عزل الخلايا الجذعية للورم الميلانيني: طريقة للحصول على خلايا الورم الميلانيني الإيجابية والسالبة CD133 باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا

- يؤوي الورم الميلانيني مجموعة صغيرة من الخلايا الجذعية السرطانية التي تمتلك قدرات التجديد الذاتي وبدء الورم. CD133 أو Prominin-1 ، وهو بروتين سكري عبر الغشاء الخماسي ، هو أحد العلامات الرئيسية التي تعبر عنها الخلايا الجذعية لسرطان الورم الميلانيني النقيلي. لعزل الخلايا الإيجابية CD133 ، ابدأ بتعليق خلايا الورم الميلانيني الأولي في مخزن مؤقت مناسب.

احتضان بكاشف مانع يحتوي على بروتينات تمنع مواقع الارتباط غير المحددة على سطح الخلية. عالج الخلايا بالأجسام المضادة الأولية CD133 البيوتينيل. ترتبط هذه الأجسام المضادة بمستضدات CD133 المعبر عنها في الخلايا الإيجابية CD133. الآن ، أضف الميكروبيدات المغناطيسية المضادة للبيوتين إلى التعليق. احتضان الميكروبيدات للارتباط بالخلايا المسماة بالبيوتين.

أخيرا ، قم بتمرير التعليق المحتضن عبر عمود يوضع في مجال مغناطيسي. مع التأثير المغناطيسي ، تلتصق جميع الخلايا الإيجابية CD133 المسماة بالميكروبيدات بالعمود ، بينما تمر الخلايا غير المسماة. اجمع هذه الخلايا غير المسماة CD133 السالبة. قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي. اغسل المحتويات باستخدام مخزن مؤقت مناسب لتصفية الخلايا الموجبة CD133 وجمعها.

في البروتوكول التالي ، سنعرض عزل الخلايا الجذعية السرطانية الإيجابية والسالبة CD133 من ثقافة الورم الميلانيني الأولي التي تم الحصول عليها من أنسجة الورم. اغسل 80٪ من الخلايا المتجانسة باستخدام PBS الدافئ مسبقا. أضف كمية مناسبة من Accutase واحتضنه حتى تنفصل الخلايا عن سطح المزرعة. حصاد الخلايا في وسط Quantum 263 ونقلها إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا.

تعداد الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي العدد المطلوب من الخلايا لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4 إلى 8 درجات مئوية. استنشق طافي تماما ، وأعد تعليق ما يصل إلى 1 مرات 10 إلى الخلايا الثامنة في 350 ميكرولتر MACS عازلة. أضف 100 ميكرولتر كاشف حجب FcR و 50 ميكرولتر CD133 / 1-Biotin. تخلط جيدا وتحتضن على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

اغسل الخلايا بمحلول MACS سعة 10 مل ، متبوعا بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4 إلى 8 درجات مئوية. استنشق المادة الطافية تماما. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. أضف 100 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة للبيوتين واخلطها جيدا. احتضن عند 4 إلى 8 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

وفي الوقت نفسه ، لإعداد فاصل MACS للفصل المغناطيسي ، قم بتوصيل QuadroMACS بحامل MACS Separator Multi Stand. أدخل العدد المطلوب من أعمدة LS مع أجنحة العمود في المقدمة في المجال المغناطيسي ل QuadroMACS. ضع مرشح فصل مسبق في كل عمود LS وأنبوب تجميع مناسب أسفل كل عمود.

اشطف الفلتر والعمود بمخزن مؤقت MACS سعة 3 ملليلتر وتخلص من التدفق من خلاله. بعد غسل الخلايا في المخزن المؤقت MACS كما هو موضح سابقا ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS وقم بتطبيق تعليق الخلية على عمود LS المعد. اغسل ثلاث مرات باستخدام 3 ملليلتر من MACS buffer لكل عمود. اجمع إجمالي النفايات السائلة لجزء الخلية السلبي CD133 غير المسمى.

بعد ذلك ، تخلص من مرشح ما قبل الفصل ، وقم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب تجميع مناسب. ضع 5 ملليلتر MACS عازلة. قم على الفور بإخراج الخلايا الإيجابية CD133 المسماة عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود. لزيادة نقاء الكسر السالب ، قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود LS متوازن جديد واجمع الكسر السالب للنفايات السائلة CD133.

• Melanoma - A type of skin cancer with self-renewing tumor initiation capabilities.
• CD133 - A marker in metastatic melanoma stem cells that enables their isolation.
• MACS Separator - A device used for magnetic cell sorting isolation.
• Quantum 263 medium - A culture medium used for melanoma cell cultivation.
• Anti-Biotin Microbeads - Tiny magnetic particles used to label cells for isolation.

• Understanding Melanoma - It's a skin cancer with self-renewable tumor cells (e.g., MACS separator).
• Principles of Magnetic Cell Sorting - The process of sorting cells based on their magnetic properties (e.g., CD133).
• Role of Microbeads - They assist in segregating cells during magnetic isolation (e.g., Anti-Biotin Microbeads).
• Isolation of CD133 - The melanoma stem cells are differentiated using MACS separator.

• [Question 1] What is melanoma and how is it connected to CD133 stem cells?
• [Question 2] What role does a MACS separator play in cell isolation?
• [Question 3] How are Anti-Biotin Microbeads used in the magnetic cell isolation process?

• Cell Isolation Techniques - Understanding melanoma therapy (e.g., MACS Separator).
• Medical Industry Impact - Improved cancer treatment methodologies (e.g., CD133).
• Scientific Progression - Better understanding of stem cells can lead to medical advancements.
• Research Developments - Isolation techniques pave way for newer studies.