Name: تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: اكتشف كيفية تحميل الجسيمات النانوية على الأنابيب الدقيقة باستخدام بروتينات الكينيسين. تُظهر هذه الطريقة نقل الحمولة على المستوى النانوي بكفاءة عالية للتطبيقات البيولوجية والتقنية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن مدينون بشدة لجوناثان هوارد ، الذي وضعت مجموعة بروتوكول الأساسية للمقايسة حركية مزلق التي تم تكييفها لاحقا من قبلنا. مع التقدير والإمتنان الدعم المالي من جبهة الخلاص الوطني منحة DMR0645023.

1). المخازن والكواشف وينبغي إعداد هذه الحلول في وقت مبكر وتخزينها في aliquots الحجم مريح. يجب على قسامة تحتوي حلا كافيا لإجراء تجربة نموذجية وقسامة جديدة يجب أن تستخدم لفحص كل حركية. وأشار أيضا إلى ظروف التخزين والأحجام قسامة نموذجية في البروتوكولات التالية. 1. BRB80 العازلة ، (مواسير 80 ملم ، 1 ملم MgCl 2 ، 1 ملم المقطر منزوع الأيونات في EGTA (د) من الماء ، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 6.9 كوه) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الأسهم 100 مل حل EGTA M 0.5 في الماء د. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم 2 م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الأسهم 100 مل حل MgCl M 1 2 في الماء د. الأوتوكلاف الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 24.2 غرام من أنابيب و 3.1 غ من الكريات KOH في حوالي 800 مليلتر من الماء ويحرك د حل. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.9 باستخدام 1 حل KOH M. إضافة 2 مل من محلول المخزون 0.5 متر وEGTA 1 مل من محلول 1 MgCl M الأسهم 2. إظهار حجم إلى 1000 مليلتر من الماء د. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة إلى 50 مل أنابيب الصقر وتجميد -20 درجة مئوية في لاستخدامها في المستقبل. ويمكن تخزين أنبوب BRB80 المستخدمة حاليا في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة. </li></ul> 2. كلوريد المغنيسيوم ، MgCl 2 (100 مم في الماء د) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخفف في الماء د لتحقيق تركيز النهائي من 100 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل </li></ul> 3. غوانوزين - 5' - ثلاثي الفوسفات ، ملح الصوديوم ، GTP (25 ملم في المياه د ، ودرجة الحموضة تعديلها ل7 من هيدروكسيد الصوديوم) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن بها وتذوب في الماء د وضبط درجة الحموضة إلى 7 محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 2 م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من تركيز الأشعة فوق البنفسجية من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر. (استخدام معامل الانقراض 11.7 × 103 سم -1 م -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 4. ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 5. التاكسول (1 ملم في DMSO) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن بها وتذوب في DMSO تحت غطاء الدخان لتحقيق تركيز النهائي من 1 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 6. D - (+) ، الجلوكوز ، (2 م في الماء د) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن بها وتذوب في الماء د لتحقيق تركيز النهائي من 2 م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 7. أوكسيديز الجلوكوز ، (2 ملغ / مل في BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب في BRB80 لتحقيق تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 8. Dithiothreitol ، DTT (1 م في الماء د) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب في الماء د الدخان تحت غطاء محرك السيارة لتحقيق تركيز النهائي من 1 م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 9. الكاتلاز ، (0.8 ملغ / مل في BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب في BRB80 لا يقل عن 2 في مراحل لتحقيق تركيز النهائي من 0.8 ملغ / مل. تحديد تركيز في كل مرحلة من خلال قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 276 نانومتر و 406 نانومتر (استخدام معامل الانقراض من 3.1 × 10 5 سم -1 م -1 عند 276 نانومتر و 2.2 × 10 5 م -1 -1 سم إلى 406 نانومتر ، و المعادلة A CL =). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 10. الأدينوزين ثلاثي الفوسفات ، 5' - ، ATP (100 ملم في MgCl 100mM 2) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل سهم MgCl 100 مم 2 في الماء د. تزن من مسحوق جاف ، وتذوب في حل هذه الأسهم لتحقيق التركيز النهائي لل100mM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من تركيز الأشعة فوق البنفسجية من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر. (استخدام معامل انقراض 15،4 × 10 سم 3 -1 م -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 11. الكازين الحل (20 ملغ / مل في BRB80 الكازين) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يقرب من 3 إلى 30 الكازين ز د مل ماء في أنبوب 50 مل الصقر. الدوامة لحوالي 1 ساعة حتى حل تطور الاتساق سميكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في حوالي 15000 ز لمدة 30 دقيقة. تصفية طاف خلال 0.5 و 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز طاف من خلال قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر (استخدام معامل انقراض 0.67 مل الطول -1 ملغ -1). تمييع ل20 ملغ / مل في BRB80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) فيإلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 2) حلول قياسي وتعد هذه في يوم من التجربة ، وينبغي التخلص منها بعد هذه التجربة قد انتهت. إعداد 1 مل من كل منهما. 1. BRB80CS0.5 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكازين تمييع الحل في BRB80 إلى تركيز النهائي من 0.5 ملغ / مل وتخزينها على الجليد. يتم تقديم هذا الحل في الخلية قبل تدفق kinesin ويساعد على الاحتفاظ النشاط kinesin بعد الامتزاز السطح. </li></ul> 2. BRB80CA <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد 0،2 ملغ / مل الكازين و 1 ملم في بطولة BRB80 وتخزينها على الجليد. غير المخفف مزيد Kinesin باستخدام هذا الحل قبل إدخالها في الخلية التدفق. </li></ul> 3. BRB80T <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل التاكسول في BRB80 إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا الحل لتحقيق الاستقرار في ميكروتثبول. </li></ul> 4. BRB80CT <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ميكرومتر التاكسول و 0.2 ملغ / مل الكازين في BRB80 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا لإعداد المزيد من antifade أنيبيب والحلول. </li></ul> 5. BRB80AF <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 20 ملي D - غلوكوز ، 20 أوكسيديز الجلوكوز ميكروغرام / مل ، و 8 ميكروغرام / مل الكاتلاز ، 10 DTT ملم ، و 20 ميكرومتر في بطولة BRB80CT وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا الحل لتخفيف streptavidin وnanospheres و "غسل الى" streptavidin الزائدة في الخلية التدفق. يمكن التحكم في سرعة kinesin عن طريق ضبط تركيز ATP في هذا الحل. </li></ul> 3) إعداد Kinesin <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعبير عن kinesin بناء يتألف من النمط البري ، وسلسلة ذبابة الفاكهة كامل طول kinesin melanogaster الثقيلة وصاحب محطة C - - العلامة في القولونية وتنقية باستخدام عمود ني NTA كما هو موضح في 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل aliquots (10 ميكرولتر لكل منهما) في 0.5 مل من الأنابيب وتخزين microcentrifuge في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. تركيز kinesin النشطة في هذه aliquots ما يقرب من 200 نانومتر. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن تجربة نموذجية ، تمييع الحل kinesin 20 أضعاف في BRB80CA. تسمية KIN20 حل وتخزين أكثر من الثلج. </li></ul> 4) إعداد أنيبيب <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب مل microcentrifuge 0.5 ، إعداد 25 ميكرولتر من محلول النمو : 4 مم MgCl 2 ، 1 ملم وGTP DMSO 5 ٪ (V / V) في BRB80 العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6.25 ميكرولتر من حل لهذه قسامة ميكروغرام 20 من تويولين biotinylated مجفف بالتجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدوامة ، ثم ضع في حمام الحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتبلمر. تمييع 100 أضعاف في دوامة BRB80T وبلطف. تسمية MT100 الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التخفيف من 10 أضعاف في MT100 BRB80AF. تسمية MT1000 الحل. </li></ul> 5) وStreptavidin Nanosphere الحل إعداد AlexaFluor568 المسمى streptavidin بتركيز 100 نانومتر في BRB80AF. تسميته STV100 وتخزينها على الجليد. وبالمثل ، تمييع nanospheres 5000 أضعاف في حل BRB80AF. تسميته NS5000 وتخزينها على الجليد. 6) البناء تدفق الخلية بناء flowcell coverslips باستخدام الزجاج اثنين مفصولة الوجهين الشريط. هذه الخلية تدفق ما يقرب من 2 سم ، 1 سم وارتفاعها 100 ميكرون ، ويبلغ حجمه حوالي 20 ميكرولتر. يتم تقديم الحلول في الخلية التدفق من جانب واحد باستخدام ماصة الاشرار والخروج من جهة أخرى على استعمال ورق الترشيح. 7) الجمعية الفحص مقلوب وهي مغلفة first سطح الزجاج مع الكازين الذي يسمح kinesin للاحتفاظ به وظائف على الامتزاز. بعد كثف kinesin ، يتم عرض ميكروتثبول ، التي تعقد من قبل kinesin. والمغلفة ثم ميكروتثبول مع streptavidin الفلورسنت. بعد الغسيل خارج streptavidin الزائدة ، ويتم تقديمها biotinylated البوليسترين فلوريسئين nanospheres (40 قطرها نانومتر). nanospheres سطح ثابت كثف تتصادم مع ميكروتثبول الانتقال والحصول على تحميلها لهم (الشكل 1). يتم سرد ترتيب تدفق الحلول والوقت المسموح به قبل تطبيق الحل التالي أدناه. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BRB80CS0.5 ، 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KIN20 ، 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MT1000 ، 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> STV100 ، 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BRB80AF ، 3X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NS5000 </li></ul> 8) الميكروسكوب تركيب الخلية تدفق على المسرح المجهر على الفور بعد إدخال nanosphere. في هذه التجربة ، وهو الكسوف مضان المجهر TE2000 - U (نيكون ، ميلفيل ، نيويورك) مجهزة هدفا النفط 100X (NA 1.45) ، وهو يستشهد X - 120 مصباح (EXFO ، اونتاريو ، كندا) وEMCCD iXon الكاميرا (ANDOR ، واستخدمت جنوب وندسور ، ط م). واستخدمت عامل تصفية FITC مكعب (# 48001) ، وتصفية TRITC مكعب (# 48002 ، كروما تكنولوجيز ، روكينجهام ، VT) لnanospheres الصورة وrespecti ميكروتثبولvely على السطح السفلي من خلايا التدفق. كانت المرة التعرض 0.2s ، في حين أن الوقت كان 2 بين التعرض ثانية. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. الرسم التخطيطي للالمكوكات الجزيئية.

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

مع تعديلات طفيفة ، وقد تم هذا البروتوكول يستخدم بنجاح من قبل مجموعة متنوعة من الجماعات لتجميع kinesin - أنيبيب المقايسات الحركية القائمة. ويمكن استبدال 10 ملم في DTT الحل النهائي مع حركية 0.5 ٪ β - المركابتويثانول. وينبغي أن الحلول القياسية (BRB80AF ، وKIN20 MT1000) أكثر من 2 ساعة قديمة لم تستخدم. لا ينبغي أبدا أي محلول يحتوي على ميكروتثبول التاكسول وخاصة توضع على الجليد. التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية لخلية تدفق ضوء النتائج الإثارة في photodamage لعناصر وظيفية : 8 ...

<table><tbody><tr><td>أدينوسين-5&amp;rsquo;-ثلاثي الفوسفات (ATP)</td><td>Invitrogen</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>توبولين مبيوتِن (Biotin tubulin)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333</td><td></td></tr><tr><td>كازين (Casein)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0376</td><td></td></tr><tr><td>كاتالاز (Catalase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-9322</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-جلوكوز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8779</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ثيوتريتول (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0610</td><td></td></tr><tr><td>إيثيلين جليكول-بِيس(2-أمين&amp;#8211;ثييل إيثر)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;&lt;/em&gt;-حمض تتراهيدرو أسيتيك (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>كُريات مجهرية مبيوتِنَة من FluoSpheres، بحجم 40 nm، ذات فلورة صفراء-خضراء (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8766</td><td></td></tr><tr><td>جلوكوز أوكسيديز (Glucose oxidase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7016</td><td></td></tr><tr><td>جوانوسين-5&amp;rsquo;-ثلاثي الفوسفات (GTP)</td><td>Roche Group</td><td>106399</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>باكليتاكسيل (Taxol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td></td></tr><tr><td>حمض 1,4-بيبيرازين ثنائي إيثان سلفونيك، بيبيرازين-1,4-بيس(2-إيثان سلفونيك أسيد)، بيبيرازين-N,N&amp;#8242;-بيس(2-إيثان سلفونيك أسيد) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>مقترن ستربتاديفين مع Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr></tbody></table>

تحميل البضائع على مكوكات kinesin بدعم الجزيئية

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

وقد تطورت الخلايا الجزيئية ، آلات متطورة ، مثل البروتينات والخيوط السيارات kinesin أنيبيب ، لدعم النقل بين الخلايا النشطة من البضائع. في حين يربط kinesins ذيل المجال لمجموعة متنوعة من البضائع ، رئيس kinesins المجالات الاستفادة من الطاقة الكيميائية المخزونة في جزيئات ATP لخطوة على أنيبيب شعرية. منذ فترة طويلة ، شديدة ميكروتثبول بمثابة مسارات للنقل لمسافات طويلة داخل الخلايا. ويمكن أيضا هذه المحركات وشعيرات أن تستخدم في البيئات الاصطناعية microfabricated كعناصر في المكوكات الجزيئية 1. في تصميم تستخدم بشكل متكرر ، وترسو kinesin المحركات على السطح من خلال المسار ذيولها ، وميكروتثبول functionalized بمثابة شحن تحمل العناصر التي تدفعها هذه المحركات. ويمكن تحميل هذه المكوكات مع البضائع من خلال الاستفادة من الربط بين القوي وانتقائية والبيوتين streptavidin. المكونات الرئيسية (تويولين biotinylated ، streptavidin ، والبضائع biotinylated) متاحة تجاريا. بناء على تجربة حركية مقلوب الكلاسيكية 2 ، هو مفصل في بناء المكوكات الجزيئية هنا. وكثف Kinesin البروتينات السيارات على سطح precoated مع الكازين ، ويتم بلمرة ميكروتثبول من تويولين biotinylated ، انضمت إلى kinesin والمغلفة في وقت لاحق مع streptavidin - رودامين المسمى. المحافظة على التركيز في بطولة تركيز subsaturating لتحقيق سرعة مزلق أنيبيب الأمثل لتحميل البضائع 3. أخيرا ، تضاف biotinylated فلوريسئين المسمى nanospheres والبضائع. Nanospheres نعلق على ميكروتثبول نتيجة اصطدام بين ميكروتثبول مزلق وnanospheres الانضمام إلى السطح. ويمكن بسهولة تعديل البروتوكول لتحميل مجموعة متنوعة من البضائع مثل الحمض النووي biotinylated 4 ، 5 نقاط الكم أو طائفة واسعة من مضادات الأجسام المضادة عبر biotinylated 4-6.

المكوكات الجزيئية التي تتكون من ميكروتثبول functionalized التزلق على سطح التزمت خدمة يمكن kinesin البروتينات السيارات كنظام النقل النانو. هنا ، هو وصف لنظام تجميع المكوك نموذجي.

تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية

طورت الخلايا آليات جزيئية معقدة، مثل بروتينات الكينيسين الحركية وخيوط الأنيبيبات الدقيقة، لدعم النقل النشط داخل الخلايا...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحميل الكرات النانوية (Nanospheres) على الأنيبيبات الدقيقة التي تنزلق على سطح مطلي ببروتينات الكينيسين الحركية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عبر طلاء سطح خلية تدفق زجاجية بمحلول الكازين. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في امتزاز بروتينات الكينيسين الحركية على سطح خلية التدفق.تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إضافة الأنابيب الدقيقة. والخطوة النهائية من الإجراء هي إضافة جزيئات strept haver، والتي سترتبط بالأنابيب الدقيقة، ثم إضافة الكرات النانوية. ترتبط الكرات النانوية بسطح خلية التدفق حيث يمكن للأنابيب الدقيقة التقاطها.في النهاية، يمكن ملاحظة كيفية التقاط الكرات النانوية بواسطة الأنيبيبات الدقيقة ونقلها عبر السطح باستخدام المجهر الفلوري. مرحباً، أنا إيلين جين سميث من مختبر الدكتور هنري هيس وقسم علوم المواد والهندسة في جامعة فلوريدا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاختبار الحركة المقلوب.نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تحميل الشحنات على الأنيبيبات الدقيقة وحركة المكوك الجزيئي. لذا، فلنبدأ. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير جميع المحاليل القياسية حديثاً كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا الفيديو.بمجرد تحضير المحاليل المخزنة، ابدأ بتجهيز الأنيبيبات الدقيقة عن طريق سحب 25 µL من محلول النمو باستخدام الماصة ووضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.65 mL. ثم أضف 6.25 µL من محلول النمو إلى 20 µg من التوبولين المبيوتيني المجفف بالتجميد. قم برج المحلول باستخدام جهاز الفورتكس وضعه في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة لإتمام عملية البلمرة، وبعد الحضانة، قم بتخفيف المحلول بمقدار 100 ضعف في منظم تاكسول (Taxol Buffer) ورجه بلطف باستخدام جهاز الفورتكس.يعمل هذا المحلول على تثبيت الأنيبيبات الدقيقة. قم بتسمية المحلول بـ empty 100 واحفظه في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإجراء تخفيف بمقدار عشرة أضعاف لـ MT 100 في محلول anti fade المنظم وقم بتسمية هذا المحلول بـ MT 1000.بعد ذلك، قم بتحضير محركات الـ Kinesin عن طريق تخفيف محلول kinesin بمقدار 20 ضعفاً في محلول TP buffer. ضع ملصقاً على المحلول باسم kinase in 20 واحفظه على الثلج. وأخيراً، قم بتحضير محاليل الستريبتيفيدين (streptavidin) والكرات النانوية (nanosphere).أولاً، أضف الستريبتاديفين المسمى بـ Alexa Fluor 5 6 8 بتركيز 100 nano molars في Antifa Buffer. قم بتسمية المحلول STV 100، ثم خفف الكرات النانوية بمقدار 5,000 ضعف في Antifa Buffer وقم بتسمية هذا المزيج NS 5,000. احفظ كلا المحلولين فوق الثلج.بعد تحضير المحلول الخاص بمقايسة تحميل الشحنة، قم بإنشاء خلية تدفق باستخدام شريحة غطاء وشريحة زجاجية رقيقة يفصل بينهما شريط لاصق مزدوج الوجه. أولاً، الصق شريطيين من الشريط اللاصق مزدوج الوجه عند حواف شريحة الغطاء، مع ترك فجوة تبلغ حوالي سنتيمتر واحد بين الشريطين. ثم ضع الشريحة الرقيقة فوق الشريط اللاصق.قم بتطبيق الضغط على غطاء الشريحة باستخدام الحافة المسطحة لملقط لإحكام الغلق. تبلغ أبعاد خلية التدفق التي تم إنشاؤها حوالي سنتيمترين طولاً، وسنتيمتر واحد عرضاً، و100 microns ارتفاعاً، ويبلغ حجمها حوالي 20 microliters. للبدء في تجميع المقايسة المقلوبة.ضع طرف الماصة بين شريحة الغطاء والشريحة الزجاجية. ثم احقن 0.5 mg/mL من محلول الكازين في خلية التدفق. سيسمح هذا الطلاء لخلية التدفق لبروتين kinesin بالحفاظ على وظيفته عند الامتصاص.انتظر لمدة خمس دقائق حتى تتكون طبقة من محلول الكازين. بعد ذلك، قم بامتزاز Kinesin على خلية التدفق عن طريق إدخال الكيناز في 20 محلول، حيث يتم إدخال المحاليل في خلايا التدفق بوضع طرف الماصة بين شريحة التغطية والشريحة الزجاجية. ثم يتم حقن المحلول في خلية التدفق من أحد الجانبين، بينما يتم سحبه في الوقت نفسه من الجانب الآخر.باستخدام ورقة ترشيح، اترك الكيناز (kinase in) ليمتص لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإدخال الأنابيب الدقيقة إلى خلية التدفق عن طريق نقل محلول MT 1000 إلى خلية التدفق باستخدام الماصة. اترك الأنابيب الدقيقة لمدة خمس دقائق لتستقر وتلتصق بمحركات الكيناز (kinase in motors) بعد إتمام عملية ارتباط الأنابيب الدقيقة بمحركات الكيناز.قم بتغليف الأنيبيبات الدقيقة ببروتين TTR المفلور والمرتبط بـ strep عن طريق إدخال محلول STV 100 في خلية التدفق. اترك جزيئات strep TTR لمدة خمس دقائق لتترابط مع الأنيبيبات الدقيقة. اغسل فائض strep TTR عن طريق إدخال ثلاث غسلات من محلول Antifa بحجم 30 microliter في خلية التدفق.وأخيراً، يتم إدخال كرات الفلوريسين النانوية المصنوعة من البوليسترين والمبوتينة عن طريق نقل محلول NS 5,000 إلى خلية التدفق. حيث يمتص السطح الجسيمات الثابتة، وستصطدم الكرات النانوية بالأنيبيبات الدقيقة المتحركة وتلتصق بها.في هذه التجربة، تم استخدام مجهر فلوري من طراز eclipse TE 2000 U مجهز بعدسة شيئية زيتية بقوة 100x وموقع X ومصباح 20 وكاميرا exon E-M-C-C-D. أولاً، ضع قطرة واحدة من زيت الغمر فوق العدسة الشيئية. ثم قم بتثبيت خلية التدفق على منصة المجهر باستخدام مكعب ترشيح trixy.قم بضبط تركيز الأنابيب الدقيقة، ثم انتقل إلى مكعب مرشح fitzy لعرض الكرات النانوية. بعد ذلك، افتح برنامج and or I exon واضبط وضع الحصول على البيانات على الوضع الحركي (kinetic). استخدم زمن تعريض قدره 0.5 seconds، وطول سلسلة حركية يبلغ 20، وزمن دورة حركية قدره six seconds.قم بتحويل المجهر من العدسة العينية إلى الكاميرا وابدأ في التقاط الصور. بالنسبة للصور الأربع الأولى، استخدم مكعب trixi لتصوير الأنابيب الدقيقة. وبالنسبة للصور الـ 12 التالية، انتقل إلى مكعب مرشح Fitz لالتقاط صور للكرات النانوية.ثم عُد إلى مكعب مرشح trixi. وفي الصور الأربع الأخيرة لتصوير الأنيبيبات الدقيقة، يتم رصد الأنيبيبات الدقيقة باستخدام مكعب مرشح Trissy، ويتم تحويل مكعب المرشح إلى fite. ولتصوير الكريات النانوية هنا، يتم تحديد الكريات النانوية التي تنقلها الأنيبيبات الدقيقة بواسطة الأسهم. ولم يتم التقاط جميع الكريات النانوية بواسطة الأنيبيبات الدقيقة.يظهر الآن موقع الكرات النانوية بعد 36 ثانية، مما يكشف أن الكرات النانوية قد انزاحت. وعند تصوير الأنيبيبات الدقيقة مرة أخرى، يتضح أن الأنيبيبات الدقيقة قد انتقلت أيضاً عبر مجال الرؤية. وتُظهر هذه الصور أن الكرات النانوية قد أزيحت بسبب النقل بواسطة الأنيبيبات الدقيقة.لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء مقايسة الحركة المقلوبة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تبديل مكعبات المرشح أثناء التقاط الصور حتى يتسنى رؤية كل من الأنيبيبات الدقيقة والكرات النانوية. هذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

approch قدم واحدة جزيء المجهري رؤى الرواية إلى النقل النووي.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

يتم النقل داخل الخلايا للشحنات ، مثل الحويصلات أو العضيات ، بواسطة البروتينات الحركية الجزيئية التي تتعقب الأنابيب الدقيقة المستقطبة. يصف هذا البروتوكول ارتباط اتجاه نقل جزيئات البضائع الفردية التي تتحرك داخل الخلايا العصبية ، بالكمية النسبية ونوع البروتينات الحركية المرتبطة بها.

تميز التركيب الجزيئي للسيارات على محور عصبي نقل البضائع عن طريق &quot;شحن رسم الخرائط&quot; تحليل

هنا، ويرد على بروتوكول لتحديد كينيسين-1 الشحنات. ومتحولة بلا محركات من السلسلة الثقيلة كينيسين-1 (KIF5B) المجاميع في السيتوبلازم ويدفع تجميع الشحنات به. تم الكشف عن كل من المجاميع تحت المجهر مضان. يمكن استخدام استراتيجية مماثلة لتحديد الشحنات من البروتينات السيارات الأخرى.

تحديد كينيسين-1 الشحنات عن طريق الميكروسكوب الإسفار

نقدم بروتوكول لبناء المكوكات الجزيئية، حيث دفع البروتينات موتور kinesin التقيد سطح الصبغ المسمى microtubules. التفاعلات الضعيفة من كينيسينس مع السطح تمكن تمسكهم عكسها له. وهذا يخلق نظام النانو الذي يسلك الجمعية دينامية، وتفكيك عناصره، مع احتفاظها بوظيفتها.

تجميع المكوكات الجزيئية مدعوم بشكل قابل للعكس يعلق كينيسينس

والهدف من هذا البروتوكول هو تشكيل الفرق من المحركات الجزيئية علي الحمض النووي النانو اوريغامي ومراقبه الحركة الفرقة باستخدام المجهر الداخلي انعكاس الكلي.

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

يتراكم الكينيسين-5 Cin8 الانقسامي ثنائي الاتجاه في مجموعات تنقسم وتندمج أثناء حركتها. التراكم في مجموعات يغير أيضا سرعة واتجاه Cin8. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاختبارات الحركة مع Cin8-GFP المنقى وتحليل الخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8.

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

توضح هذه الدراسة تنقية KIF1A (1-393LZ) ، وهو عضو في عائلة kinesin-3 ، باستخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9. أظهر تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات في المختبر لهذه المحركات المنقاة خصائص حركية قوية مماثلة للمحركات من محللة خلايا الثدييات. وبالتالي ، فإن نظام Sf9-baculovirus قابل للتعبير عن البروتين الحركي ذي الأهمية وتنقيته.

تحليل جزيء واحد لمحركات عائلة Kinesin-3 فائقة المعالجة المنقى Sf9

ووصف النظام الجديد في المختبر للتحميل في وقت واحد four الأوتار في الثقافة.

خارج الحي تحميل الميكانيكية للوتر

الكالسيوم هو رسول في كل مكان في الجهاز العصبي ، وضرورية لتحريك الافراج العصبي والتغييرات في قوة متشابك. هنا نظهر تقنية لتحميل كا 2 + - المؤشرات في محطات العصب ذبابة الفاكهة. نظهر أيضا تصنيع أجهزة المطلوبة ، والتأكيد على النقاط الحرجة للنجاح في هذه التقنية.

محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

نحن هنا تقرير من الجيل recombinase تري من خلال التطور ، وجهت الجزيئية. TRE recombinase تعترف تسلسل هدف محدد مسبقا ضمن تسلسل LTR للطليعة الفيروس HIV - 1 ، مما أسفر عن ختان البنات والقضاء على طليعة الفيروس من خلايا بشرية مصابة. في حين لا يزال في مراحله الأولى ، والتطور الجزيئي الموجه تسمح بإنشاء الأنزيمات المخصصة التي ستكون بمثابة أدوات جراحة الجزيئية والطب الجزيئي.

الجزيئية تطور Recombinase تري

اكتشف كيفية تحميل الجسيمات النانوية على الأنابيب الدقيقة باستخدام بروتينات الكينيسين. تُظهر هذه الطريقة نقل الحمولة على المستوى النانوي بكفاءة عالية للتطبيقات البيولوجية والتقنية.

تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية

استكشف المزيد من الفيديوهات