Name: إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: اكتشف طريقة إنتاج القيطم المورق المعدل وراثياً باستخدام زرع النوى المنوية واستخلاص البيض. تتيح هذه التقنية دراسة التعبير الجيني أثناء تطور الأجنة بكفاءة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يتم توفير التمويل اللازم لعملنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، ومارس من الدايمات ، والجمعية الأميركية للسرطان.

<ol><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li>
<li>Karaulanov, E., Knöchel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li>
<li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling%3A+a+mechanism+for+lens+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li>
<li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li>
<li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li>
<li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li>
</ol>

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها لرعاية الحيوان واستخدام اللجنة في جامعة واشنطن في كلية الطب.

ليتم اختبارها كل بناء المعدلة وراثيا ، ونحن عموما زرع النوى في 500-1000 البيض ، وفي هذا النطاق ، ونحن يمكن أن تولد الأجنة وراثيا التعبير عن ما يصل الى 10 بنيات مختلفة في اليوم الواحد ، اعتمادا على كيفية العديد من الإناث التي يسببها لوضع البيض. هذه زرع حوالي ثلث يلتصق البيض و60-80 ٪ من هذه الأجنة المضي قدما من خلال الشق عادة تكون المعيدة. تبعا للظروف التفاعل المستخدمة ، وبين 10-50 ٪ من هذه الأجنة تعبر عن والتحوير في المصالح. لذلك ، بمجرد إنشاء هذا الإجراء في المختبر ، فمن الممكن لع...

A. إعداد الحيوانات المنوية النوى الكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X MMR (2mm وCaCl 2 ، HEPES 5mm ، و pH7.5 ، 2mm وبوكل ، 1MM MgCl 2 ، كلوريد الصوديوم 100mM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 ٪ Tricaine Methanesulfonate (MS222 ، إيثيل استر حمض أمينوبنزويك ، سيغما A - 5040) ، 0.1 ٪ بيكربونات الصوديوم. تذوب في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2X زبدة التحضير النووية (NPB). في اليوم من إعداد نواة الحيوان المنوي ، يشكلون ما نسبته 30 مل من NPB 2X من aliquots للحلول تخزين الأوراق المالية المجمدة : 500 ملي السكروز (1.5 M الأسهم) ، و 30 HEPES ملم (1M الأسهم ؛ عاير مع KOH بحيث الرقم الهيدروجيني 7.7 هو في 15 ملم) ، 1 trihydrochloride سبيرمدين ملم (سيغما S - 2501 ، و 10 سهم ملم) ، 0.4 tetrahydrochloride السبيرمين ملم (سيغما S - 1141 ، و 10 سهم ملم) ، 2 مم dithiothreitol (سيغما D - 0632 و 100 سهم ملم) ، 2 مم EDTA (500 ملي EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 2XNPB لجعل أ 1X 30ml NPB ، B. 10ML 1XNPB +3 ٪ BSA (V كسر ، سيغما A - 7906) ، ج. 5ml 1XNPB BSA +0.3 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysolecithin : 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل - L - α - lyso الليسيثين ، صفار البيض (Calbiochem ، 440154) ؛ تذوب في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. تخزين صلبة الأسهم عند 20 درجة مئوية. تجاهل مسحوق الأوراق المالية إذا أصبح لزجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ألبومين المصل البقري (BSA) : 10 ٪ (W / V) BSA (V كسر ، سيغما A - 7906) يشكلون 5 مل في الماء في اليوم من إعداد نواة الحيوان المنوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الحيوانات المنوية العازلة (1ml) 1X NPB ، الجلسرين 30 ٪ ، 0.3 ٪ BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات المنوية تخفيف العازلة : 250 السكروز مم ، 75 مم بوكل ، 0.5 trihydrochloride سبيرمدين مم ، 0.2 tetrahydrochloride السبيرمين ملم. يعاير إلى الرقم الهيدروجيني 7،3-7،5 وتخزين 0،5-1 aliquots مل عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هويشت رقم 33342 (سيغما B - 2261) : 10 ملغ / مل الأسهم في DH 2 O ، وتخزينها في ضوء ضيق سفينة عند 20 درجة مئوية. </li></ol> المعدات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتأرجح الدوار دلو وأجهزة الطرد المركزي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القماش الجبني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدوات تشريح (مقص وملقط) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضان المجهر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قمع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قفازات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدادة الكريات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبر (26 مقياس) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ورقة المناشف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطباق بتري (60 ملم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البلاستيك (5 و 10 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipetman نصائح (1 مل و200μl) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاقن (1 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب (14 مل ؛ فالكون 2059) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microcentrifuge (1.5 مل) </li></ul> باء إعداد مستخلصات سرعة عالية الكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X مارك والتعديل رينغر (MMR) : 100 مم كلوريد الصوديوم ، 2 مم بوكل ، 1 ملم MgCl 2 ، 2 مم CaCl 2 ، 5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.5. إعداد المخزون 10X ، وضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20X العازلة استخراج (الميزانية) الأسهم الملح : 2 م بوكل ، 20 ملي MgCl 2 ، 2 مم CaCl 2 ، فلتر تعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج العازلة (الخارجة ؛ الطازجة وتخزينها على الجليد) : 1X الأملاح الخارجة ، 50 ملي السكروز ، HEPES 10MM (1 M الأسهم ، مع معاير KOH بحيث الرقم الهيدروجيني هو 7.7 عندما تضعف إلى 15 مم ؛ فلتر تعقيم ، وتخزينها في aliquots عند 20 درجة مئوية). تعد حوالي 100 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتكون في 1X الأملاح الخارجة قبل الاستخدام ومعاير لدرجة الحموضة 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم : 2 ٪ (W / V) L - 1 - سيستين هيدروكلوريد هيدرات. تعد حوالي 300 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CSF - الخارجة : 1X الأملاح الخارجة ، 1 ملم MgCl 2 (بالإضافة إلى MgCl 2 موجودة في الأملاح الخارجة ؛ التركيز النهائي 2 مم) ، HEPES 10 مم ، ودرجة الحموضة 7.7 ، 50 السكروز ملم ، 5 ملم EGTA ، ودرجة الحموضة 7.7. تجهيز 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مثبطات الأنزيم البروتيني : خليط من leupeptin ، chymostatin وpepstatin ، كل حل لتركيز النهائي من 10 ملغ / مل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). في مخزن صغير في aliquots 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 م 2 CaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الطاقة : 150 ملي فوسفات الكرياتين ، 20 ملي ATP ، 20 ملي MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرس حامل المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) : 100 U / مل PMSG (PG600 ® ، إنترفيت ، شركة ، 021825). تذوب في المياه وتخزينها على 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنسان gonadotropin المشيمي (HCG) : 1000 U / مل HCG (CHORULON ® ، إنترفيت ، شركة ، 057176). تذوب في المياه وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li></ol> المعدات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القيطم المورق الإناث </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبر (18 و قياس 26) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة باستير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتحمل واسعة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاقن (1 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواسير microcentrifuge (0.5 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب البولي جدار سميك (بيكمان ، 349622) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواسير ultraclear (14 × 95 مم ؛ بيكمان ، 344060) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة فائقة السرعة والدوارات (على سبيل المثال ، بيكمان TL - 100 مع تي الدوارات 40 SW وTLA 100.3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأكواب لجمع البيض </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدلاء أو حاويات لعقد الضفادع الإناث (على سبيل المثال ، 4 - L الأكواب البلاستيكية مع أغطية عيون). </li></ul> جيم النووية الزرع. الكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 ٪ في agarose 0.1XMMR (لصنع أطباق الحقن) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 ٪ سيستين في 1XMMR، pH8.0 ، الذي أعد في اليوم للاستخدام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ملغ / مل الجنتاميسين (الأسهم 1000X) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتفاع سرعة استخراج البيض (انظر أعلاه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10X MMR (انظر أعلاه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انزيم التقييد (مثل NOTI من نيو انغلاند Biolabs) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات المنوية تخفيف العازلة (SDB ، انظر أعلاه) ، ونواة الحيوان المنوي (انظر أعلاه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنسان gonadotropin المشيمي (HCG) على النحو الوارد أعلاه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزيوت المعدنية (سيغما ، M8410) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي البلازميد أن قدم مثل التحوير : إعداد خطي البلازميد بتركيز حوالي 100 نانوغرام / ميكرولتر في العقيمة ، nuclease خالية من المياه (تريس ونتجنب EDTA تحتوي على مخازن ، والتي هي سامة إلى حد ما إلى الأجنة). الانزيم تقييد استخدامها ليصبح خطي على البلازميد ليس من الضروري أن يكون هو نفسه واحد المستخدمة في نقل ردود الفعل النووية. نستخدم عادة NOTI لجميع ردود الفعل ، بغض النظر عن ما هو خطي مع البلازميد. بعض معايرة الإنزيم المستخدم في تخفيف رد فعل قد يكون من الضروري ، كما يمكن للانزيم يسبب الكثير من الآثار السلبية على التنمية في مرحلة ما بعد المعيدة. يمكن تنقية البلازميد في عدة طرق مختلفة : نحن عادة استخدام تنقية Qiagen PCR Qiaquick عدة وفقا لتوجيهات مصنعين ؛ تنقية فرقة واحدة من مادة هلامية ليست ضرورية. إذا تتم تنقيته البلازميد باستخدام الفينول / كلوروفورم الاستخراج وهطول الأمطار الإيثانول ، تكون معينة لإزالة جميع آثار المواد العضوية والايثانول. </li></ol> المعدات : أطباق Agarose للحقن : في طبق بتري البلاستيك 60 ملم ، وإرساء 35mmX35mm صغيرة تزن قارب على المنصهر agarose 2.5 ٪ في 0.1XMMR المياه لإنشاء الاكتئاب مع القاع agarose المغلفة لملء مع البيض. مرة واحدة agarose وشددت ، في التفاف parafilm وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. جعل الأطباق 2-3 مقدما عن كل ردود الفعل المعدلة وراثيا كنت تخطط للقيام به. مضخة التسريب : نحن نستخدم مضخة حقن حقنة واحدة من جهاز هارفارد ، ومجهزة حقنة سم 3 / إبرة مليئة الزيوت المعدنية (سيغما M - 8410). كليلة رأس إبرة حقنة (لمنعها من ثقب الأنبوب) وإرفاق أنابيب tygon الغرامة. تشغيل المضخة في 10nl/sec ~ ، وهذا يفترض أن الوقت الإبرة في كل واحدة منها لن يكون هناك أكثر من 1 ثانية. وينبغي تشغيل المضخة قبل لعدة دقائق قبل انطلاق لtransgenesis اليوم لأؤكد أن المكبس لتدفق الحقنة مع مكبس وهذا التدفق المطرد إيجابية من النفط من الأنبوب يحدث. الإبر لنقل المواد النووية. باستخدام مجتذب micropipette ، وتوليد الإبر مع نصائح وطويلة المنحدرة. هذه القصاصة مع forcep تحت المجهر تشريح مجهزة ميكرومتر العين للحصول على 80 ميكرون ~ فتح مع شكل مشطوف. معدات أخرى : القيطم المورق الإناث ، stereomicroscope ، حاضنة ، micromanipulator ، microinjection مجتذب الإبرة (على سبيل المثال النموذجي P - 87 ، سوتر) ، والإبر محقنة (26 مقياس) ، والإبر microinjection الزجاج ، والعين لقطة ميكرومتر معايرة من النصائح إبرة microinjection 80μm إلى قطرها ، أطباق بتري ، وزن الزوارق 35mm ، Tygon أنابيب (ID = 1 / 32 بوصة ، OD = 3 / 32 بوصة)

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

التكامل مستقرة من المنتجات الجينات المستنسخة في جينوم القيطم هو ضروري للتحكم في الزمان والمكان والتعبير ، والتعبير عن الجينات في مراحل لاحقة من التطور الجنيني ، وتحديد مدى القدرة على تنظيم والمروجين التعبير الجيني داخل الجنين. ويمكن استخدام بروتوكول تظاهر هنا لتنتج بكفاءة الأجنة وراثيا القيطم المورق. هذا النهج ينطوي على transgenesis ثلاثة أجزاء : 1. يتم عزل الحيوانات المنوية من نوى عاشرا الكبار خصية المورق عن طريق العلاج مع lysolecithin التي permeabilizes غشاء البلازما المنوية. 2. مستعدة استخراج البيض بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة ، إضافة إلى الكالسيوم يؤدي إلى التقدم إلى استخراج الطور البيني من دورة الخلية ، والطرد المركزي بسرعة عالية لعزل الطور البيني العصارة الخلوية. 3. يتم الجمع بين النواة واستخراج الحمض النووي مع البلازميد الخطي لتكون كما قدم التحوير وكمية صغيرة من انزيم التقييد : زرع النووية. خلال رد فعل قصير ، استخراج البيض decondenses جزئيا لونين الحيوانات المنوية وانزيم يكسر قيود يولد الكروموسومات التي تشجع على إعادة التركيب من التحوير في جينوم. ثم يتم زرع نواة الحيوان المنوي في علاج بويضة غير مخصبة. التكامل بين التحوير وعادة ما يحدث قبل الانقسام والجنينية الأولى من نوعها أن الأجنة الناتجة ليست خيالية. ويمكن تحليل هذه الأجنة دون أي حاجة لتربية للجيل القادم ، والسماح لجيل فعال وسريع من الأجنة وراثيا للتحليلات المروج وظيفة الجين. عاشرا الكبار المورق الناتجة عن هذا الإجراء نشر أيضا عن طريق التحوير germline ويمكن استخدامها لتوليد حيوانات معدلة وراثيا خطوط لأغراض متعددة.

هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة لتوليد المعدلة وراثيا<em&gt; القيطم المورق</em&gt; عن طريق إدخال الجينات المحورة إلى نواة الحيوان المنوي تليها النووية الى زرع بويضة غير مخصبة.

يعد الدمج المستقر لنواتج الجينات المستنسخة في جينوم Xenopus ضروريًا للتحكم في وقت ومكان التعبير الجيني، وللتعبير عن الجينات في مراحل لاحقة من التطور الجنيني، ولتحديد كيفية تنظيم المعززات والمحفزات للتعبير الجيني داخل الجنين. يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا لإنتاج أجنة Xenopus laevis معدلة وراثيًا بكفاءة. يتضمن نهج التعديل الوراثي هذا ثلاثة أجزاء: 1. يتم عزل نوى الحيوانات المنوية من خصية X. laevis البالغة عن طريق المعالجة بـ lysolecithin، الذي يعمل على زيادة نفاذية الغشاء البلازمي للحيوان المنوي. 2. يتم تحضير مستخلص البيضة عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة، وإضافة الكالسيوم لتحفيز المستخلص على الانتقال إلى الطور البيني من الدورة الخلوية، ثم إجراء طرد مركزي عالي السرعة لعزل سيتوسول الطور البيني. 3. نقل النوى: يتم دمج النوى والمستخلص مع الحمض النووي البلازميدي الخطي المراد إدخاله كجين منتقل وكمية صغيرة من إنزيم القطع. وخلال تفاعل قصير، يعمل مستخلص البيضة على فك تكثيف كروماتين الحيوان المنوي جزئيًا، بينما يقوم إنزيم القطع بإحداث كسور كروموسومية تعزز إعادة تركيب الجين المنتقل في الجينوم. بعد ذلك، تُنقل نوى الحيوانات المنوية المعالجة إلى بيوض غير مخصبة. وعادة ما يحدث دمج الجين المنتقل قبل الانقسام الجنيني الأول، بحيث لا تكون الأجنة الناتجة خيمرية. ويمكن تحليل هذه الأجنة دون الحاجة إلى التربية لجيل تالٍ، مما يسمح بإنتاج أجنة معدلة وراثيًا بكفاءة وسرعة لتحليل وظيفة المحفز والجين. كما تقوم حيوانات X. laevis البالغة الناتجة عن هذا الإجراء بنقل الجين المنتقل عبر الخط الجرثومي، ويمكن استخدامها لإنتاج سلالات من الحيوانات المعدلة وراثيًا لأغراض متعددة.

لدراسة التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني لضفدع Xenopus، يجب دمج نواتج الجينات المستنسخة بشكل مستقر في الجينوم. أولاً، يتم عزل نوى الحيوانات المنوية من خصى الضفادع البالغة ومعالجتها للنفاذية. ثم يتم تحضير مستخلصات سيتوسول الطور البيني من بيوض Xenopus.يتم خلط نويات الحيوانات المنوية ومستخلص البيض مع حمض DNA المعدل وراثياً والمخطي (linearized) وإنزيم تقييد. خلال هذه الخطوة، يعمل مستخلص البيض على فك تكثيف كروماتين الحيوانات المنوية، بينما يحفز إنزيم التقييد عملية دمج الجين المنقول. وأخيراً، تُنقل النويات المعالجة إلى بويضات غير مخصبة.تحمل كل خلية من الجنين الناتج الجين المنقول، ويتم الكشف عن تعبير الجين المنقول المعتمد على المحفز بواسطة مجهر التألق المناعي أو طرق أخرى. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الأخرى، مثل حقن DNA، في أن الأجنة الناتجة تخضع لعملية دمج الجين المنقول قبل الانقسام الأول. وهذا يعني أن الأجنة الناتجة ليست موزاييكية (chimeric)، وبالتالي لا يلزم إجراء أي تزاوج.باستخدام هذا البروتوكول، يمكن إنتاج أعداد كبيرة من الأجنة المعدلة وراثياً بسرعة وكفاءة في غضون ساعات قليلة فقط. ويمكن استخدام هذه الأجنة المعدلة وراثياً لتحليل وظيفة المحفز أو الجين، أو يمكن تربيتها لإنشاء سلالات معدلة وراثياً. ابدأ هذا الإجراء بنقل خصيتي ضفدعتين أو ضفدعة واحدة تم التضحية بهما إلى أطباق بتري جافة مقاس 60 مليمتر. وباستخدام الملقط، قم بهرس الخصيتين حتى لا تبقى أي كتل مرئية.أضف 2 ml من محلول تحضير النواة البارد (nuclear preparation buffer) أو NPB إلى المستخلص، واستخدم الماصة بلطف لسحب السائل ودفعه للأعلى والأسفل، ثم صب المستخلص عبر أربع طبقات من شاش الجبن في قمع، واجمع الرشاحة في أنبوب سعة 15 ml. بعد ذلك، اشطف الطبق بـ 8 ml من NPB وقم بترشيحه عبر شاش الجبن في الأنبوب. يحتوي هذا المحلول على الحيوانات المنوية، مع ضرورة ارتداء القفازات.اعصر قطعة القماش القطنية لجمع السائل المتبقي، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة 10 minutes عند درجة حرارة 4 °C لترسيب الحيوانات المنوية؛ وبعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، أضف 8 mL من NPB واستخدم الماصة لسحب السائل للأعلى وللأسفل لإعادة تعليق الراسب. قم بعملية الطرد المركزي مرة أخرى، وأثناء ذلك، اترك 1 mL من NPB لتصل إلى درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، وعقب عملية الطرد المركزي، أعد تعليق الراسب في 1 mL من NPB وأضف 50 µL من lysolecithin بتركيز 10 mg/mL المُحضّر حديثاً لنفاذية الحيوانات المنوية. اخلط المزيج برفق ثم حضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، أضف 10 milliliters من محلول 1X MPB البارد مع 3%BSA إلى الأنبوب. لإيقاف تفاعل lyan، قم بطرد الـ lyo المعالج مركزياً. يجب أن تبدو الراسبة أكثر شفافية قليلاً مما كانت عليه من قبل.أعد تعليق الراسب في خمسة ملليلترات من محلول NPB البارد مع 0.3%BSA لغسل نوى الحيوانات المنوية، واخلط المزيج بلطف باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر ثم قم بالطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، صب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 500 ميكرولتر من محلول تخزين النطاف، ثم انقل الحيوانات المنوية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. هذا هو مخزون النوى. ضع هذا الأنبوب على الثلج للتحقق من كمية النوى المستخلصة.ضع 98 µL من منظم تخفيف الحيوانات المنوية، و1 µL من المخزون النووي و1 µL من تخفيف بنسبة 1 إلى 100 من مخزون hux في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. اخلط المزيج جيداً. وباستخدام ماصة آلية، اسمح لكمية صغيرة بالتدفق إلى حجرة مقياس كريات الدم عن طريق الخاصية الشعرية.قم بعدّ النوى باستخدام مجهر مركب. يجب أن ينتج الذكر الواحد من 50 إلى 100 مليون خلية. ضع النوى في درجة حرارة 4 °C طوال الليل للسماح للجليسرول بالنفاذ من أجل حفظ تجميدي أفضل.تُخزن الحصص المجمدة بالنيتروجين السائل عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. تُنقل البويضات التي جُمعت من 8 إلى 12 ضفدعاً إلى دورق وتُغسل أربع مرات في حوالي 35 ملليلتر من محلول استخلاص منظم (extract buffer)، ثم مرتين في 25 ملليلتر من محلول استخلاص العامل الموقف للانقسام (cytostatic factor Extract buffer) أو C-S-F-X-B مع مثبطات البروتياز. ولتعبئة البويضات، تُنقل إلى أنابيب Beckman UltraClear، ثم تُترك البويضات حتى تترسب.أزل أكبر قدر ممكن من C-S-F-X-B ثم قم بالطرد المركزي عند 150 Gs لمدة 60 ثانية تقريبًا. بعد الطرد المركزي، أزل المحلول الزائد من أعلى البويضات المترسبة. بعد ذلك، لسحق البويضات وإنتاج مستخلص سيتوبلازمي، قم بطرد البويضات مركزياً عند 16,000 Gs لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، حيث ينبغي أن تنفصل البويضات إلى ثلاث طبقات.تتكون الطبقة العليا من الدهون، والطبقة الوسطى من السيتوبلازم، والطبقة السفلى من المح. أدخل إبرة قياس 18 gauge متصلة بحقنة عبر الأنبوب عند قاعدة الطبقة الوسطى واسحب المحلول السيتوبلازمي.انقل المحلول إلى أنبوب UltraClear Beckman جديد على الثلج. أضف مثبطات البروتياز إلى السيتوبلازم المعزول ليصل التركيز النهائي إلى one x. قم بطرد التحضير السيتوبلازمي مركزياً عند 16,000 Gs لمدة 10 دقائق.عند درجة حرارة 4 °C، انقل السيتوبلازم المصفى إلى أنبوب جديد. ومن المتوقع الحصول على 0.75 إلى 1 ملليلتر من السيتوبلازم لكل ضفدع. بعد ذلك، أضف إلى العينة مقداراً من خليط الطاقة يعادل 1/20 من حجم المستخلص.انقل السيتوبلازم إلى أنابيب بولي كربونات سميكة الجدران. ولإجراء الطرد المركزي الفائق، أضف كلوريد الكالسيوم بتركيز 1 مولار إلى كل أنبوب ليصل التركيز النهائي إلى 0.4 ميلي مولار. حضن الأنابيب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مما يؤدي إلى تثبيط العامل الكابح للانقسام ودفع المستخلص إلى مرحلة الطور البيني، ثم ابدأ عملية الطرد المركزي.في جهاز طرد مركزي فائق السرعة عند 200, 000 Gs لمدة ساعة ونصف في درجة حرارة أربع درجات مئوية، سينقسم السيتوبلازم إلى أربع طبقات من الأعلى إلى الأسفل. وهي الدهون، والسيتوسول، والغشاء، والميتوكوندريا، والجليكوجين والريبوسومات. أدخل محقنة في الجزء العلوي من الأنبوب واستخرج طبقة السيتوسول.يجب أن تكون هذه الكمية حوالي 1 ml تقريباً. إذا تم تحميل 2 إلى 3 ml في الأنبوب، فانقل الجزء السيتوسولي إلى أنابيب جديدة واطرد العينات بجهاز الطرد المركزي عند 200,000 Gs لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم قسم الرائق إلى حصص بحجم 25 µL في أنابيب سعة 0.5 ml. قم بتجميد الحصص سريعاً في النيتروجين السائل واحفظها عند درجة حرارة -80 °C حتى وقت الاستخدام.لإعداد تفاعل التحول الجيني، استخدم طرف ماصة مقصوصاً لخلط مخزون النوى برفق، ثم ادمج 4 µL من النوى مع 2 µL من البلازميد الخطي في أنبوب دقيق سعة 1.5 mL. قم بالتحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء استمرار عملية التحضين. خفف 0.5 µL من إنزيم القطع في 4.5 µL من الماء.أضف بعد ذلك 1 µL من الإنزيم المخفف إلى 18 µL من محلول تخفيف الحيوانات المنوية، و 2 µL من كلوريد المغنيسيوم و 2 µL من المستخلص عالي السرعة. أضف هذا الخليط إلى تفاعل البلازميد مع النوى. حضّن المزيج لمدة 10 دقائق إضافية لزيادة حجم النوى خلال هذه فترة التحضين.يتم إزالة الغشاء الهلامي من البويضات التي تم الحصول عليها من ضفدعتين إلى ثلاث إناث، ثم تُغسل خمس مرات في محلول 1X MMR. استخدم ماصة ذات فتحة واسعة لنقل 400 إلى 500 بويضة منزوعة الغشاء الهلامي إلى كل طبق آغار يحتوي على 0.2X MMR و 4% فيكوز.اتصل بعد حوالي 15 إلى 20 دقيقة من بدء تفاعل التحول الجيني. اخلط النوى ومستخلص DNA المتفاعل برفق باستخدام طرف ماصة EC مقصوص، ثم أضف 5 µL من التفاعل إلى 150 µL من محلول تخفيف الحيوانات المنوية في درجة حرارة الغرفة لإعادة ملء الإبرة. ضع قطعة من أنبوب TIG الدقيق على طرف ماصة EC مقصوصة سعة 200 µL.اسحب المحلول إلى الداخل. ثم قم بتوصيل الأنبوب بالإبرة واترك المحلول يدخل إلى الإبرة بفعل الجاذبية. قم بتوصيل الإبرة بأنبوب المضخة.ضع البويضات على منصة المجهر. ثم أدخل الإبرة بسرعة في البويضة الأولى. يجب أن يكون الحقن سطحيًا وعموديًا تقريبًا على الغشاء البلازمي للمحور X.لتجنب حدوث تلف، أبقِ الإبرة داخل البويضة لمدة 0.5 ثانية تقريبًا. وعند التوزيع بمعدل 20 نانولتر في الثانية تقريبًا، يمكن إكمال نقل محتويات طبق أو طبقين خلال 20 إلى 30 دقيقة. بعد عمليات الحقن، ضع الأطباق في درجة حرارة تتراوح بين 16 إلى 20 درجة مئوية حتى تصل الأجنة إلى مرحلة 4 إلى 8 خلايا.يجب تربية الأجنة المعدلة وراثياً الناتجة عن عمليات نقل النوى حتى يصبح التعبير الناتج عن المحفز المطلوب مرئياً في الصورة المعروضة هنا. حيث يقود محفز أكتين العضلات التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر في القطعات العضلية لهذا الشرغوف المعدل وراثياً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نقل نوى الحيوانات المنوية لإنشاء أجنة Xenopus معدلة وراثياً.لقد تم إثبات هذا النهج في عملية التحول الجيني باستخدام *Xenopus laevis*، ولكن يمكن تكييفه أيضًا مع *Xenopus tropicalis* بإجراء تعديلات طفيفة.

production-transgenic-xenopus-laevis-restriction-enzyme-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

الغشاء النووي التجمع هو خطوة أساسية في الخلية دورة انقسام ، ويمكن تكرار هذه العملية في أنبوب الاختبار من خلال الجمع بين لونين القيطم الحيوانات المنوية ، والعصارة الخلوية ، والغشاء الكسور الخفيفة. تتشكل نواة كاملة ، بما في ذلك الأغشية النووية مع المجمعات المسام ، وهذه النواة هي قادرة على إعادة تشكيل العمليات النووية العادية.

في المختبر عن طريق الجمعية النووية مجزأ مقتطفات البيض القيطم

هنا علينا أن نظهر للحشوية...

Microinjection من البويضات المورق القيطم

القدرة على إنتاج لالجينات...

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

تقنية لزرع "المتطرفة الأمامي المجال" بين أنسجة الوجه القيطم المورق وقد تم تطوير الأجنة. يمكن نقل الأنسجة من احد خلفية التعبير الجيني إلى أخرى، والسماح للدراسة المتطلبات المحلية للتنمية والقحفي للانزعاج التفاعلات بين مناطق الوجه.

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

نصف طرق التلاعب بالبويضات غير الناضجة Xenopus laevis ، والنضج المختبري للبويضات إلى البويضات ، وحقن المنوية داخل الهيولى. يسمح هذا البروتوكول بتدهور بعض بروتينات الأم والإفراط في التعبير عن الجينات ذات الأهمية عند الإخصاب ، وبالتالي فهو ذو قيمة لدراسة أدوار عوامل محددة في التطور الجنيني المبكر.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

نصف بويضة Xenopus ونظام غطاء حيواني للتعبير عن استنساخ الجينات القادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختص ، ونناقش تقنيات التحليل اللاحق لهذه الجينات. هذا النظام مفيد في التحديد الوظيفي لمجموعة واسعة من المنتجات الجينية.

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

الجينات الأساسية للبقاء على قيد الحياة تشكل عقبات تقنية لإنشاء خطوط المسخ. قفزات واسعة تلتف الفتك بالجمع بين الجينوم التحرير مع زرع الخلايا البدائية خلق الحيوانات البرية من نوع تحمل طفرات الخط. قفزات واسعة ويسمح أيضا بكفاءة توليد طفرات فارغة متماثل في الجيل1 و. ويتجلى هنا، خطوة الزرع.

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعزيز التكامل التحوير وإنتاج مؤسس الفئران المحورة وراثيا بكفاءة عالية بحقنه بسيطة ناقل لينتيفيرال في الفضاء بيريفيتيليني البويضات المخصبة.

لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي

يهدف هذا البروتوكول إلى توضيح كيفية حقن خليط الحمض النووي/DOTAP بالميكروين في عيون الأجنة القديمة من Xenopus laevis في يوم من الأيام، وكيفية تصوير وإعادة بناء البروتين الفلورسنت الأخضر الفردي (GFP) الذي يعبر عن الأربور اللافسونية البصرية في العقول المتوسطة التكتال سليمة ، والذين يعيشون Xenopus الضفادع.

الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles

تعد التلاعبات الجنينية مثل استئصال الخلايا وزرعها أدوات مهمة لدراسة التطور المبكر. يصف هذا البروتوكول جهاز زرع بسيط وفعال لإجراء هذه التلاعبات في أجنة حمار وحشي.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

اكتشف طريقة إنتاج القيطم المورق المعدل وراثياً باستخدام زرع النوى المنوية واستخلاص البيض. تتيح هذه التقنية دراسة التعبير الجيني أثناء تطور الأجنة بكفاءة عالية.

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

استكشف المزيد من الفيديوهات