طريقة السقوط المعلق: تقنية لتوليد كرويات الورم الميلانيني ثلاثية الأبعاد

- الكرويات هي نماذج ثلاثية الأبعاد لزراعة الخلايا في المختبر تحاكي بنية الورم في الجسم الحي وتساعد في دراسة التفاعلات داخل الورم. لإعداد الثقافة ، أولا ، قم بإعداد معلق أحادي الخلية لخلايا الورم الميلانيني في وسطها المناسب. بعد ذلك ، اكتشف كميات صغيرة من تعليق الخلية هذا ، متباعدة بما فيه الكفاية على السطح الداخلي لغطاء طبق ثقافة معقم غير لاصق. اقلب الغطاء بحذر وضعه على قاعدة طبق الثقافة الذي يحتوي على PBS لإنشاء غرفة ترطيب. احتضان اللوحة في ظل الظروف المناسبة.

تمنع الرطوبة من PBS تبخر الوسائط من القطرات المعلقة. قم بتحديث القطرات عن طريق استبدال بضعة ميكرولترات من الوسائط. بسبب التوتر السطحي ، تحافظ القطرات على شكلها الكروي وتظل معلقة من السطح الداخلي للوحة. تسهل قوى الجاذبية على الخلايا البقاء معلقة دون أن تنتشر ولكنها تتجمع لتشكيل كرويات ثلاثية الأبعاد داخل القطرات. أخيرا ، اشطف القطرات باستخدام PBS لحصاد الكرويات. اجمعها في طبق ثقافة غير لاصق.

في البروتوكول التالي ، سنوضح توليد كرويات ثلاثية الأبعاد لخلايا الورم الميلانيني 451-LU عبر طريقة الإسقاط المعلق.

- للبدء ، قم بزراعة خلايا الورم الميلانيني 451-LU باستخدام وسيط RPMI الذي يحتوي على 10٪ FCS ، وفقا لبروتوكولات زراعة الخلايا العامة. لتوليد كرويات الورم الميلانيني ، اغسل خلايا الورم الميلانيني المزروعة في PBS. ثم أضف 5 ملليلتر من 1x Trypsin-EDTA في PBS. احتضن لمدة 3 إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 5 ملليلتر من RPMI تحتوي على 10٪ FCS لتحييد التربسين. ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق لحصاد الخلايا. أعد تعليق حبيبات الخلية في RPMI التي تحتوي على 10٪ FCS.

بعد ذلك ، عد الخلايا وقم بتخفيف تعليق الخلية إلى تركيز نهائي يبلغ 10,000 خلية لكل مليلتر. استخدم ماصة إلكترونية متعددة لعمل بقع معلقة خلوية بحجم 40 × 25 ميكرولتر على السطح الداخلي لغطاء طبق ثقافة خلية معقم وغير لاصق يبلغ طوله 10 سم.

بعد ذلك ، اقلب الغطاء بحركة سريعة وسلسة ، وضعه على طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على 5 مل من PBS. استزراع أطباق القطرة المعلقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 إلى 14 يوما.

بعد خمسة أيام من اكتشاف السقوط الأولي ، استخدم موزعا إلكترونيا لإضافة 10 ميكرولترات من RPMI تحتوي على 10٪ FCS لكل قطرة. بعد 10 إلى 15 يوما ، احصد الكرات عن طريق شطفها برفق من الغطاء باستخدام PBS. اجمع الكرويات في طبق زراعة خلايا طازج غير لاصق.