الجينوم على نطاق تحليل المستويات (شحن) من الحمض الريبي النووي النقال باستخدام Aminoacylation ميكروأرس]

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد التغيرات النسبية في مستويات شحن TRNA. ويتم تحقيق ذلك عن طريق عزل RNA عند قيمة pH منخفضة قبل وبعد المعالجة لعزل TRNA مع الحفاظ على مستويات الشحن سليمة. وكخطوة ثانية، يخضع RNA لمعالجة بالأكسدة باستخدام periodate، مما يسمح بتحديد مستويات الشحن النسبية.

بعد ذلك، يتم ربط العينات بـ oligonucleotide فلوري وتهجينها على مصفوفة مجهرية (microarray) لقياس التغيرات في مستويات الربط الناتجة عن شحن A-T-R-N-A. يتم الحصول على نتائج تغيرات المستوى الجينومي لـ CHO في شحن TRNA بناءً على تقنية مصفوفة TRNA المجهرية. مرحباً، أنا جون زاي من مختبر د. أر تي بان في قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة شيكاغو.

سأعرض لكم اليوم إجراءً لعزل وقياس شحن TRNA على المستوى الجينومي. ونحن نستخدم هذه الطريقة لقياس التغيرات في شحن TNA أثناء فترات التعرض للمجهدات في مختبرنا. لذا، فلنبدأ.

لعزل الشحنة الكلية لـ TRNA، ابدأ بتنمية ما يعادل 30 OD 600 كحد أدنى من خلايا الخميرة، والتي من شأنها أن تنتج 30 micrograms من إجمالي الـ RNA. قم بترسيب الخلايا في جهاز طرد مركزي مكتبي، ثم أعد تعليق الخلايا في محلول منظم للتحلل (lysis buffer). أضف حجماً مساوياً من خلات الصوديوم والفينول كلوروفورم المشبع، وقم بالرج بجهاز الفورتيكس لمدة 30 ثانية، يليه الوضع على الثلج لمدة 30 ثانية على الأقل.

كرر عمليتي الرج الميكانيكي (vortexing) والتقطيع مرتين إضافيتين. قم بطرد العينة مركزياً عند 18,600 RFC لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد ذلك، قم بإزالة الطبقة المائية وأجرِ استخلاصاً آخر باستخدام الفينيل كلوروفورم المشبع بالأسيتات بعد الاستخلاص الثاني.

قم بترسيب الـ RNA بإضافة 2.7 x من أحجام الإيثانول ثم إجراء عملية الطرد المركزي عند 18,600 RFC لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. أعد تعليق كتل الـ RNA في محلول منظم التحلل (lysis buffer solution)، ثم قم بترسيبها باستخدام الإيثانول مرة ثانية. وأخيرًا، أعد تعليق الـ RNA في محلول يحتوي على 10 millimolar من الأسيتات المنظمة و 1 millimolar من EDTA للمعالجة اللاحقة.

يمكن تخزين العينة بشكل مستقر عند -80 °C لمدة أسبوعين إضافيين تقريبًا. ولا يُوصى بالتخزين لأن بعض الـ TNA المشحونة ستبدأ في التحلل قبل الوسم باستخدام وسوم oligonucleotides الفلورية S3 أو SCI five. يخضع إجمالي الـ TRNA لمعالجة بالأكسدة باستخدام sodium periodate، مما يسمح بتحديد مستويات الشحن النسبية؛ حيث يتم خلط إجمالي الـ RNA مع 0.066 µM من كل معيار eco irna و100 mM من acetate buffer في وجود 50 mM من sodium periodate. وبالنسبة لعينة الـ TRNA الضابطة التي لن تتعرض للأكسدة، يتم استخدام 50 mM من sodium chloride بدلاً من sodium periodate.

حضن التفاعلات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبعد مرور 30 دقيقة، يتم إيقاف التفاعل عن طريق إضافة الجلوكوز ليصل تركيزه إلى 100 millimolar والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بمجرد إيقاف التفاعل، يتم إجراء تبادل للمحلول المنظم باستخدام عمود G 25 spin column لإزالة أي بقايا من sodium prorate من العينات. يتم ترسيب العينات بإضافة buffered acetate ليصل التركيز النهائي إلى 133 millimolar وsodium chloride ليصل التركيز النهائي إلى 66 millimolar، مع إضافة 2.7 x من أحجام ethanol.

بعد ذلك، قم بعزل عينات tRNA باستخدام Resus، مع تعليقها في 50 millimolar tris HCL والتحضين عند 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة. بعد مرور 30 دقيقة، قم بمعادلة التفاعل بإضافة حجم مساوٍ من 50 millimolar buffered acetate و 100 millimolar sodium chloride، ثم قم بالترسيب باستخدام 2.7 x من أحجام ethanol. أعد تعليق كتلة RNA في الماء بتركيز حوالي one microgram per microliter.

بمجرد التحقق من جودة الـ RNA في العينات الضابطة والمؤكسدة عن طريق الفصل الكهربائي على هلام الأجاروز، يمكننا البدء في عملية الوسم الفلوري لإرفاق وسوم قليلة النيوكليوتيد الفلورية بـ TRNA. اخلط 0.1 µg/µL من الـ RNA مع 4 µM من SI3 أو SI5 التي تحتوي على قليلات النيوكليوتيد، ومحلول منظم الليغيز (ligase buffer)، و15% DMSO، و0.5 unit/µL من T4 DNA ligase، وyeast exo phosphatase، ثم قم بالتحضين عند 16 °C لمدة تزيد عن 16 ساعة. بعد عملية الربط، اخلط العينات مع أربعة أحجام من أسيتات البوتاسيوم وكلوريد البوتاسيوم، ثم استخلصها باستخدام حجم مساوٍ من الفينيل كلوروفورم. بعد استخلاص الطور المائي، قم بترسيب تحضيرات الـ RNA باستخدام الإيثانول. وأخيراً، أعد تعليق كرات الـ RNA في الماء لتركيز يصل إلى 0.1 µg/µL تقريباً قبل التهجين؛ اغسل شرائح المصفوفة الدقيقة (microarray slides) بالماء المقطر لمدة دقيقة إلى دقيقتين لإزالة قليلات النيوكليوتيد غير المرتبطة.

بعد ذلك، ادمج العينات الخمس المحددة من S3 أو SCI مع 140 microliters من محلول منظم التهجين، مع إضافة salmon sperm DNA ليصل إلى تركيز نهائي قدره 140 micrograms per milliliter و poly A ليصل إلى تركيز نهائي قدره seven D micrograms per milliliter، ثم قم بتشغيل برنامج التهجين في جهاز تهجين المصفوفات الأوتوماتيكي. ونوصي بشدة باستخدام جهاز تهجين أوتوماتيكي في أعمال TRNA لأن التهجين اليدوي يؤدي إلى ظهور خلفية عالية. وعند اكتمال برنامج التهجين، اغسل الشرائح يدويًا باستخدام محلول wash three عن طريق الرج اللطيف في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق.

اغسل الشرائح مرتين على الأقل في أنابيب مغلفة مسبقاً بورق الألمنيوم. جفف الشرائح عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق للحصول على أفضل النتائج. يجب مسح الشرائح ضوئياً فور تجفيفها.

يمكن مسح الشرائح من مرتين إلى ثلاث مرات دون تدهور ملحوظ في جودة الصورة؛ وتظهر هنا نتائج تمثيلية لعينة RNA كلية معزولة بشكل صحيح وتحليلها. تتميز هذه العينة بطيف نقي للغاية مع نسبة OD 260 إلى OD 280 قريبة من 2، مع عدم وجود تلوث ملموس بالبروتين أو الفينول عند تشغيلها على هلام agarose بنسبة 1%. يجب أن تظهر كل من العينات المؤكسدة وعينات التحكم حزمة RNA قوية، مع احتمالية ظهور حزم أحماض نووية أخرى تختلف باختلاف الكائنات الحية.

إذا كانت العينة أضعف بشكل ملحوظ من العينات الأخرى، أو إذا لوحظ وجود تلطخ (smearing)، فلا ينبغي استخدام العينات في المصفوفات الدقيقة (microarrays). يجب أن يكون للخلفية في المصفوفات الدقيقة مستوى منخفض جداً، بحيث يكون أقل بمقدار درجة عشرية واحدة من أضعف مسبار TRNA. لقد أوضحت لكم للتو كيفية عزل وتحديد مستويات الشحن النسبية لـ TRNA عند إجراء هذا الإجراء.

من المهم تذكر الحفاظ على الكواشف خالية من النوكلييزات، خاصة خلال خطوات الأكسدة والتخفيف. شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.