استخراج الحمض النووي الريبي المتداول: طريقة لعزل الحمض النووي الريبي المرسال من عينات البلازما عن طريق الاستخراج العضوي وتخصيب الحمض النووي الريبي الصغير

- MicroRNAs أو miRNAs هي RNAs صغيرة غير مشفرة تنظم التعبير الجيني عن طريق تحطيم mRNA أو منع ترجمتها إلى بروتينات وظيفية. الميرنا المنتشرة هي مؤشرات حيوية محتملة للسرطان ويمكن استخراجها من سوائل الجسم مثل البلازما. للبدء ، امزج البلازما بمحلول تغيير الطبيعة الذي يجانس العينة في نفس الوقت ويمنع الريبونوكلياز المتحلل للحمض النووي الريبي.

عالج بحمض الفينول والكلوروفورم والطرد المركزي لفصل العينة إلى مرحلتين ، مرحلة عضوية سفلية تحتوي على الحمض النووي والبروتينات ، ومرحلة مائية علوية تحتوي على الحمض النووي الريبي. استعادة المرحلة المائية. أضف الإيثانول المطلق لترسيب الحمض النووي الريبي من المحلول.

ارفع تركيز العينة من الإيثانول إلى 25٪ لتعيين حالة أولية تؤدي إلى فصل كبير عن الحمض النووي الريبي. انقل الخليط إلى خرطوشة فلتر مجمعة مسبقا وجهاز طرد مركزي. يتم تثبيت الحمض النووي الريبي الكبير بشكل انتقائي على المرشح ، بينما تتجمع miRNAs الأصغر في المرشح.

بعد ذلك ، قم بزيادة تركيز الإيثانول إلى 55٪ لصالح عزل miRNA. انقل المرشح إلى خرطوشة مرشح جديدة وجهاز طرد مركزي لاحتجاز miRNAs. ضع الخرطوشة على أنبوب تجميع وأضف عازلة شطف مناسبة. جهاز طرد مركزي لتصفية miRNAs في الأنبوب. في البروتوكول التالي ، سنعرض عزل miRNA المنتشر عن بلازما مرضى سرطان القولون والمستقيم.

للبدء ، انقل 400 ميكرولتر من عينة البلازما إلى أنبوب 2 مليلتر خال من RNase. ثم أضف 400 ميكرولتر من محلول تغيير الطبيعة إلى الأنبوب. أضف 4 ميكرولترات من 1 نانو مول.

بعد خلط المحلول ، أضف 800 ميكرولتر من حمض الفينول كلوروفورم. دوامة الحل لمدة 60 ثانية وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بنقل المحللة الموجودة في المرحلة المائية العليا إلى أنبوب نظيف ، مع الحرص على عدم إزعاج الطور البيني.

قم بقياس حجم الطور المائي المستعاد وأضف 1/3 حجم من الإيثانول إلى المحلل. ثم ضع خرطوشة مرشح في أنبوب تجميع جديد. انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من خليط محللة الإيثانول إلى خرطوشة الفلتر. جهاز الطرد المركزي خرطوشة الفلتر لمدة 30 ثانية عند 10,000 × جم.

بعد ذلك ، قم بقياس الحجم الكلي للتدفق. ثم أضف 2/3 من حجم الإيثانول إلى المرشح واخلط جيدا. ضع خرطوشة مرشح ثانية في أنبوب تجميع جديد. بعد ذلك ، انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من العينة إلى الخرطوشة وجهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 30 ثانية قبل التخلص من التدفق.

أضف 700 ميكرولتر من محلول غسيل microRNA إلى خرطوشة الفلتر وقم بطردها بأنبوب تجميع عند 10,000 × جم لمدة 15 ثانية. تخلص من التدفق وأعد خرطوشة الفلتر إلى نفس الأنبوب.

بعد ذلك ، انقل خرطوشة الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الشطف المسخن مسبقا إلى الخرطوشة. قم بالطرد المركزي لخرطوشة المرشح عند 10,000 × جم لمدة 30 ثانية لاستعادة microRNAs.

• MicroRNAs - Small non-coding RNAs that regulate gene expression.
• Circulating miRNAs - miRNAs in body fluids used as possible cancer biomarkers.
• Denaturing Solution - Homogenizes the sample and inhibits RNA-degrading ribonucleases.
• Acid phenol-chloroform - Used to separate the sample into distinct phases.
• Elution Buffer - A solution added to elute miRNAs into a collection tube.

• Introduce MicroRNAs - Small molecules regulating gene expression (e.g., mirna).
• Key Concepts – Summarize the roles and potential of miRNAs in cancer research (e.g., mirna plasma kit).
• Underlying Mechanisms – miRNAs are isolated using specific procedures (e.g., mirvana isolation kit).
• Connect to Experiment – The study utilizes miRNA isolation from plasma samples.

• What are MicroRNAs and how to extract them (using mirna extraction kits)?
• How does the process of miRNA isolation work (using mirvana paris kit)?
• What is the role of circulating miRNAs in cancer research?

• Practical Applications – miRNAs in diagnostics, research, and treatment (e.g., micro rna isolation).
• Industry Impact – Impacting biotech, healthcare sectors (e.g., s1122-1830).
• Societal Importance – Potential benefits in early disease detection (e.g., miRNA isolation protocol).
• Link to Scientific Advancements – Emergence of advanced extraction kits (e.g., mirna plasma extraction kit).