استخراج الحمض النووي من مشبك الذيل: طريقة مستخدمة في التنميط الجيني لأسماك الزرد

- ابدأ الإجراء بوضع سمكة بالغة مخدرة على كومة من الورق الماص. استخدم الآن شفرة حلاقة معقمة لقطع زعنفة الذيل ونقل الأسماك بسرعة إلى خزان يحتوي على مياه عذبة للاسترداد. انقل مشبك الذيل إلى أنبوب نظيف يحتوي على عازل للتحلل. يحتوي المخزن المؤقت للتحلل على منظفات غير أيونية تعمل على إذابة غشاء البلازما والغشاء النووي للخلية. يحتوي المخزن المؤقت أيضا على إنزيم يسمى البروتيناز K الذي يكسر البروتينات ويتيح إطلاق الحمض النووي في المحللة. كما أنه يحط من نوكليازات ، ويحمي الحمض النووي من هضم النوكلياز.

الآن ، اترك الأنابيب ذات مشابك الذيل في حاضنة طوال الليل لتكسير الأنسجة تماما عند 55 درجة مئوية مع الدوران المستمر. بعد ذلك ، قم بتسخين الأنبوب عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعطيل البروتيناز K. الطرد المركزي للأنبوب إلى حبيبات المواد غير المهضومة ونقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي إلى أنبوب آخر. أضف الكحول لترسيب الحمض النووي وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لجمع الحمض النووي في حبيبات. في البروتوكول التالي ، سنقوم بعزل الحمض النووي من مشبك ذيل سمكة الزرد البالغة ومن جنين كامل.

- في يوم تحضير الحمض النووي ، أضف البروتيناز K الطازج إلى مخزن التحلل بتركيز 1 ملليغرام لكل مليلتر. يمكن جمع الأنسجة من سمكة بالغة باستخدام مشبك زعنفة أو من سمكة جنينية.

أولا ، تخدير الأسماك في محلول التريكائين. انتظر حتى تتباطأ حركات الخياشيمية. بعد ذلك ، ضع السمكة على كومة من المناديل ، وباستخدام شفرة حلاقة معقمة ، قم بقطع قطعة صغيرة من زعنفة الذيل يبلغ طولها حوالي 2 إلى 3 ملليمترات. وضع السمك بسرعة في خزان مزود بمياه عذبة للاسترداد.

التقط مشبك الزعنفة بطرف ماصة معقم وانقله إلى أنبوب مملوء بمائة ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي. تأكد من تسمية كل من خزان والأنبوب. احتضان جميع الأنسجة المجمعة لمدة أربع ساعات على الأقل وحتى بين عشية وضحاها عند 55 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، قم بتعطيل البروتيناز K عن طريق تسخين الأنابيب عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يجب استخدام هذه العينات لتفاعل البوليميراز المتسلسل على الفور ، ولكن يمكن أيضا تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.