استخراج الحمض النووي الريبي المتداول: طريقة لعزل الحمض النووي الريبي المرسال من عينات البلازما عن طريق الاستخراج العضوي وتخصيب الحمض النووي الريبي الصغير
JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 4:33 د • April 30th, 2023
Loading...
نظرة عامة
يفصل هذا المقال بروتوكولاً لعزل جزيئات الـ microRNAs (miRNAs) الدائرة من عينات البلازما، لا سيما في سياق سرطان القولون والمستقيم. وتركز هذه الطريقة على أهمية منع تحلل الـ RNA وتحسين الظروف لضمان استعادة الـ miRNA.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- علم الأورام
خلفية علمية
- تعد جزيئات MicroRNAs جزيئات RNA صغيرة غير مشفرة تعمل على تنظيم التعبير الجيني.
- تمتلك جزيئات miRNA المتداولة في الدورة الدموية إمكانات واعدة كعلامات بيولوجية للسرطان.
- يمكن استخلاص هذه الجزيئات من سوائل الجسم مثل البلازما.
- يُعد التعامل السليم مع العينات أمراً بالغ الأهمية لمنع تحلل الـ RNA.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل لعزل جزيئات miRNA من عينات البلازما.
- توضيح تطبيق هذه الطريقة في أبحاث سرطان القولون والمستقيم.
- تعزيز فهم دور miRNA كعلامات حيوية في السرطان.
الطرق المستخدمة
- خلط البلازما بمحلول مسوِّئ لمنع تحلل الـ RNA.
- استخدام استخلاص الفينول-كلوروفورم الحمضي لفصل الـ RNA.
- ترسيب الـ RNA باستخدام الإيثانول واستخدام خراطيش ترشيح لعزله.
- استخلاص الـ miRNAs باستخدام محلول منظم مناسب لجمعها.
النتائج الرئيسية
- عزل ناجح لـ miRNAs من بلازما مرضى سرطان القولون والمستقيم.
- إثبات كفاءة عملية الاستخلاص والتنقية.
- تسليط الضوء على أهمية تركيز الإيثانول في استعادة miRNA.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لعزل الـ miRNA.
- يمكن أن تعمل جزيئات miRNA المعزولة كمؤشرات حيوية محتملة لسرطان القولون والمستقيم.
- يمكن للدراسات المستقبلية استكشاف التطبيقات السريرية لهذه النتائج.
الأسئلة الشائعة
ما هي الـ microRNAs؟
تُعد جزيئات microRNAs حموضاً نووية ريبوزية صغيرة غير مشفرة تعمل على تنظيم التعبير الجيني.
لماذا تعتبر جزيئات miRNA المتداولة مهمة؟
لديهم القدرة على أن يكونوا مؤشرات حيوية لأنواع مختلفة من السرطانات، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم.
كيف يتم استخلاص RNA من البلازما؟
يتم استخلاص الـ RNA باستخدام محلول تمسخي واستخلاص بالفينول الحمضي والكلوروفورم.
ما الدور الذي يلعبه الإيثانول في عملية العزل؟
يُستخدم الإيثانول لترسيب RNA وتحسين ظروف استعادة miRNA.
هل يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع أخرى من السرطان؟
نعم، يمكن تكييف هذا البروتوكول لعزل الـ miRNAs من أنواع أخرى من السرطان.
ما هي الخطوات التالية بعد عزل miRNA؟
يمكن تحليل جزيئات الـ miRNAs المعزولة لتقييم إمكانية استخدامها كمؤشرات حيوية في الدراسات السريرية.
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح عزل جزيئات miRNA المتداولة من البلازما اكتشاف مؤشرات حيوية غير بضعية لتطوير أدوية الأورام. وتدعم هذه الطريقة الكشف المبكر، وتحديد مآل المرض، ومراقبة العلاج في سرطان القولون والمستقيم، مما يوفر نهجاً قابلاً للتوسع لتقييم الاستجابة العلاجية. كما أن استخلاص miRNA الموثوق يعزز من التحقق من الأهداف ويقلل من المخاطر المرتبطة بالقرارات المتخذة في مسارات التطوير القائمة على المؤشرات الحيوية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الصيدلانية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء المؤشرات الحيوية من الـ miRNA المتداولة لتوضيح شبكات التنظيم الجيني المرتبطة بالمرض.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل قابل للتكرار لعزل الـ miRNAs من البلازما، مما يقلل من التباين في الكشف عن المؤشرات الحيوية.
- القيمة التنبؤية: تدعم التحقق من الأهداف الوظيفية من خلال ربط تعبير الـ miRNA بالمسارات المسرطنة في سرطان القولون والمستقيم.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج كسور miRNA منقاة مناسبة لمقاييس qPCR أو تسلسل النوكليوتيدات اللاحقة في فحص المؤشرات الحيوية.
- القيمة التشغيلية: استخدام الترشيح بالتدرج الإيثانولي لإثراء الحمض النووي الريبي الصغير، مما يحسن من حساسية المقايسة ونوعيتها.
- القابلية للتوسع: متوافق مع المعالجة عالية الإنتاجية لعينات البلازما لتطوير مجموعة من المؤشرات الحيوية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يمكن ربط جزيئات miRNA المعزولة من بلازما المرضى بالنتائج السريرية لتوجيه عملية اختيار النماذج قبل السريرية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يتيح تقييم تنظيم الجينات بوساطة miRNA في دراسات البيئة المجهرية للأورام.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يدعم تأهيل جزيئات miRNA المنتشرة كمؤشرات حيوية للديناميكا الدوائية أو مؤشرات للاستجابة في التجارب العلاجية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سير عمل اكتشاف المؤشرات الحيوية، مما يتيح الانتقال من مرحلة جمع العينات إلى التحقق التحليلي في أبحاث الأورام.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات المتعلقة بأدوار miRNA في إمراض السرطان من خلال العزل الموثوق من الخزعات السائلة.
- الفحص: توفر مدخلات miRNA معيارية لتطوير المقايسات، مما يضمن الحصول على نتائج متسقة عبر تقييمات المركبات أو الأهداف.
- التحليلات: تعطي مخرجات miRNA قابلة للقياس الكمي تمكن من إجراء مقارنة إحصائية بين مجموعات المرضى أو مجموعات العلاج.
- الأبحاث الانتقالية: تربط ملفات miRNA المنتشرة بالأنماط الظاهرية السريرية، مما يدعم التقدم المصنف حسب المخاطر في البرامج قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لعزل المؤشرات الحيوية القائمة على الخزعة السائلة عبر مختلف دواعِي الاستعمال في علم الأورام.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من الأهداف عن طريق تقليل التباين في مرحلة ما قبل التحليل في استعادة miRNA.
- القيمة التشغيلية: توحد معالجة العينات من خلال تركيزات محددة من الإيثانول وخطوات الترشيح، مما يعزز إمكانية تكرار النتائج بين المختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات الاستمرار أو التوقف من خلال توفير بيانات قوية للمؤشرات الحيوية في مرحلة مبكرة من مسار الاكتشاف.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف بناءً على تقييم المخاطر ووفقاً لبصمات miRNA المتداولة ذات الصلة سريرياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع RNA والتقنيات الخالية من RNase لمنع تحلل العينات.
- يعتمد على توفر جهاز طرد مركزي، وخراطيش ترشيح، وفينول-كلوروفورم للاستخلاص العضوي.
- يستلزم توحيد بروتوكولات جمع وتخزين البلازما عبر جميع المواقع لضمان الحصول على كمية متسقة من miRNA.
- يتضمن تحسين تركيزات الإيثانول لعمليات الاستنزاف المتسلسل لـ RNA الكبير وإثراء miRNA.
- يتقيد بحجم البلازما المستخدم، مما قد يحد من كمية miRNA المستخلصة في الحالات التي تكون فيها العينات قليلة.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
لماذا يمنع محلول إزالة الطبيعة تحلل الـ RNA في البلازما؟
يعمل محلول إزالة الطبيعة على تجانس عينة البلازما وتثبيط إنزيمات الريبونوكلياز، مما يحمي سلامة الـ miRNA أثناء عملية الاستخلاص. وتعد هذه الخطوة حاسمة لاستعادة المؤشرات الحيوية المتداولة السليمة من سوائل الدم.
كيف يعمل الفصل باستخدام الفينول الحمضي والكلوروفورم على عزل الـ RNA من البلازما؟
يعمل الفينول الحمضي والكلوروفورم على فصل البلازما إلى أطوار، حيث يتوزع RNA في الطور المائي العلوي بينما يظل DNA والبروتينات في الطور العضوي. وهذا يتيح الاستعادة الانتقائية لـ RNA من أجل إثراء miRNA في الخطوات اللاحقة.
ما الدور الذي يلعبه الإيثانول بتركيز 25% في خطوة الترشيح؟
عند تركيز 25% من الإيثانول، ترتبط جزيئات RNA الكبيرة بخرطوشة المرشح بينما تمر جزيئات miRNA الأصغر إلى الراشح، مما يسمح بالفصل بناءً على الحجم. وتعمل هذه الحالة الأولية على استنفاد أنواع RNA الوفيرة لتحسين استعادة miRNA.
لماذا يتم رفع تركيز الإيثانول إلى 55% لالتقاط الـ miRNA؟
يؤدي رفع تركيز الإيثانول إلى 55% إلى تعزيز ارتباط جزيئات miRNA الصغيرة بخرطوشة المرشح، مما يسمح باحتجازها بينما تتدفق الملوثات عبرها. وتعمل هذه الخطوة على إثراء جزء miRNA قبل عملية الاستخلاص.
كيف يقوم محلول الاستخلاص باستعادة الـ miRNAs من المرشح؟
تؤدي إضافة منظم استخلاص (elution buffer) مسخن مسبقاً إلى الخرطوشة ثم إجراء عملية الطرد المركزي إلى تحرير جزيئات miRNA المرتبطة في أنبوب التجميع. وتنتج عن هذه الخطوة جزيئات miRNA منقاة وجاهزة للقياس الكمي أو للتحليلات اللاحقة.
09:48
طريقة سريعة والمبسطة لارتفاع العزلة من خلال وضع-من ميرنا من نظافة البروتين الدهني عالي الكثافة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
08:14
ميكرورنا استناداً إلى خزعة سائلة: تجربة ميرنا البلازما التوقيع المصنف (MSC) "فحص سرطان الرئة"
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
04:41
بكر الرقمية للتحديد الكمي لتعميم MicroRNAs في احتشاء عضلة القلب الحاد وأمراض القلب والأوعية الدموية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
07:27
ارتفاع جانبي MicroRNA المناولة : ملتيبليكس محسن qRT - PCR على مقياس نانولتر في المحفل Fluidigm ArrayTM الحيوي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
03:59
استخراج miRNA: طريقة لاستخراج miRNA من عينة البلازما
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
10:45
تنقية الرنا الميكروي والتنميط من Exosomes المشتقة من الدم والثقافة وسائل الإعلام
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
06:44
عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
06:59
العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
07:37
تعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الحمض النووي ملزم صبغ الكيمياء والقطرة PCR الرقمية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
10:39
عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة لغير الترميز الصغيرة RNA الكمي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 15 أغسطس 2026