالأنابيب الدقيقة، ثم إضافة الكرات النانوية. ترتبط الكرات النانوية بسطح خلية التدفق حيث يمكن للأنابيب الدقيقة التقاطها.

في نهاية المطاف، يمكن ملاحظة كيفية التقاط الأنيبيبات الدقيقة للكرات النانوية ونقلها عبر السطح باستخدام المجهر الفلوري. مرحباً، أنا إيلين جين سميث من مختبر الدكتور هنري هيس وقسم علوم وهندسة المواد بجامعة فلوريدا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاختبار الحركية المقلوب.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تحميل الشحنات على الأنيبيبات الدقيقة وحركة المكوكيات الجزيئية. لذا، دعونا نبدأ. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير جميع المحاليل الأم حديثاً كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا الفيديو.

بمجرد تحضير المحاليل القياسية، ابدأ بتجهيز الأنابيب الدقيقة عن طريق سحب 25 µL من محلول النمو ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.65 mL. بعد ذلك، أضف 6.25 µL من محلول النمو إلى 20 µg من التوبولين المبيوتيني المجفف بالتجميد. قم برج المحلول بجهاز الفورتكس ووضعه في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة لإتمام عملية البلمرة، وعقب فترة الحضانة، قم بتخفيف المحلول بمقدار 100 ضعف في منظم Taxol Buffer مع رجه برفق بجهاز الفورتكس.

يعمل هذا المحلول على تثبيت الأنيبيبات الدقيقة. قم بتسمية المحلول بـ empty 100 واحفظه في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإجراء تخفيف بمقدار عشرة أضعاف لـ MT 100 في محلول منظم مضاد للتلاشي (anti fade buffer) وقم بتسمية هذا المحلول بـ MT 1000.

بعد ذلك، قم بتحضير محركات الكينيزين (Kinesin) عن طريق تخفيف محلول الكينيزين بمقدار 20 ضعفاً في محلول TP buffer. ضع ملصقاً على المحلول باسم kinase in 20 واحفظه على الثلج. أخيراً، قم بتحضير محاليل الستريبتاديفين (streptavidin) والكرات النانوية (nanosphere).

أولاً، أضف الستريبتفيدين المسمى بـ Alexa Fluor 5 6 8 بتركيز 100 nano molars في Antifa Buffer. قم بتسمية المحلول STV 100، ثم خفف الكرات النانوية بمقدار 5, 000 ضعف في Antifa Buffer وقم بتسمية هذا المزيج NS 5, 000. احفظ كلا المحلولين على الثلج.

بعد تحضير المحلول الخاص بمقايسة تحميل الشحنة، قم بإنشاء خلية تدفق باستخدام شريحة غطاء وغطاء زجاجي يفصل بينهما شريط لاصق مزدوج الوجه. أولاً، ألصق شريحتين من الشريط اللاصق مزدوج الوجه عند حواف شريحة الغطاء، مع ترك فجوة تبلغ حوالي 1 سنتيمتر بين الشريطين. ثم ضع الغطاء الزجاجي فوق الشريط اللاصق.

قم بتطبيق الضغط على غطاء الشريحة باستخدام الحافة المسطحة لملقط لإحكام الغلق. تبلغ أبعاد خلية التدفق التي تم إنشاؤها حوالي سنتيمترين طولاً، وسنتيمتر واحد عرضاً، و100 ميكرون ارتفاعاً، ويبلغ حجمها حوالي 20 ميكروليتر. لبدء تجميع المقايسة المقلوبة.

ضع طرف الماصة بين غطاء الشريحة والشريحة نفسها. بعد ذلك، احقن 0.5 mg/mL من محلول الكازين في خلية التدفق. سيتيح هذا الطلاء الموجود في خلية التدفق لبروتين kinesin الاحتفاظ بوظيفته عند الامتصاص.

انتظر لمدة خمس دقائق حتى يتم تغليف السطح بمحلول الكازين. بعد ذلك، قم بامتصاص Kinesin في خلية التدفق عن طريق إدخال محلول الكيناز في 20 محلول، حيث يتم إدخال المحاليل في خلايا التدفق بوضع طرف الماصة بين غطاء الشريحة والشريحة نفسها. ثم يتم حقن المحلول في خلية التدفق من جانب واحد، بينما يتم سحبه في الوقت نفسه من الجانب الآخر.

باستخدام ورق ترشيح، اترك الكيناز (kinase in) لمدة خمس دقائق للامتصاص. بعد ذلك، أدخل الأنابيب الدقيقة إلى خلية التدفق عن طريق نقل محلول MT 1000 إلى خلية التدفق بواسطة الماصة. اترك الأنابيب الدقيقة لمدة خمس دقائق لتستقر وتلتصق بمحركات الكيناز (kinase in motors) بعد ارتباط الأنابيب الدقيقة بمحركات الكيناز.

قم بتغطية الأنابيب الدقيقة ببروتين strep TTR الفلوري عن طريق إدخال محلول STV 100 في خلية التدفق. اترك الجزيئات لمدة خمس دقائق ليرتبط strep TTR بالأنابيب الدقيقة. اغسل فائض strep TTR عن طريق إدخال ثلاث غسلات بحجم 30 microliter من محلول Antifa في خلية التدفق.

أخيراً، يتم إدخال جسيمات الفلوريسين النانوية من البوليسترين المبيوتينية عن طريق نقل محلول NS 5,000 إلى خلية التدفق. يمتص السطح الجسيمات الثابتة، ومن ثم ستصطدم الجسيمات النانوية بالأنيبيبات الدقيقة المتحركة وتتحمل عليها.

في هذه التجربة، يتم استخدام مجهر فلوري من طراز eclipse TE 2000 U مجهز بعدسة شيئية زيتية بقوة 100x، ومنصة X site، ومصباح 20 واحد، وكاميرا exon E-M-C-C-D. أولاً، ضع قطرة واحدة من زيت الغمر فوق العدسة الشيئية. ثم قم بتثبيت خلية التدفق على منصة المجهر باستخدام مكعب مرشح trixy.

قم بضبط تركيز الأنابيب الدقيقة، ثم انتقل إلى مكعب مرشح fitzy لعرض الكرات النانوية. بعد ذلك، افتح برنامج and or I exon واضبط وضع الحصول على الصور على الوضع الحركي (kinetic). استخدم زمن تعريض قدره 0.5 seconds، وطول سلسلة حركية يبلغ 20، وزمن دورة حركية قدره six seconds.

قم بتحويل المجهر من العدسة العينية إلى الكاميرا وابدأ في التقاط الصور. بالنسبة للصور الأربع الأولى، استخدم مكعب trixi لتصوير الأنابيب الدقيقة. أما بالنسبة للصور الـ 12 التالية، فقم بالتحويل إلى مكعب مرشح Fitz لالتقاط صور للكرات النانوية.

بعد ذلك، عُد إلى مكعب مرشح trixi. وبالنسبة للصور الأربع الأخيرة لتصوير الأنيبيبات الدقيقة، يتم رصد الأنيبيبات الدقيقة باستخدام مكعب مرشح Trissy، ثم يتم تحويل مكعب المرشح إلى fite. ولتوضيح الكرات النانوية هنا، تم تحديد الكرات النانوية التي تنقلها الأنيبيبات الدقيقة بواسطة الأسهم. ولم يتم التقاط جميع الكرات النانوية بواسطة الأنيبيبات الدقيقة.

يظهر الآن موقع الكرات النانوية بعد 36 ثانية، مما يكشف أن الكرات النانوية قد انزاحت. وعند تصوير الأنيبيبات الدقيقة مرة أخرى، يتضح أن الأنيبيبات الدقيقة قد انتقلت هي الأخرى عبر مجال الرؤية. تُظهر هذه الصور أن الكرات النانوية قد أزيحت نتيجة للنقل عبر الأنيبيبات الدقيقة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء مقايسة الحركة المقلوبة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تبديل مكعبات المرشح أثناء الحصول على الصور حتى يتسنى رؤية كل من الأنيبيبات الدقيقة والكرات النانوية. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.