نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد ثقافات من صبغة شبكية الجنين البشري أو الظهارة أو RPE التي يمكن استخدامها كنموذج. في تحقيقات أمراض العين البشرية ، يتم تلقي الأنسجة من المتبرعين على شكل كرات العين السليمة. تتمثل الخطوة الأولى في الإجراء في تقليم العضلات الزائدة والأنسجة الضامة ثم فتح العين عن طريق إزالة القرنية والعدسة.

يتم علاج العين ب dispa وتسطيحها ، ثم يتم تقشير طبقة RPE أحادية الطبقة بعيدا عن المشيمية. تشريح. يتم زرع RPE في قوارير وتنمو لعدة أسابيع حتى تصل إلى طبقات أحادية التقاء وتطور صبغة. تستخدم مزارع الخلايا في التجارب الوظيفية في المختبر.

تتكرر التجارب الناجحة في المختبر في نماذج التجارب قبل السريرية حيث يمكن تقييم استجابات RPE بشكل أفضل في محيط الإشارات الأكثر تعقيدا. سيؤدي النموذج الموضح هنا إلى فهم أفضل لفسيولوجيا RPE والتدخلات العلاجية الجديدة لعلاج أمراض العين. مرحبا ، اسمي شيلدون ميلر.

يقع مختبري في المعهد الوطني للعيون ، وهو جزء من المعاهد الوطنية للصحة في حرم بيثيسدا ماريلاند. مرحبا ، أنا أركي من Miller Lab. سنعرض لك اليوم إجراء لإعداد الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الصبغية لشبكية الجنين البشري.

سيتم تحضير هذه الخلايا كطبقات أحادية ملتصقة يمكن تركيبها في غرف الغناء المعدلة. سنستخدم أيضا خلايا RPE البشرية المعزولة هذه لدراسات في الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لإنشاء الثقافات الأولية للخلايا الظهارية لدراسة وظيفة وتنظيم العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية وتطوير نماذج حيوانية سريرية للأمراض.

نحن نركز على ظهارة صبغة الشبكية أو RPE ، التي تقع في الجزء الخلفي من العين ، وتفصل بين شبكية العين العصبية وإمدادات الدم المشيمية. يوضح هذا الرسم التخطيطي للعين موقع ورقة RPE في الجزء الخلفي من العين المجاورة للمستقبلات الضوئية. يظهر الملحق خلايا شبكية العين مع المستقبلات الضوئية على اليمين والخلايا العقدية على اليسار.

هذه الظهارة نشطة للغاية من الناحية الأيضية. إنه البلعمة المستقبلات الضوئية بشكل مستمر على أساس نهاري ، ويخزن الريس ، والضباب ، وينقل الصباغ البصري فيتامين أ إلى المستقبلات الضوئية. في الدورة البصرية ، يعمل بشكل متماثل للحفاظ على التركيب الكيميائي وحجم المساحات خارج الخلية المحيطة.

الخاصية الحاسمة للظهارة هي قطبيتها. يعد التوصيل غير المتماثل المستمر للبروتينات إلى الأغشية الجانبية القمية والقاعدية عملية منظمة تسمح للظهارة بتنفيذ حركة المرور المتجهة للمستقلبات والأيونات والسوائل من مساحة خارج الخلية إلى أخرى. يساعد هذا النشاط الظهارة في الحفاظ على صحة وسلامة الشبكية العصبية.

يسمح التحضير في المختبر الذي نصفه هنا بتحليل بروتينات النقل والمستقبلات ومسارات الإشارات التي تحدد قطبية الظهارة ووظيفتها قبل بدء التشريح. قم بإعداد لوح 12 بئر في غطاء تدفق رقائقي مع محاليل درجة حرارة الغرفة. تتطلب كل عين بئر واحد من محلول مضاد للفطريات مضاد للمضادات الحيوية 10 × ، وبئرين من XPBS واحد وبئر واحد من وحدتين لكل مليلتر من مساحة القرص المخففة في وسط 5٪ RPE مع المصل املأ طبق تشريح مبطن بالسيليكون بواحد X-H-B-S-S ، واستنزاف السائل وانقل كل عين إلى بئر واحد من محلول مضاد للفطريات للمضادات الحيوية.

احتضن لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجنب ممارسة أي ضغط زائد على مقلة العين. اشطف العين في بئرين متتاليين من XPBS واحد لإزالة المضادات الحيوية الزائدة.

ثم استخدم الملقط لنقله إلى طبق التشريح المملوء ب X-H-B-S-S تحت مجهر ستيريو تشريح. استخدم مقص القزحية لإزالة العضلات الزائدة والأنسجة الضامة حول العين. قم بمحاذاة العين بحيث تكون القرنية متجهة لأعلى.

استخدم إبرتين معقمتين قياس 27 لتثبيت العين بالنسيج الضام دون إتلاف الصلبة بوسادة السيليكون. في هذا الاتجاه ، استخدم سكين منفذ جانبي لعمل شق عبر الصلبة. يجب أن يكون القطع ثلث المسافة من خط الاستواء للعين إلى السطح الأمامي.

استخدم مقص القزحية لمواصلة القطع بشكل دائري حول العين لتجنب تلف صبغة الشبكية. ظهارة ، اختصار RPE بواسطة جاذبية شبكية العين الزجاجية. استخدم نفس المقص لقطع الجسم الزجاجي لفصل سديلة العين الأمامية عن كوب العين.

ارفع الجزء الأمامي من IOA وتخلص منه. استخدم الملقط لنقل العين المفتوحة إلى بئر الأداء. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في العين. كوب.

احتضان لمدة 40 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. انقل العين من مساحة التشريح مرة أخرى إلى طبق التشريح ، المملوء بدرجة حرارة الغرفة الطازجة X-H-B-S-S. ضع العين بحيث يكون الكوب متجها لأعلى وثبته بإبرة قياس 27.

تحت مجهر التشريح ، استخدم ملقطا دقيقا لرفع شبكية العين المنفصلة جزئيا برفق باستخدام مقص الشبكية. قطع شبكية العين بعيدا عن العصب البصري. تخلص من شبكية العين بمقص القزحية.

قم بعمل شق من محيط العين إلى العصب البصري. قم بتثبيت العين ب 5 إبر قياس 27. لتمديد طبقة RPE ، استخدم مقص الشبكية لعمل قطع دائري حول العصب البصري.

فصل طبقة RPE للتبديل إلى تكبير 250 × أو أكثر. ابحث عن حافة ورقة RPE على طول القطع الذي تم إجراؤه بواسطة مقص القزحية وبالقرب من العصب البصري. استخدم زوجين من الملقط لفصل RPE وغشاء بروس عن طبقة الأنسجة المشيمية.

جرب عدة مناطق على طول الحافة المقطوعة للعثور على المكان الذي يكون فيه الاتصال بين RPE والمشيمية أضعف. قشر الغشاء برفق لإزالته تماما. ضع صفائح RPE في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر مملوء برحلات درجة حرارة الغرفة في EDTA.

عندما يتم جمع جميع الأوراق ، قم بتغطية الأنبوب ، واحتضان الأنابيب في حمام مائي لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. هز الأنبوب بقوة لفصل RPE إلى مجموعات صغيرة. عدم وجود كتل للخلايا الداكنة يعني اكتمال الفصل.

أعد الأنبوب إلى الحمام المائي لمدة خمس دقائق أخرى. استخدم المعجون والماصة والشفط اللطيف لإزالة أي بقايا من الأنسجة غير المهضومة. قم بتدوير الخلايا في جهاز طرد مركزي عند 280 5G لمدة أربع دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية. ارفع الحجم النهائي إلى تسعة ملليلتر باستخدام ماصة متوسطة RPE بنسبة 15٪ لإعادة التعليق. تقوم ماصة الخلايا بوضع ثلاثة ملليلتر من تعليق الخلية في قارورة مربعة بحجم 25 سم مربع.

أضف ملليلترين من درجة حرارة الغرفة الطازجة ، 15٪ ثقافة متوسطة RPE. الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مع نضوج الثقافات ، سيزداد تصبغها بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع.

ستكون الثقافات الناجحة متقاربة وبشكل موحد ومصطبغة بشكل مكثف. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحضير الثقافات الأولية للجنين البشري. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.