لماذا يعتبر عزل الخلايا الموجبة لـ CD133 مهماً للتحقق من الهدف في الميلانوما؟

يتيح عزل الخلايا الموجبة لـ CD133 إجراء اختبارات وظيفية لقدرات تكوين الأورام والتجدد الذاتي، وهي عوامل حاسمة للتحقق من أهداف الخلايا الجذعية السرطانية في الميلانوما. ويقلل هذا التنقية من الضجيج الناتج عن الخلايا غير الجذعية، مما يزيد من الموثوقية في اختبارات الاعتماد على الأهداف. وتدعم هذه الطريقة تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال ربط تعبير CD133 بالقدرة على بدء تكوين الورم.

كيف يتيح فرز الخلايا المنشط مغناطيسياً عزل المتغيرات المستقلة في أبحاث الخلايا الجذعية؟

يعمل الفرز الخلوي المنشط مغناطيسياً على عزل الكسور الموجبة والسالبة لـ CD133 عن طريق وسم المجتمع المستهدف فقط بالأجسام المضادة المبيوتنلة والخرزات الدقيقة، مما يؤدي إلى تكوين مجموعات تجريبية محددة. يتيح عزل المتغير المستقل هذا (حالة CD133) للباحثين عزو الاختلافات الوظيفية تحديداً إلى إثراء الخلايا الجذعية. تضمن هذه التقنية أن تكون الأنماط الظاهرية الملاحظة في المقايسات مرتبطة بالمتغير المعزول بدلاً من المجموعات المختلطة.

ما هي قياسات المتغيرات التابعة الكمية التي تتيحها عملية عزل أجزاء الميلانوما المحددة بواسطة CD133؟

تتيح الأجزاء المعزولة إجراء قياسات كمية مثل كفاءة تكوين الكرات، وتكرار بدء الورم في الجسم الحي، ومعدلات الاستجابة الدوائية المتباينة. وتوفر هذه المتغيرات التابعة قراءات رقمية لمقارنة الأنماط الظاهرية المرتبطة بالقدرة الجذعية بين الخلايا الموجبة والسالبة لـ CD133. كما تدعم هذه الطريقة التحليل الإحصائي لتردد الخلايا الجذعية وقدرتها الوظيفية عبر الظروف التجريبية المختلفة.

لماذا تعد متطلبات التكرار مهمة لعزل خلايا ميلانوما موثوقة إيجابية وسلبية لـ CD133؟

يضمن التكرار أن يؤدي العزل إلى نقاوة وحيوية متسقة للأجزاء المحددة بـ CD133 عبر التجارب، وهو أمر أساسي لإجراء فحوصات وظيفية قابلة للتكرار. قد تؤدي التباينات في كفاءة الفصل إلى إرباك المقارنات بين المجموعات الجذعية وغير الجذعية، مما يقوض جهود التحقق من الأهداف. وتساعد البروتوكولات الموحدة مع عمليات التشغيل المكررة في وضع عتبات قوية للنقاوة والاسترداد في البيئات الصناعية.

ما هي قدرات التحليل الإحصائي المطلوبة قبل تنفيذ عزل CD133 في سير عمل الخلايا الجذعية للميلانوما؟

يتطلب التنفيذ القدرة على قياس النقاء والحصيلة عبر قياس التدفق الخلوي أو طرق مماثلة لتقييم كفاءة الفصل. كما تستلزم المقارنة الإحصائية للمقايسات الوظيفية (مثل تشكل الورم والتكاثر) بين الكسور المعزولة توفر أدوات لحساب الدلالة الإحصائية وحجم التأثير. ويضمن الوصول إلى برمجيات تحليل البيانات المكررة أن تكون الاختلافات الملحوظة في الأنماط الظاهرية للخلايا الجذعية صالحة إحصائيًا وليست ناتجة عن تباين عملية العزل.

عزل الخلايا الجذعية للورم الميلانيني: طريقة للحصول على خلايا الورم الميلانيني الإيجابية والسالبة CD133 باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا

JoVE Encyclopedia of Experiments

أبحاث السرطان

0 مشاهدات • 5:40 د • April 30th, 2023

- يؤوي الورم الميلانيني مجموعة صغيرة من الخلايا الجذعية السرطانية التي تمتلك قدرات التجديد الذاتي وبدء الورم. CD133 أو Prominin-1 ، وهو بروتين سكري عبر الغشاء الخماسي ، هو أحد العلامات الرئيسية التي تعبر عنها الخلايا الجذعية لسرطان الورم الميلانيني النقيلي. لعزل الخلايا الإيجابية CD133 ، ابدأ بتعليق خلايا الورم الميلانيني الأولي في مخزن مؤقت مناسب.

احتضان بكاشف مانع يحتوي على بروتينات تمنع مواقع الارتباط غير المحددة على سطح الخلية. عالج الخلايا بالأجسام المضادة الأولية CD133 البيوتينيل. ترتبط هذه الأجسام المضادة بمستضدات CD133 المعبر عنها في الخلايا الإيجابية CD133. الآن ، أضف الميكروبيدات المغناطيسية المضادة للبيوتين إلى التعليق. احتضان الميكروبيدات للارتباط بالخلايا المسماة بالبيوتين.

أخيرا ، قم بتمرير التعليق المحتضن عبر عمود يوضع في مجال مغناطيسي. مع التأثير المغناطيسي ، تلتصق جميع الخلايا الإيجابية CD133 المسماة بالميكروبيدات بالعمود ، بينما تمر الخلايا غير المسماة. اجمع هذه الخلايا غير المسماة CD133 السالبة. قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي. اغسل المحتويات باستخدام مخزن مؤقت مناسب لتصفية الخلايا الموجبة CD133 وجمعها.

في البروتوكول التالي ، سنعرض عزل الخلايا الجذعية السرطانية الإيجابية والسالبة CD133 من ثقافة الورم الميلانيني الأولي التي تم الحصول عليها من أنسجة الورم. اغسل 80٪ من الخلايا المتجانسة باستخدام PBS الدافئ مسبقا. أضف كمية مناسبة من Accutase واحتضنه حتى تنفصل الخلايا عن سطح المزرعة. حصاد الخلايا في وسط Quantum 263 ونقلها إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا.

تعداد الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي العدد المطلوب من الخلايا لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4 إلى 8 درجات مئوية. استنشق طافي تماما ، وأعد تعليق ما يصل إلى 1 مرات 10 إلى الخلايا الثامنة في 350 ميكرولتر MACS عازلة. أضف 100 ميكرولتر كاشف حجب FcR و 50 ميكرولتر CD133 / 1-Biotin. تخلط جيدا وتحتضن على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

اغسل الخلايا بمحلول MACS سعة 10 مل ، متبوعا بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4 إلى 8 درجات مئوية. استنشق المادة الطافية تماما. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. أضف 100 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة للبيوتين واخلطها جيدا. احتضن عند 4 إلى 8 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

وفي الوقت نفسه ، لإعداد فاصل MACS للفصل المغناطيسي ، قم بتوصيل QuadroMACS بحامل MACS Separator Multi Stand. أدخل العدد المطلوب من أعمدة LS مع أجنحة العمود في المقدمة في المجال المغناطيسي ل QuadroMACS. ضع مرشح فصل مسبق في كل عمود LS وأنبوب تجميع مناسب أسفل كل عمود.

اشطف الفلتر والعمود بمخزن مؤقت MACS سعة 3 ملليلتر وتخلص من التدفق من خلاله. بعد غسل الخلايا في المخزن المؤقت MACS كما هو موضح سابقا ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS وقم بتطبيق تعليق الخلية على عمود LS المعد. اغسل ثلاث مرات باستخدام 3 ملليلتر من MACS buffer لكل عمود. اجمع إجمالي النفايات السائلة لجزء الخلية السلبي CD133 غير المسمى.

بعد ذلك ، تخلص من مرشح ما قبل الفصل ، وقم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب تجميع مناسب. ضع 5 ملليلتر MACS عازلة. قم على الفور بإخراج الخلايا الإيجابية CD133 المسماة عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود. لزيادة نقاء الكسر السالب ، قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود LS متوازن جديد واجمع الكسر السالب للنفايات السائلة CD133.