التفكك الميكانيكي: طريقة للحصول على خلايا قابلة للحياة من الأنسجة

أولا ، قم بوزن جزء من الأنسجة وقياس طوله وعرضه وارتفاعه. ضع الأنسجة في طبق استزراع بوسط ثقافة وقم بتقطيعها إلى قطع صغيرة باستخدام مشرط. انقل كل شيء إلى أنبوب C للتجانس باستخدام ماصة باستور.

ضع الأنبوب في جهاز فصل ميكانيكي وقم بتشغيل الدورات حسب الحاجة. يستخدم الجهاز قوى ميكانيكية لاستخراج خلايا مفردة قابلة للحياة من عينة الأنسجة مع الحفاظ على سلامة الخلايا ، بما في ذلك البروتينات السطحية. صب التجانس من خلال مصفاة خلوية مثبتة على أنبوب طرد مركزي.

أعد تجانس الأنسجة المتبقية وقم بتصفية الجانس من خلال مصفاة الخلية في الأنبوب. الطرد المركزي المتجانس وإزالة المادة الطافية. الآن ، أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط المزرعة وانقل كمية صغيرة من تعليق الخلية إلى أنبوب يحتوي على صبغة زرقاء من التريبان.

بعد التلوين ، انقل الخلايا إلى شريحة مقياس الدم. عد الخلايا الشفافة القابلة للحياة. تأخذ الخلايا الميتة البقعة ، لأن غشاء الخلية ليس سليما. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء تفكك غير إنزيمي للأنسجة البشرية الطازجة للتحليل الكمي والنوعي لخلايا CD45 +.

- ابدأ بوزن عينة الأنسجة ثم قياس طول الأنسجة وعرضها وارتفاعها. ثم انقل جزء الأنسجة إلى طبق بتري صغير يحتوي على 1 مليلتر من وسط الخلايا المكونة للدم المحدد كيميائيا والخالي من المصل واستخدم مشرطا معقما لتقطيع العينات إلى قطع صغيرة من 1 إلى 2 مليمتر مربع. بعد ذلك ، انقل محتويات الطبق إلى أنبوب C للفصل الميكانيكي واشطف الطبق والمشرط ب 2 ملليلتر من المتوسط.

أضف الغسيل إلى الأنبوب C ثم قم بتشغيل برنامج الفصل الميكانيكي 8.01 مرتين متتاليتين لتجانس شظايا الأنسجة برفق في معلق خلية واحدة. بعد الدورة الثانية ، صب التجانس من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ثم استخدم نفس ماصة باستور من غسل طبق بتري لنقل أي سائل متبقي في الأنبوب C إلى مصفاة الخلية.

بعد ذلك ، استخدم ماصة دقيقة سعة 1 مليلتر لنقل السائل المصفى إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وشطف الأنبوب C ب 3 ملليلتر إضافي من المتوسط. انقل هذا الغسيل من خلال مصفاة الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل. ثم حرك الأنسجة غير المتجانسة برفق حول المصفاة بطرف نظيف سعة 1 مليلتر للضغط على أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي المحاصر في الأنسجة في أنبوب سعة 50 ملليلترا. الآن ضع مصفاة الخلية رأسا على عقب فوق الأنبوب C الأصلي واشطف المصفاة ب 3 ملليلتر أخرى من الوسط حتى تسقط الأنسجة غير المتجانسة مرة أخرى في الأنبوب C.

أعد تجانس الأنسجة لدورتين أخريين كما هو موضح للتو ، ثم اسكب التجانس الثاني من خلال مصفاة الخلية مرة أخرى. اشطف الأنبوب C ب 3 ملليلتر أخرى من المتوسط. ثم قم بتصفية المادة الطافية من خلال المصفاة واضغط على السائل المتبقي من الأنسجة ، كما هو موضح للتو. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون هناك حجم يبلغ حوالي 2.5 مل من تعليق الخلية المفردة في الأنبوب سعة 15 مليلتر ، ويجب ملاحظة ما يقرب من 9 ملليلتر في أنبوب 50 ملليلتر.

لفصل المادة الطافية للأنسجة عن الخلايا ، قم أولا بالطرد المركزي كلا الأنبوبين المتجانسين لمدة 15 دقيقة عند 600 جي ثانية في درجة حرارة الغرفة. صب المادة الطافية من أنبوب سعة 15 مليلتر في أنبوب سعة 1.5 مليلتر ، ووضعها عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية من أنبوب 50 ملليلترا. ثم اضغط برفق على كل أنبوب على سطح صلب لتفتيت كل حبيبات من الكريات الخلية.

أعلق حبيبات الخلية السائبة في أنبوب 50 مليلتر مع 500 ميكرولتر من الوسط ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مليلتر لإعادة تعليق الحبيبات الثانية. ثم اشطف الأنبوب سعة 50 مليلتر ب 500 ميكرولتر أخرى من الوسط وانقل الغسيل إلى أنبوب سعة 15 مليلتر لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلايا. بعد حساب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد trypan blue ، قم بتقطيع تعليق الخلية.

أخيرا ، قم بتدوير المادة الطاففية للأنسجة المحفوظة. ثم انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب نظيف واحد على الأقل دون لمس الحبيبات أو إزعاجها وقم بتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية لتحليلها في المستقبل.