نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استنبات مزارع من الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية للجنين البشري، أو RPE، والتي يمكن استخدامها كنموذج. في أبحاث أمراض العين البشرية، يتم استلام الأنسجة من المتبرعين على شكل مقل عيون سليمة. وتتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في قص العضلات الزائدة والأنسجة الضامة، ثم فتح العين عن طريق إزالة القرنية والعدسة.

تُعالج العين باستخدام مادة dispa وتُبسط، ومن ثم تُقشر طبقة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية (RPE) أحادية الطبقة عن المشيمية. تُزرع خلايا RPE المستأصلة في دوارق وتُترك لتنمو لعدة أسابيع حتى تصل إلى مرحلة الطبقات الأحادية المتلاحمة وتطور الصبغة. وتُستخدم المزارع الخلوية في تجارب وظيفية مخبرية (in vitro).

تُكرر التجارب الناجحة التي أُجريت في المختبر في نماذج حيوانية للتجارب قبل السريرية، حيث يمكن تقييم استجابات ظهارة صباغ الشبكية (RPE) بشكل أفضل في بيئات إشارات أكثر تعقيداً. سيؤدي النموذج الموضح هنا إلى فهم أفضل لفسيولوجيا ظهارة صباغ الشبكية وإلى تدخلات علاجية جديدة لعلاج أمراض العين. مرحباً، اسمي شيلدون ميلر.

يقع مختبري في المعهد الوطني للعيون، وهو جزء من المعاهد الوطنية للصحة في حرم بيثيسدا بماريلاند. مرحبًا، أنا أركي من مختبر ميلر. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحضير مستنبتات أولية لخلايا الظهارة الصبغية للشبكية الجنينية البشرية.

سيتم تحضير هذه الخلايا كطبقات أحادية متراصة يمكن تثبيتها في غرف "sing" المعدلة. كما سنستخدم خلايا الظهارة الصباغية الشبكية (RPE) البشرية المعزولة هذه في دراسات الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة. نحن نعتمد هذا الإجراء في مختبرنا لإنشاء مزارع أولية من الخلايا الظهارية لدراسة وظيفة وتنظيم العمليات الفسيولوجية والفسيولوجيا المرضية، ولتطوير نماذج حيوانية سريرية للأمراض.

نركز هنا على الظهارة الصبغية الشبكية أو RPE، التي تقع في الجزء الخلفي من العين، وتفصل بين الشبكية العصبية والتروية الدموية للمشيمية. يوضح هذا المخطط التوضيحي للعين موقع طبقة RPE في الجزء الخلفي من العين بجوار المستقبلات الضوئية مباشرةً. ويُظهر الشكل المدرج خلايا الشبكية مع وجود المستقبلات الضوئية على اليمين والخلايا العقدية على اليسار.

تتميز هذه الظهارة بنشاط أيضي مرتفع للغاية؛ فهي تقوم ببلعمة المستقبلات الضوئية باستمرار وبشكل يومي، كما تعمل على تخزين وإعادة تدوير ونقل صبغة الرؤية فيتامين A إلى المستقبلات الضوئية. وفي الدورة البصرية، تعمل هذه الظهارة بشكل استتبابي للحفاظ على التركيب الكيميائي وحجم المساحات خارج الخلوية المحيطة.

تُعد القطبية خاصية بالغة الأهمية في الخلايا الظهارية. وتعتبر عملية التوصيل غير المتماثل والمستمر للبروتينات إلى الأغشية القمية والقاعدية الجانبية عملية منظمة تتيح للظهارة القيام بنقل موجّه للمستقلبات والأيونات والسوائل من حيز خارج خلوي إلى آخر. ويساعد هذا النشاط الظهارة في الحفاظ على صحة وسلامة الشبكية العصبية.

يتيح التحضير في المختبر الذي نصفه هنا تحليل بروتينات النقل والمستقبلات ومسارات الإشارات التي تحدد قطبية الظهارة ووظيفتها قبل البدء في عملية التشريح. قم بتجهيز طبق يحتوي على 12 بئرًا داخل غطاء تدفق صفائحي باستخدام محاليل بدرجة حرارة الغرفة. تتطلب كل عين بئرًا واحدًا من محلول antibiotic antimycotic بتركيز 10x، وبئرين من محلول 1X PBS، وبئرًا واحدًا من disc space بتركيز 2 units/mL مخفف في وسط 5%RPE مع المصل. املأ طبق تشريح مبطن بالسيليكون بمحلول 1X HBSS، ثم قم بتصريف السائل وانقل كل عين إلى بئر واحد من محلول antibiotic antimycotic.

يُحضن لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجنب تطبيق أي ضغط زائد على مقلة العين. اشطف العين في بئرين متتاليين من XPBS لإزالة المضاد الحيوي الزائد.

ثم استخدم الملقط لنقلها إلى طبق التشريح المملوء بـ one X-H-B-S-S تحت مجهر تشريح ستيريو. استخدم مقص القزحية لإزالة العضلات الزائدة والأنسجة الضامة المحيطة بالعين. قم بمحاذاة العين بحيث تكون القرنية متجهة للأعلى.

استخدم إبرتين معقمتين بقياس 27 gauge لتثبيت العين من خلال النسيج الضام بالوسادة السيليكونية دون إتلاف الصلبة. وفي هذا الوضع، استخدم سكين المنفذ الجانبي لإجراء شق عبر الصلبة. يجب أن يكون الشق على مسافة تعادل ثلث المسافة من خط استواء العين إلى السطح الأمامي.

استخدم مقصات القزحية لمواصلة القطع بشكل دائري حول العين لتجنب إتلاف الظهارة الصبغية للشبكية، والتي تُختصر بـ RPE، نتيجة جذب الشبكية الزجاجية. استخدم نفس المقصات للقطع عبر الجسم الزجاجي لفصل سديلة العين الأمامية عن كأس العين.

ارفع الجزء الأمامي من IOA وتخلص منه. استخدم الملقط لنقل العين المفتوحة إلى بئر dys. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل Cup العين.

يتم التحضين لمدة تتراوح من 40 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون. انقل العين من مساحة التشريح مرة أخرى إلى طبق التشريح، والذي تم ملؤه بمحلول 1X HBSS جديد في درجة حرارة الغرفة. ضع العين بحيث يكون الكوب مواجهًا للأعلى وثبتها باستخدام إبرتين بمقياس 27.

باستخدام المجهر التشريحي، استخدم ملاقط دقيقة لرفع الشبكية المنفصلة جزئيًا برفق باستخدام مقص الشبكية. اقطع الشبكية بعيدًا عن العصب البصري. تخلص من الشبكية باستخدام مقص القزحية.

قم بإجراء شق من محيط العين وصولاً إلى العصب البصري. قم بتثبيت العين مفرودة باستخدام 5 إبر بقياس 27 gauge. ولبسط طبقة RPE، استخدم مقص الشبكية لإجراء قطع دائري حول العصب البصري.

فصل طبقة الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) مع التبديل إلى تكبير 250x أو أكثر. حدد حافة صفيحة الظهارة الصبغية للشبكية على طول القطع الذي تم إجراؤه بمقص القزحية وبالقرب من العصب البصري. استخدم زوجين من الملاقط لفصل الظهارة الصبغية للشبكية وغشاء بروكس عن طبقة النسيج المشيمي.

جرب عدة مناطق على طول الحافة المقطوعة لتحديد المنطقة التي يكون فيها الاتصال بين RPE والمشيمائية في أضعف حالاته. قم بتقشير الغشاء بلطف لإزالته بالكامل. ضع رقائق RPE في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter مملوء بمحلول trips in EDTA في درجة حرارة الغرفة.

عند جمع كافة الرقائق، أغلق الأنبوب بالغطاء، ثم حضّن الأنابيب في حمام مائي لمدة 10 دقائق عند 37 درجة Celsius. رُج الأنبوب بقوة لفصل RPE إلى تجمعات صغيرة. يشير عدم وجود تكتلات خلوية داكنة إلى اكتمال عملية الفصل.

أعد الأنبوب إلى الحمام المائي لمدة خمس دقائق أخرى. استخدم مصاصة باستير ومصّة مع شفط لطيف لإزالة أي بقايا أنسجة غير مهضومة. قم بترسيب الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي عند 280 5G لمدة أربع دقائق.

أزل السائل الطافي. أكمل الحجم النهائي إلى تسعة ملليلتر باستخدام وسط 15%RPE ثم استعمل الماصة لإعادة التعليق. انقل ثلاث ملليلتر من معلق الخلايا باستخدام الماصة إلى دورق بمساحة 25 سنتيمتر مربع.

أضف 2 mL من وسط زراعة RPE بتركيز 15% طازجاً وفي درجة حرارة الغرفة. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و 5% carbon dioxide. ومع نضج المزارع الخلوية، سيزداد تصبغها بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع.

ستكون المزارع الناجحة متلاصقة وذات تصبغ كثيف وموحد. لقد شرحنا لكم للتو كيفية تحضير المزارع الأولية لخلايا الشبكية البشرية الجنينية. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.