الكيميائي استجابة الكائنات المجهرية البحرية الصغيرة الحجم لطبقات غذائية

مرحباً، اسمي ماركوس. أنا أعمل مع البروفيسور رومان ستوكر في قسم الهندسة المدنية والبيئية في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT)، وسأقوم بتوضيح كيفية صنع قناة دقيقة باستخدام تقنية التصوير الذاتي. وللبدء، يتعين علينا تصميم القناع.

هذا هو القناع، وهو يمثل التصميم النهائي للقناة الدقيقة التي نعتزم تنفيذها. هذا تصميم لحاقن، حيث يمكننا تكوين طبقة رقيقة من المواد المغذية ونضع فيها كائنات دقيقة تسبح بداخلها لنرصد كيف يحدث الانجذاب الكيميائي، وهذه قناة ذات تجويف جانبي لتوليد دوامة دقيقة داخل التجويف، وسيكون هناك مقطع فيديو يوضح ذلك لاحقاً. بعد الحصول على القناع، نأخذ الرقائق إلى الغرفة النظيفة ونضعها في أطباق بتري. وسنتوجه الآن إلى الغرفة النظيفة.

حسناً، بعد طباعة القناع وتجهيزه، نحن الآن في الغرفة النظيفة للبدء بعمليات التصنيع الدقيق. ما سأقوم به الآن هو أخذ قطعة من الرقاقة النظيفة التي اشتريتها للتو، وأريد التأكد من أنها نظيفة للغاية باستخدام المذيبات الثلاثة التالية. الخطوة الأولى هي التنظيف باستخدام acetone ثم methanol مباشرة.

ثم تأتي الخطوة النهائية وهي استخدام الإيزوبروبانول. ونحن نعمل على الجانب اللامع من الرقاقة، وهو الجانب المجهز لعملية الطلاء. وسأقوم الآن بتجفيفه باستخدام النيتروجين.

بعد تجفيف الرقاقة، نضعها الآن داخل فرن عند درجة حرارة 130 Celsius ونقوم بخبزها لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق. وفي هذه الأثناء، وبينما ننتظر انتهاء عملية خبز الرقاقة، يمكننا تجهيز لوحي تسخين، الأول عند 65 Celsius والآخر عند 95 Celsius. بعد الخبز لمدة خمس دقائق، نخرج الرقاقة من الفرن ونتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق تقريباً.

وبعد ذلك نصبح مستعدين لعملية الطلاء الدوراني. قبل سكب المقاوم الضوئي، نحتاج فقط إلى التأكد من عدم وجود جزيئات غبار على السطح، لذا نستخدم النيتروجين لنفثه فوق الرقاقة. وتكون حركة النفث من المركز نحو الخارج.

سأقوم الآن بسكب مادة المقاوم الضوئي (photo resist) فوق هذه الرقاقة. نسكب كمية تبلغ حوالي 3 mL. حاول وضع الزجاجة في أدنى مستوى ممكن حتى لا تتكون فقاعات أثناء سكب مادة المقاوم الضوئي فوق الرقاقة.

لذا، الآن نترك المادة المقاومة للضوء على الرقاقة لمدة دقيقة واحدة تقريبًا قبل أن نبدأ في تدويرها. وكما ذكرت، سأقوم بعمل طبقة طلاء بسمك 100 micron. لذا، سنضبط إجمالي وقت التدوير على 55 seconds، ويمكننا البدء في التدوير.

أولاً، نحاول زيادة سرعة الدوران تدريجياً من صفر إلى 500 RPM خلال خمس ثوانٍ ونتركها تدور لمدة 10 ثوانٍ تقريباً حتى تتمكن من رؤية مادة المقاوم الضوئي وهي تغطي الرقاقة بأكملها، ثم نزيد السرعة إلى 3000 RPM لمدة سبع ثوانٍ تقريباً ونتركها تدور لمدة 30 ثانية. بعد طلاء الرقاقة بالمقاوم الضوئي، أضع الرقاقة الآن فوق الصفيحة الساخنة وأقوم بعملية الخبز الأولي عند 65 °C لمدة خمس دقائق و 95 °C لمدة 20 دقيقة. بعد اكتمال الخبز الأولي عند 95 °C، نقوم بتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة، ولكن قبل ذلك، نبردها عند 65 °C لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق تقريباً لتجنب الانخفاض السريع في درجة الحرارة.

ثم نضعها في درجة حرارة الغرفة لتبرد لمدة خمس دقائق تقريباً. والآن سأقوم بتعريضها للأشعة فوق البنفسجية UV لكي يتصلب الجزء المعرض للضوء، بينما يتم غسل الجزء غير المعرض لاحقاً. وهذا هو الجزء الذي نستخدم فيه القناع، وكما ترون، يتكون القناع من جزأين: جزء شفاف وجزء آخر معتم تماماً أو أسود في هذه الإعدادات.

لذا، سأقوم بوضع هذا القناع فوق الرقاقة المطلية. القناع الذي تحصل عليه من شركة الطباعة له جانبان؛ أحدهما هو الجانب الذي تتم الطباعة عليه باستخدام الحبر.

وهذا هو الموقع الذي ترغب في جعله ملامساً للرقاقة. سأقوم الآن بتعريض الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية عبر القناع. ولأغراض السلامة، سأرتدي نظارات الوقاية هذه.

تعتمد مدة التعريض على مادة SUA المستخدمة وكذلك السُمك المراد تحقيقه. والآن، بعد عملية التعريض، سأضع الرقاقة على لوح تسخين بدرجة حرارة 65 درجة مئوية وأقوم بخبزها مجدداً لمدة خمس دقائق، ثم عند 95 درجة Celsius لمدة 20 دقيقة. وأذكركم بأن وقت الخبز هذا يختلف باختلاف السُمك المطلوب وأيضاً باختلاف مادة SUA المستخدمة.

بعد هذه الخطوة، سنقوم بتحميض الرقاقة. ويقصد بالتحميض إزالة الجزء غير المرغوب فيه من مادة المقاوم الضوئي بحيث لا يتبقى على الرقاقة سوى المنطقة المعرضة للضوء. ومن أجل تحميض الرقاقة وغسل الجزء غير المرغوب فيه من المقاوم الضوئي، سنستخدم محلول التحميض.

في هذه الحالة، سأستخدم خلات البومونال كمظهر، وسأقوم بسكب هذا المذيب في هذا الكأس، ثم أضع الرقاقة وأغمرها في الكأس لمدة 10 دقائق تقريبًا. ومرة أخرى، يختلف الوقت اعتمادًا على السماكة والمذيب المستخدم. والآن، بعد مرور 10 دقائق، يمكنك أن ترى أن ما تبقى على هذه الرقاقة هو تصميم القناة المطلوب، وقد تم غسل جميع الأجزاء غير المرغوب فيها، وسأقوم فقط بشطفها.

نستخدم المذيب نفسه، على أن يكون جديداً، ونفس أسيتات البوليون، حيث نقوم فقط بوضع كمية منه فوق الرقاقة لشطفها. وأخيراً، ولغسل المذيب، نستخدم الإيزوبروبانول ونقوم بشطفها. والآن نقوم بتجفيفها باستخدام النيتروجين.

والآن لديك رقاقة نظيفة تحمل النمط المطلوب، والتي نطلق عليها اسم القالب الرئيسي. سنعود الآن إلى المختبر لصب PDMS عليها ومتابعة بقية الإجراءات.

لقد عدنا الآن من الغرفة النظيفة ولدينا القالب الرئيسي، وهو أساساً القالب الذي سنستخدمه في هذه العملية. ما سنفعله تالياً هو صب PDMS، وهو بوليمر سيخضع لعملية المعالجة. وكما ترون، إذا صببنا البوليمر فوق هذا القالب، فستتكون بعض الأخاديد على سطح البوليمر، وفي النهاية، إذا قمنا بربطه بشريحة زجاجية، فإن هذا البوليمر نفسه سيشكل القناة.

سنقوم الآن بتحضير الـ PDMS. هذا هو الـ PDMS، وهو البوليمر، بولي داي ميثيل سيلوكسان (PDMS). وهذا هو عامل المعالجة.

سأقوم بسكب عامل المعالجة هذا في هذا الكوب، وسكب الـ PDMS في هذا الكوب، ثم خلطهما بنسبة 1 إلى 10. وبشكل عام، نفضل استخدام أداة للتحريك لضمان التجانس. وأثناء التحريك، تتكون الكثير من الفقاعات، والتي تعد بمثابة مؤشر يخبرنا بما إذا كنا قد أتممنا عملية التحريك أم لا.

الآن، وبعد خلط الـ PDMS مع عامل المعالجة، أصبحنا مستعدين لصب هذا الخليط فوق القالب الرئيسي، وهو عبارة عن رقاقة (wafer). ولضمان عدم تحرك الرقاقة أثناء عملية الصب، قمنا بتثبيتها باستخدام شريط لاصق. وقبل صب خليط الـ PDMS فوق الرقاقة، نود محاولة تنظيف الرقاقة قدر الإمكان من الغبار الذي قد يكون قد سقط عليها.

لذا نقوم بتشغيل الضاغط لإزالة الغبار عن الرقاقة. حسناً، يمكنكم ملاحظة أن الـ PDMS يحتوي على الكثير من الفقاعات. لذا سنقوم بإزالة هذه الفقاعات بوضعها داخل غرفة تفريغ.

تستغرق عملية التفريغ حوالي 30 دقيقة لإزالة جميع الفقاعات. وبمجرد الانتهاء من إزالة الفقاعات، نقوم بإخراج العينة ووضعها في الفرن عند درجة حرارة 65 °C وخبزها لمدة 12 ساعة على الأقل. وبعد مرور 12 ساعة، ستكون الرقاقة جاهزة للقطع.

سأستخدم هذه السكين لقص الـ PDMS وإزالته عن الرقاقة، ثم سأستخدم هذه الثاقبة لثقب الفتحات الخاصة بمداخل ومخارج الأنابيب. عند القص، قم بإدخال السكين حتى تلامس الرقاقة، ولكن لا تضغط بقوة مفرطة لتجنب كسر الرقاقة، وقم بالقص حول القناة. الآن قم بتقشيرها.

هل تملكون، بحيث يمكنك الآن أن ترى أن هذه هي القناة، وهي النمط المأخوذ من الرقاقة. لذا يمكنك أن ترى أنها متطابقة. والآن تم حفر هذا النمط على هذا البوليمر، وهو PDMS.

وبمجرد ربط هذه القطعة بشريحة زجاجية، ستشكل القناة الخاصة بتجربتنا. الخطوة التالية، وهي خطوة مهمة، هي تذكر ثقب الفتحات حتى نتمكن من إدخال المداخيل والمخارج في القنوات الدقيقة بعد ثقب القنوات الدقيقة في مادة PDMS. لذا استخدمنا الشريط اللاصق لتثبيت جانب القناة، أي حيث يوجد المجرى، وقمنا بلصقه.

والسبب في تغطية هذه القناة باستخدام الشريط اللاصق هو إزالة جميع جزيئات الغبار. الخطوة التالية هي الربط بالبلازما. وقبل عملية الربط بالبلازما، التي سنقوم بها في المختبر الآخر، سنقوم بإزالة الشريط لكشف السطح الذي نريد ربطه، وهو هذا السطح والشريحة الزجاجية معاً، ثم تعريضهما لبلازما الأكسجين، وبعد ذلك، نضعهما معاً ليحدث الربط.

مرحباً، اسمي جاستن سيمور، وأنا باحث في مرحلة ما بعد الدكتوراه في مختبر رومان ستوكرز في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT). ويركز بحثي على البيئة الميكروبية، وتحديداً دراسة كيفية تمكن الميكروبات البحرية من العثور على بقع الغذاء في المحيط. ونحن نستخدم تقنيات الموائع الدقيقة لدراسة هذه الأنواع من الأنماط.

لذا، سنستخدم القناة التي أوضح ماركوس كيفية إنتاجها سابقاً وبعد الربط بالبلازما. وبذلك نكون قادرين على استخدامها في تجربة للموائع الدقيقة. وقبل البدء بهذه التجربة، نحتاج إلى تحضير الركائز التي سنستخدمها في التجربة.

وفي تجربة اليوم، سنبحث في كيفية قدرة العوالق النباتية البحرية *Donatella turcica* على إيجاد بقع مجهرية من الغذاء. وفي هذه الحالة، يتمثل الغذاء في الأمونيوم، حيث سنزودها بتركيز 100 µM من الأمونيوم. ومن خلال هذه التجارب، سنتمكن من رؤية بقع الغذاء عن طريق إضافة صبغة فلورية إلى العناصر الغذائية التي نوفرها لها.

لذلك نستخدم صبغة الفلوريسين. هنا أقوم بسحب الفلوريسين بتركيز نهائي قدره 100 micromolar وإضافته إلى الأمونيوم، الذي نستخدمه كمادة مغذية. ويمكننا بعد ذلك تصوير هذه المادة المغذية باستخدام المجهر الفلوري، مما يتيح لنا مراقبة كيفية انتشار بقعة من المواد المغذية، ومن ثم مراقبة استجابة الكائنات الحية لتلك البقعة من المواد المغذية.

في تجارب الموائع الدقيقة، نستخدم محاقن زجاجية. لذا، فإن أول شيء نريد القيام به هو إضافة الركائز والكائنات الحية إلى المحاقن التي سنستخدمها. والخطوة التالية هي إدخال الأنابيب في نظام الموائع الدقيقة.

ونقوم بذلك على منصة المجهر؛ حيث نضع قناة الموائع الدقيقة على منصة المجهر، ثم نُدخل الأنابيب في المداخل والمخارج. بعد ذلك، نضع خزان النفايات ونتأكد من ملئه بالسوائل حتى المنتصف، بحيث تكون الأنابيب الموجودة في خزان النفايات مغمورة بالكامل.

يتيح لنا ذلك الحفاظ على ضغط ثابت داخل القناة. بعد ذلك، نقوم بتوصيل المحاقن بالأنابيب التي تغذي قناة الموائع الدقيقة التي تحتوي على الكائنات الحية، والتي تكون في هذه الحالة *Donella lector*، والركيزة المغذية، والتي تكون في هذه الحالة ammonium. ثم نقوم بإعداد المجهر ومعاينة قناة الموائع الدقيقة في الموضع المناسب قبل البدء في التجارب.

بمجرد استقرار القناة في موضعها، ننتقل بعد ذلك لعرض القناة باستخدام الكاميرا ويمكننا رؤيتها على جهاز الكمبيوتر. يمكننا الآن إجراء تعديلات أدق على التركيز (focus)، كما يمكننا الآن رؤية المحقن الذي نستخدمه لحقن العناصر الغذائية. ويتكون هذا المحقن من طرف إبرة سلكية بقطر 100 micrometer مدمجة في قناة الموائع الدقيقة (microfluidics channel).

ويمكننا إنتاج تدرج في المغذيات عن طريق حقنها. ومن هذه النقطة، وقبل البدء في التجارب، نحتاج إلى إزالة أي فقاعات قد تكون تسللت إلى نظام الموائع الدقيقة. ونقوم بذلك باستخدام سرنجة مملوءة بمياه بحر اصطناعية في هذه الحالة، والتي يمكننا توصيلها بقناة الموائع الدقيقة عبر صمام.

وبعد ذلك، نقوم بدفع هذه الحقنة لإزالة الفقاعات من القناة. ويمكننا إزالة الفقاعات بإحدى طريقتين، إما عن طريق إخراجها بقوة عبر الضغط الناتج عن الحقنة من خلال المخرج، أو يمكننا أيضاً إزالة الفقاعات عن طريق دفعها عبر جدران مادة PDMS، وهي مادة نفاذة للغازات. وبمجرد إزالة الفقاعات واستعدادنا لبدء التجربة، نقوم بعد ذلك بضبط معدلات التدفق المناسبة للحقن والمواد داخل القناة باستخدام مضخة حقن.

في هذه الحالة، نستخدم معدل تدفق قدره 2 µL/min، وهو ما يعادل معدل تدفق في القناة يبلغ 266 µm/s. وبمجرد ضبط معدل التدفق المناسب، يمكننا بعد ذلك بدء التجربة من خلال تفعيل التدفق، مما يؤدي إلى تكوين شريط رقيق من العناصر الغذائية. ولتمكيننا من رؤية العناصر الغذائية أثناء حقنها في القناة من نقطة الحقن، نقوم بإضافة صبغة الفلوريسين إلى العناصر الغذائية وتصويرها باستخدام مجهر الفلورة APF؛ ومن ثم يمكننا دراسة ديناميكيات الرقعة (patch dynamics) عن طريق إيقاف التدفق في قناة الموائع الدقيقة ومراقبة شريط العناصر الغذائية وهو ينتشر جانبياً من موضعه الأصلي.

ننتقل بعد ذلك إلى مجهر تباين الطور لتصور الكائنات وهي تسبح داخل القناة ومراقبة مواقعها بالنسبة لبقعة المغذيات. يمكننا القيام بذلك عن طريق التقاط سلسلة من الإطارات بمعدل 10 إطارات في الثانية، مما ينتج عنه مقطع فيديو يمكننا من خلاله تصور هذه الكائنات. ويمكننا بعد ذلك تصور الكائنات السابحة عن طريق حساب الفروق الزمنية بين إطارين فرديين حيث يتم طرح إطار من الإطار السابق، وبذلك يتم تصور الأجسام المتحركة فقط.

وبذلك يمكننا إزالة ضجيج الخلفية من الصور. بعد ذلك، نقوم بتسجيل مقاطع فيديو على فترات منتظمة لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة بعد الإطلاق الأولي لرقعة المغذيات. وباستخدام برنامج تحليل الصور لتركيب مواقع الكائنات الحية من إطار إلى آخر في التسلسل، يمكننا مراقبة التغيرات في مواقع هذه الكائنات للحصول على معلومات حول مسارات سباحتها، والتي يمكننا من خلالها لاحقاً الحصول على معلومات أكثر تفصيلاً حول إحصائيات السباحة، بما في ذلك السرعات والتغيرات في الاتجاه.

لقد سمحت لنا هذه التجارب، وللمرة الأولى، بفحص كيفية قدرة الميكروبات البحرية على إيجاد بقع المغذيات دقيقة المقياس والاستفادة منها بشكل مباشر. وقد يكون لهذا تداعيات مهمة على الديناميكيات الغذائية ودورة المغذيات في المحيط. وإلحاقاً بما ذكره جاستن، فإن كيفية تفاعل الكائنات الدقيقة، ولا سيما البكتيريا، مع غذائها في المحيط يمكن أن تؤدي إلى تأثيرات عديدة على الدورات الكيميائية الحيوية.

ومع ذلك، فإن المحيط ليس ساكناً تماماً، فهناك العديد من ظروف التدفق مثل الاضطراب الذي يتولد بفعل الرياح أو عند السطح. وعلى مقياس الكائنات الدقيقة، فإن ما تواجهه هذه الكائنات ليس الاضطراب الكبير في حد ذاته، بل هو جهد القص، وتعرف أصغر بقايا الاضطراب باسم الدوامات كولموجوروف (Kolmogorov eddies). وما نحاول القيام به هنا هو دراسة تأثير هذه الدوامات على سلوك السباحة للكائنات الدقيقة.

وللقيام بذلك، سنقوم بإنشاء قناة أخرى باستخدام هذه الكتلة التي عرضتها لكم سابقاً. وهناك تجويف في المركز. واسمحوا لي برسمه لتكبير المخطط.

إذًا، هكذا يبدو شكل القناة؛ هذا هو المنظر الذي نراه من الأعلى، ونقوم بحقن التدفق من اليسار إلى اليمين، وبسبب قوى القص، تتولد منطقة إعادة تدوير داخل هذا التجويف. وهذا التجويف يمثل غدة في الجسم. يمكننا ببساطة استخدام نفس الإعداد الذي شرحه جاستن سابقًا؛ فعندما تكون مضخة الحقنة متوقفة، ولم أقم بتشغيل أي تدفق، يمكنك ملاحظة أن البكتيريا تسبح بشكل عشوائي وبحرية تامة داخل هذا التجويف.

ولا يوجد اتجاه مفضل. وما تشاهدونه في هذا المقطع هو فيلم فارق زمني، وهي نفس التقنية التي يستخدمها جاستن تماماً. لذا، عندما يكون التدفق سريعاً جداً، كما ترون، يتم دفع البكتيريا بعيداً بواسطة الدوامة.

ويتبع مسار البكتيريا نفسها خطوط الانسياب الخاصة بالدوامة. والأمر الأكثر إثارة للاهتمام في الواقع هو ما يحدث عند تشغيل مضخة الحقنة، ولكن السرعة لا تكون كبيرة جداً.

ليست السرعة كبيرة لدرجة أن البكتيريا، لا تستطيع البكتيريا مقاومتها. ولكن بطريقة ما، لا يزال بإمكانك رؤية ما يشبه الدوامة في هذا المقطع. لذا، تعلمنا من هذه التجربة أنه في حالة وجود تيار مضطرب قوي جداً، تكون البكتيريا تحت رحمة التدفق، ولا تكون قادرة على مقاومته.

ومع ذلك، في مناطق الاضطراب الخفيف، يظلون قادرين على السباحة من تلقاء أنفسهم.